一种基于碳量子点/二氧化锰纳米片层的原位复合体系及其用于检测谷胱甘肽含量的使用方法

摘要

本发明公开了一种基于碳量子点/二氧化锰纳米片层的原位复合体系及其使用方法，本发明首先利用碳量子点吸附在原位还原高锰酸钾所制得的二氧化锰纳米片层上将碳量子点的荧光完全淬灭，然后通过谷胱甘肽(GSH)与二氧化锰之间的氧化还原反应引起二氧化锰纳米片层的消解并导致碳量子点的释放及其荧光的恢复，基于该原理对GSH待测样品中的GSH含量进行定量分析测定，本发明检测方法精度高，重现性好，且使用的碳材料廉价易得，对环境无污染，生物安全性较好，并且本发明操作简便，实用性较强，灵敏度高，对GSH的选择性较好。

说明书

技术领域

本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种基于碳量子点/二氧化锰纳米片层的原位复合体系及其用于检测谷胱甘肽含量的使用方法。

背景技术

GSH包括谷氨酸，半胱氨酸以及甘氨酸，它们是生物体内重要的肽类化合物，在新陈代谢过程中起着至关重要的作用。GSH在细胞内的含量与人类的很多疾病如艾滋病，帕金森综合症，糖尿病，老年痴呆症，心血管疾病等密切相关。因此，GSH含量的检测为近年来研究的热点。

目前常用的GSH含量的检测方法有高效液相色谱法(HPLC)，表面增强拉曼光谱法(SERS)，毛细管电泳法，酶联免疫吸附测定(ELISA)法等。这些检测方法操作繁琐费时，成本较高，且需要专业的人员操作。

随着纳米技术的快速发展，基于荧光纳米材料的检测方法不断出现。但是，荧光纳米材料种类较多，如量子点，银纳米团簇，金纳米团簇，铜纳米团簇，碳量子点，上转换纳米颗粒等。然而，使用含有重金属离子的量子点检测体系时，需要考虑其生物安全性和环境友好性，而且金银纳米团簇的成本较高，不适合做大规模推广。上转换纳 米粒子由于需要红外光的激发，检测过程产生热量较多，可能会对生物样本造成破坏。相比之下，碳量子点具有较高的荧光量子产率、较强的抗光漂白性能、环境友好以及无毒无害等优异理化性质，近年来成为生物成像、生化分析、微量分析等荧光检测领域的研究热点，基于碳量子点的荧光检测受到了越来越广泛的关注。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种操作简便，成本低，方法精度高、灵敏度高，绿色、生物安全性好基于碳量子点/二氧化锰纳米片层复合体系分析检测GSH含量的生物传感方法。

为实现上述发明目的，本发明基于碳量子点的荧光可以被二氧化锰纳米片层猝灭的可逆性以及氧化还原反应的原理，以加入检测液中的GSH标准浓度和恢复的荧光值为基础，通过检测荧光信号建立标准曲线，实现对待测样品中GSH含量的测定。本发明所采用的具体技术方案为：一种基于碳量子点/二氧化锰纳米片层原位复合体系，它的制备包括以下步骤：

步骤一、将碳量子点加入2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲体系中，制备一定浓度的碳量子点溶液；

步骤二、向上述碳量子点溶液中加入高锰酸钾水溶液，充分混合后，向混合溶液中加入去离子水制备反应混合液；

步骤三、将上述反应混合液超声，直到有棕色的沉淀生成，离心纯化后得到碳量子点/二氧化锰片层纳米复合物，然后将其分散到去离子水中，得到碳量子点/二氧化锰片层纳米复合体系。

上述的碳量子点溶液的浓度为0.1～5mg/ml。

上述的高锰酸钾水溶液的浓度为0.1～20mM。

上述的高锰酸钾水溶液的用量为加入的高锰酸钾水溶液的量可以使碳量子点的荧光完全猝灭。

上述的超声时间为10～60分钟。

按照上述方法制备得到的基于碳量子点/二氧化锰纳米片层原位复合体系，其特征在于：它应用于检测谷胱甘肽含量的方法包括如下步骤：

步骤一、将通过上述步骤制备得到的基于碳量子点/二氧化锰纳米片层原位复合体系用作检测液，并将其和一定浓度梯度的谷胱甘肽标准溶液混合，测定GSH浓度为0μM时检测液的荧光值F₀以及不同GSH浓度下检测体系的荧光值F，计算出相对荧光恢复值F-F₀/F₀，然后以GSH标准溶液的浓度为横坐标、相对荧光恢复值F-F₀/F₀为纵坐标确定标准液中谷胱甘肽浓度和相对荧光恢复强度的关系；

