一种基于银纳米粒子四面体拉曼多重检测的方法

摘要

一种基于银纳米粒子四面体拉曼多重检测的方法，属于分析化学技术领域。本发明利用DNA介导纳米粒子自组装技术成功组装得到银纳米粒子四面体，利用四面体的特殊空间构型，通过在银纳米粒子四面体中引入三段含有待测物SDM、AFM1、OTA核酸适配体片段的DNA和三种信标分子，成功构建了基于银纳米粒子四面体的拉曼多重检测体系，当存在待测物时，四面体的空间构型发生改变引起拉曼信号的变化，进而进行检测；三种信标分子拉曼信号的变化对应于三种目标物的浓度，从而实现了对三种目标物SDM，AFM1和OTA的同时检测。该方法具有极高的灵敏度与良好的特异性，并且避免了纳米粒子无序聚集对检测结果的影响，更加有利于拉曼传感检测技术在实际中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于银纳米粒子四面体拉曼多重检测的方法，属于分析化学技术领域。

背景技术

1928 年，印度科学家拉曼首次发现了拉曼散射现象，即当一个已知能量或波长、频率的光子和一个分子相互作用时，引起分子振动和能量损失的过程。随后拉曼先生发明了第一台拉曼光谱仪，并因此获得诺贝尔物理学奖。但是由于拉曼信号比较弱，该技术一直没有得到广泛的应用。后来随着激光器、CCD 和滤光片的发明使得拉曼光谱仪的性能大大改进，因而才有了后来拉曼光谱仪大范围的普及和应用。表面增强拉曼散射（SERS）是在原有拉曼散射的基础之上，利用贵金属纳米材料（如金、银等）表面的电磁场增强效应，使得吸附在其表面的分子产生拉曼增强效应的现象。一般情况下，SERS 可以将拉曼分子的拉曼信号增强 10⁶ 倍，从而实现拉曼光谱的单个分子检测。另外，由于 SERS 检测能很好的保持样品的原有状态、不受样品机制和背地的影响、图谱峰宽较窄、具有独特的分子指纹图谱、可用以高温、高压环境等优点，目前已广泛用于制药、毒品鉴别、生物医学、食品危害因子检测等领域。

磺胺二甲氧嘧啶（SDM）是一类人工合成广谱抑菌剂药物，添加在饲料中可以增肥家畜，预防和治疗细菌性疾病。这种药物容易残留在动物体内并对人体健康造成严重的影响，如损害脑神经系统，造成溶血性贫血，过敏反应，引发甲状腺癌等。鉴于此，很多国家对动物源性食品中 SDM 的含量做出规定，中国的限量是 100mg/mL。赭曲霉毒素 A(OTA)是曲霉菌属和青霉菌属的某些产毒菌株的次级代谢产物，在全球范围内对农作物的污染都比较严重，是一种强烈的肾毒素和肝毒素，还具有免疫抑制性，直接危害人类健康，引起 DNA 的损伤，有致畸、致癌和致突变的作用。黄曲霉毒素M1（AFM1）属于黄曲霉毒素一类结构相似的化合物中的一种，在湿热地区食品和饲料中出现黄曲霉毒素的机率最高。黄曲霉毒素M1危害主要表现在致癌性和致突变性，对人及动物肝脏组织有破坏作用，可导致肝癌甚至死亡。

发明内容

本发明的目的是构建一种银纳米粒子四面体，并应用于磺胺二甲氧嘧啶（SDM）及黄曲霉毒素M1（AFM1）、赭曲霉毒素A（OTA）等的多重拉曼光谱检测。

本发明的技术方案：一种基于银纳米粒子四面体拉曼多重检测的方法，利用含有待测物SDM，AFM1，OTA核酸适配体片段的DNA组装得到银纳米粒子四面体，当存在待测物时，四面体的空间构型发生改变引起拉曼信号的变化，进而进行检测；工艺步骤为：

（1）10nm粒径银纳米粒子（AgNP）合成

采用硼氢化钠还原硝酸银法合成粒径为10nm的银纳米粒子。

（2）银纳米粒子修饰DNA

上述合成的银纳米粒子和巯基修饰的 DNA（DNA1，DNA2， DNA3，DNA4） 进行偶联形成AgNP-DNA1，AgNP-DNA2，AgNP-DNA3，AgNP-DNA4复合体。