步骤二、将检测液和未知浓度的谷胱甘肽待测样品混合，记录荧光恢复值；

步骤三、根据恢复的荧光值计算待测样品中谷胱甘肽的含量。

相对于现有技术，本发明所产生有益效果为：1、本发明方法克服了传统检测方法的不足，检测方法精度高，重现性好，且使用的碳材料廉价易得，对环境无污染，生物安全性较好；

2、本发明方法操作简单便捷，对仪器的要求不高，适应性较强，灵敏度高，对GSH的选择性较好。

为考察本发明方法对GSH的选择性，设计了一系列干扰性实验。在这些干扰性实验中，所用的GSH标准溶液浓度为10μM，100μM。具体方案如下：于一定浓度的检测液里加入干扰离子，其中干扰离子的浓度均1mM，混合均匀后测荧光的恢复强度。不加谷胱甘肽的检测液荧光强度为基准值F₀，加入其他干扰离子后的荧光恢复值为F，以F-F₀比上F₀作为纵坐标，绘制各种干扰离子和缓冲体系的荧光强度恢复柱状图(见图2)。按照此方法，同时也考察了不同缓冲体系、BSA及多种氨基酸等对检测方法的干扰程度(见图2)。如图2所示，结果表明该检测方法对GSH的选择性较好。

另外，为了验证本发明方法的适应性和可靠性，设计并进行了实际样品的加标回收实验。加标回收实验是指在待测的样品中加入一定量的标准样品，然后用本检测方法检测样品的含量，达到对本实验方法的验证，是对本方法的适应性和可靠性的评价，具体实施如下：

将商品化的人血清用超纯水稀释500倍，得到的被检测液中含有GSH的含量是1.304μM，将同等浓度的检测液均分为三份，各加入 等体积3.0μM，4.0μM，5.0μM的GSH标准溶液，按本发明提供的方法进行检测，结果见下表，

由检测结果可知，本发明提供的方法具有较好的重现性和准确性，适合检测生物样品中的GSH含量。

附图说明

图1为本发明中体系相对荧光强度与GSH标准溶液浓度的线性关系图。

图2为不同干扰成分对本发明检测方法选择性考察的实验结果。

实施例

下面结合实施例对本发明做进一步详细说明，但是本发明的保护范围并不局限于此。

实施例1

步骤一、将碳量子点加入2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲体系中，制备浓度为0.1mg/ml的碳量子点溶液；

步骤二、向上述碳量子点溶液60μL中加入浓度为0.2mM高锰酸钾水溶液5mL，充分混合后，向混合溶液中加入去离子水3mL制备反应混合液；

步骤三、将上述反应混合液超声20分钟，直到有棕色的沉淀生成，离心纯化后得到碳量子点/二氧化锰片层纳米复合物，然后将其 分散到8mL去离子水中，得到碳量子点/二氧化锰片层纳米复合体系。

步骤四、将上述得到的基于碳量子点/二氧化锰纳米片层原位复合体系用作检测液，并将其和浓度分别为0μM，1μM，1.5μM，5μM，7.5μM，10μM的谷胱甘肽标准溶液混合，测定GSH浓度为0μM时检测液的荧光值F₀以及其他GSH浓度下检测体系的荧光值F，计算出相对荧光恢复值F-F₀/F₀，然后以GSH标准溶液的浓度为横坐标、相对荧光恢复值F-F₀/F₀为纵坐标确定标准液中谷胱甘肽浓度和相对荧光恢复强度的关系，如图1所示。由图1可知GSH溶液和相对荧光强度有较好的线性关系，此线性关系为Y＝0.0607X+0.1004，R²＝0.9967。

步骤五、将检测液和某一已知浓度的GSH待测样品(4.500μM)混合，根据恢复的相对荧光值计算样品中的GSH含量为4.523μM。结果进一步表明本发明的检测方法对GSH检测的精度高、准确性和重现性好。

实施例2

步骤一、将碳量子点加入2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲体系中，制备浓度为0.5mg/ml的碳量子点溶液；

步骤二、向上述碳量子点溶液18μL中加入浓度为0.5mM高锰酸钾水溶液3mL，充分混合后，向混合溶液中加入去离子水4.5mL制备反应混合液；

步骤三、将上述反应混合液超声25分钟，直到有棕色的沉淀生成，离心纯化后得到碳量子点/二氧化锰片层纳米复合物，然后将其 分散到12mL去离子水中，得到碳量子点/二氧化锰片层纳米复合体系。

步骤四、将上述得到的基于碳量子点/二氧化锰纳米片层原位复合体系用作检测液，并将其和浓度分别为0μM，1μM，1.5μM，5μM，7.5μM，10μM的谷胱甘肽标准溶液混合，测定GSH浓度为0μM时检测液的荧光值F₀以及其他GSH浓度下检测体系的荧光值F，计算出相对荧光恢复值F-F₀/F₀，然后以GSH标准溶液的浓度为横坐标、相对荧光恢复值F-F₀/F₀为纵坐标确定标准液中谷胱甘肽浓度和相对荧光恢复强度的关系。结果表明，GSH溶液浓度和相对荧光强度有较好的线性关系，与实施例1一致。

步骤五、将检测液和某一已知浓度的GSH(5.100μM)待测样品混合，记录荧光恢复值为1241，根据恢复的相对荧光值计算样品中的GSH含量为5.102μM。

该结果进一步表明本发明的检测方法对GSH检测的精度高、准确性和重现性好。

实施例3

步骤一、将碳量子点加入2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲体系中，制备浓度为1.0mg/ml的碳量子点溶液；

步骤二、向上述碳量子点溶液12μL中加入浓度为1.0mM高锰酸钾水溶液2mL，充分混合后，向混合溶液中加入去离子水6mL制备反应混合液；

步骤三、将上述反应混合液超声35分钟，直到有棕色的沉淀生 成，离心纯化后得到碳量子点/二氧化锰片层纳米复合物，然后将其分散到16mL去离子水中，得到碳量子点/二氧化锰片层纳米复合体系。

步骤四、将上述得到的基于碳量子点/二氧化锰纳米片层原位复合体系用作检测液，并将其和浓度分别为0μM，1μM，1.5μM，5μM，7.5μM，10μM的谷胱甘肽标准溶液混合，测定GSH浓度为0μM时检测液的荧光值F₀以及其他GSH浓度下检测体系的荧光值F，计算出相对荧光恢复值F-F₀/F₀，然后以GSH标准溶液的浓度为横坐标、相对荧光恢复值F-F₀/F₀为纵坐标确定标准液中谷胱甘肽浓度和相对荧光恢复强度的关系。结果表明，GSH溶液浓度和相对荧光强度有较好的线性关系，与实施例1一致。

步骤五、将检测液和某一已知浓度的GSH待测样品(5.250μM)混合，记录荧光恢复值为1247，根据恢复的相对荧光值计算样品中的GSH含量为5.232μM。

结果进一步表明本发明的检测方法对GSH检测的精度高、准确性和重现性好。

实施例4

步骤一、将碳量子点加入2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲体系中，制备浓度为1.5mg/ml的碳量子点溶液；

步骤二、向上述碳量子点溶液10μL中加入浓度为2.0mM高锰酸钾水溶液1.25mL，充分混合后，向混合溶液中加入去离子水6mL制备反应混合液；

步骤三、将上述反应混合液超声40分钟，直到有棕色的沉淀生成，离心纯化后得到碳量子点/二氧化锰片层纳米复合物，然后将其分散到20mL去离子水中，得到碳量子点/二氧化锰片层纳米复合体系。

步骤四、将上述得到的基于碳量子点/二氧化锰纳米片层原位复合体系用作检测液，并将其和浓度分别为0μM，1μM，1.5μM，5μM，7.5μM，10μM的谷胱甘肽标准溶液混合，测定GSH浓度为0μM时检测液的荧光值F₀以及其他GSH浓度下检测体系的荧光值F，计算出相对荧光恢复值F-F₀/F₀，然后以GSH标准溶液的浓度为横坐标、相对荧光恢复值F-F₀/F₀为纵坐标确定标准液中谷胱甘肽浓度和相对荧光恢复强度的关系。结果表明，GSH溶液浓度和相对荧光强度有较好的线性关系，与实施例1一致。

步骤五、将检测液和某一已知浓度的GSH待测样品(6.300μM)混合，记录荧光恢复值为1306，根据恢复的相对荧光值计算样品中的GSH含量为6.328μM。

结果进一步表明本发明的检测方法对GSH检测的精度高、准确性和重现性好。