（3）拉曼信标分子的修饰

        将三种拉曼信标分子4-氨基苯硫酚（4-ATP）、4-硝基苯硫醇（NTP）、4-甲氧基苄硫醇（MATT）分别对应修饰到AgNP-DNA1、AgNP-DNA2、AgNP-DNA3表面得到AgNP-DNA1-ATP，AgNP-DNA2-NTP，AgNP-DNA3-MATT。

（4）银纳米粒子四面体的组装

将上述制备的AgNP-DNA1-ATP，AgNP-DNA2-NTP，AgNP-DNA3-MATT，AgNP-DNA4混合，利用碱基互补配对杂交得到银纳米粒子四面体。

表1检测目标物核酸适配体的名称和序列

表2用于构建银纳米粒子四面体的核酸序列。

（5）基于银纳米粒子四面体拉曼传感器的构建与应用

向步骤（4）制备出的银纳米粒子四面体体系中加入一系列不同浓度的SDM、AFM1、OTA标准溶液，分别测定其拉曼信号，根据三种不同信标的拉曼信号强度与待测物浓度建立标准曲线。

具体为：

（1）10nm粒径银纳米粒子（AgNP）合成

取一洁净的锥形瓶置于冰浴中，依次加入20mL超纯水，5mL质量分数为1%的聚乙烯吡咯烷酮和0.6mL 0.01mol/L的硼氢化钠水溶液。然后将5mL质量分数为1%的聚乙烯吡咯烷酮和5mL质量分数为1%的硝酸银水溶液同时以30mL/h的速度加入到锥形瓶中，边加入边搅拌，溶液由无色变成黄色。所得的银纳米粒子直径为10nm。

（2）银纳米粒子修饰DNA

取 30μL  20nM  上述合成的银纳米粒子AgNP于 PCR 管中，加入 1μL  10μM 的 DNA1 混匀后，依次向体系中加入  5μL  5×tris- 硼酸缓冲液和 1.25μL 2mol/L NaCl 溶液，室温振摇反应 12h，13000r/min离心 10min，去除上清液，加超纯水至原体积，得AgNP-DNA1。AgNP-DNA2，AgNP-DNA3，AgNP-DNA4复合体的制备方法与AgNP-DNA1类似。

（3）拉曼信标分子的修饰

将三种拉曼信标分子4-氨基苯硫酚（4-ATP）、4-硝基苯硫醇（NTP）、4-甲氧基苄硫醇（MATT）分别对应加入到AgNP-DNA1、AgNP-DNA2、AgNP-DNA3体系中，溶液中拉曼信标分子的终浓度均为 3 μM，信标分子加入到体系中反应过夜，各自以 13000 r/min离心 10  min，去除上清液，再向体系中加入 20 mM  Tris-HCl缓冲液恢复到原体积。制备得到AgNP-DNA1-ATP，AgNP-DNA2-NTP，AgNP-DNA3-MATT复合体。

（4）银纳米粒子四面体的组装

将上述制备的AgNP-DNA1-ATP，AgNP-DNA2-NTP，AgNP-DNA3-MATT，AgNP-DNA4各取 100 μL 于 1.5 mL 离心管中混合均匀，加入 4 μL 5M NaCl 溶液，震荡混匀，90℃水浴 5 min，再在水蒸气中缓慢降到室温，即制备得到银纳米粒子四面体。

（5）基于银纳米粒子四面体拉曼传感器的构建与应用

对于 SDM、AFM1、OTA的同时检测，三种物质按照先后顺序逐个加入到体系中，每种物质中间间隔 30 min。SDM的添加浓度依次为 0，0.001，0.005，0.01，0.05，0.1，0.5 fM；AFM1的添加浓度依次为 0，0.1，0.5，1，5，10，50  fM；OTA的添加浓度依次为 0，0.01，0.05，0.1，0.5，1，5 fM。三种物质全部加入并反应结束后测体系的拉曼光谱，分别根据 4-ATP，NTP 及 MATT 的拉曼信号的强度建立 SDM、AFM1、OTA的浓度标准曲线。拉曼光谱测试时间为 20 s，激发波长为 633 nm。

一种通用型基于银纳米粒子四面体拉曼多重检测的方法，通过对银纳米粒子四面体制备过程中使用的核酸适配体序列的改变，即可制备得到对应待测物的拉曼多重检测传感器。

本发明的有益效果：首先，银纳米粒子的拉曼增强效果比其他贵金属明显，是很好的拉曼基底材料。其次，检测是基于对纳米粒子四面体空间结构的可控调节，在整个检测过程中没有出现纳米粒子的无规则聚集现象，减少了外界环境的干扰；再次，目标物通过与适配体识别引起四面体结构发生变化，具有很好的特异性；最后，四面体具有六个 DNA 边，可用于多个目标物的同时检测，既可以用于小分子的检测，也可以用于蛋白质等大分子的定量检测。

附图说明

图1本发明基于银纳米粒子四面体拉曼检测的原理图。

图2银纳米粒子四面体的：(A) TEM 图，(B)  冷冻电子三维成像图， (C)  空间构型示意图；加入SDM后的银纳米粒子四面体的：(D) TEM 图，(E)  冷冻电子三维成像图， (F)  空间构型示意图。

图3（A）银纳米粒子四面体用于 SDM、AFM1 和 OTA 检测的拉曼指纹图谱；（B）基于银纳米粒子四面体的多重检测体系同时检测SDM、AFM1 和 OTA，其中SDM的浓度依次为0，0.001，0.005，0.01，0.05，0.1，0.5 fM；AFM1的浓度依次为 0，0.1，0.5，1，5，10，50 fM；OTA的浓度依次为 0，0.01，0.05，0.1，0.5，1，5 fM；（C） 从左到右依次为：SDM浓度与拉曼信号强度的标准曲线，AFM1浓度与拉曼信号强度的标准曲线，OTA浓度与拉曼信号强度的标准曲线。

图4基于银纳米粒子四面体检测牛奶中 SDM 的拉曼光谱。

具体实施方式

实施例1

（1） 10nm粒径银纳米粒子（AgNP）合成

取一洁净的锥形瓶置于冰浴中，依次加入20mL超纯水，5mL质量分数为1%的聚乙烯吡咯烷酮和0.6mL 0.01mol/L的硼氢化钠水溶液。然后将5mL质量分数为1%的聚乙烯吡咯烷酮和5mL质量分数为1%的硝酸银水溶液同时以30mL/h的速度加入到锥形瓶中，边加入边搅拌，溶液由无色变成黄色。所得的银纳米粒子直径为10nm。

（2）银纳米粒子修饰DNA

取 30μL  20nM  上述合成的银纳米粒子AgNP于 PCR 管中，加入 1μL  10μM 的 DNA1 混匀后，依次向体系中加入  5μL  5×tris- 硼酸缓冲液和 1.25μL 2mol/L NaCl 溶液，室温振摇反应 12h，13000r/min离心 10min，去除上清液，加超纯水至原体积，得AgNP-DNA1。AgNP-DNA2，AgNP-DNA3，AgNP-DNA4复合体的制备方法与AgNP-DNA1类似。

（3）拉曼信标分子的修饰

        将三种拉曼信标分子4-氨基苯硫酚（4-ATP），4-硝基苯硫醇（NTP）和 4-甲氧基苄硫醇（MATT）分别加入到AgNP-DNA1，AgNP-DNA2，AgNP-DNA3体系中，溶液中拉曼信标分子的终浓度均为 3  uM，信标分子加入到体系中反应过夜，各自以 13000 r/min离心 10  min，去除上清液，再向体系中加入 20 mM  Tris-HCl缓冲液恢复到原体积。制备得到AgNP-DNA1-ATP，AgNP-DNA2-NTP，AgNP-DNA3-MATT复合体。

（4）银纳米粒子四面体的组装

将上述制备的AgNP-DNA1-ATP，AgNP-DNA2-NTP，AgNP-DNA3-MATT，AgNP-DNA4各取 100 uL 于 1.5 mL 离心管中混合均匀，加入 4μL 5M NaCl 溶液，震荡混匀，90℃水浴 5 min，再在水蒸气中缓慢降到室温，即制备得到银纳米粒子四面体。

（5）基于银纳米粒子四面体拉曼传感器的构建与应用

对于 SDM、AFM1、OTA的同时检测，三种物质按照先后顺序逐个加入到体系中，每种物质中间间隔 30 min。SDM的添加浓度依次为 0，0.001，0.005，0.01，0.05，0.1，0.5  fM;  AFM1的添加浓度依次为  0，0.1，0.5，1，5，10，50  fM;  OTA的添加浓度依次为 0，0.01，0.05，0.1，0.5，1，5 fM。三种物质全部加入并反应结束后测体系的拉曼光谱，分别根据 4-ATP，NTP 和 MATT 的拉曼信号的强度建立 SDM、AFM1、OTA的浓度标准曲线。拉曼光谱测试时间为 20 s，激发波长为 633 nm。