一种粒毛盘菌液体发酵产多酚的方法

摘要

本发明属于微生物培养技术领域，公开一种粒毛盘菌液体发酵产多酚的方法，该方法具体步骤如下：从保藏粒毛盘菌CCTCC？No：M？209193的斜面上取菌丝接种于马铃薯葡萄糖固态培养基上进行活化，在28～30℃下培养72～96小时；取1厘米*1厘米菌块接种至装有种子液培养基的三角瓶中，28～30℃振荡培养48～72小时制得种子液；按发酵培养基体积的2-5％将种子液接种于5L机械搅拌发酵罐中进行发酵；所述发酵培养基中各组分的重量百分含量为：甘油1.5～3％，酵母粉0.1～0.5％，余量为水。本发明发酵培养基组成简单，发酵过程中泡沫少，发酵时间短，发酵液中多酚含量高，从而提高了生产效率，降低了生产成本。

说明书

技术领域

本发明属于微生物培养技术领域，涉及一种粒毛盘菌液体发酵产多酚的工艺技术。

背景技术

多酚是含有多个酚羟基化合物的总称，它可分为黄酮类、单宁类、酚酸类及花色苷类等。多酚物质因具有抗氧化、抗辐射、抗肿瘤、降血压、降血糖等生理活性而受到广泛重视。目前活性多酚类物质主要是通过从植物中提取和利用真菌代谢生产，从植物中提取技术比较成熟，但在批量生产时成本较高，提取率较低，如中国专利申请号201310504273.5和201410179149.0分别公开一种竹笋中提取多酚和从柚子皮中提取多酚。

真菌代谢生产多酚报道较少，如朱金卫利用桦褐孔菌液体深层发酵来生产多酚，其培养基重量百分含量组成为:玉米粉3.5，玉米秸秆3.0，蛋白胨0.3，KH₂PO₄ 0.1，ZnSO₄.2H₂O 0.001，K₂HPO₄0.04，FeSO₄.7H₂O 0.005，MgSO₄.7H₂O 0.05，CuSO₄.5H₂O 0.002,CoCl₂ 0.001，MnSO₄.H2O 0.008，pH 6.0，发酵液中多酚含量在发酵216小时时达到最大，为0.1357mg/mL(朱金卫，桦褐孔菌多酚的液体深层发酵制备及抗氧化活性[D],杭州：浙江理工大学硕士学位论文，2010)。该法生产多酚的生产周期较长，且发酵液中多酚含量低。桦褐孔菌属于白腐真菌，能够降解木质纤维素而粒毛盘菌不能够利用木质纤维素。钱梅双利用粒毛盘菌发酵生产多酚，其培养基重量百分含量组成为:蔗糖2.0，蛋白胨0.5，氯化镁0.081，酪氨酸0.001，硝普钠0.003，pH6，胞外多酚产量在发酵192小时时达 到最大，为0.148mg/ml(钱梅双，粒毛盘菌多酚发酵条件、理化特征及生物活性研究[D]，合肥：合肥工业大学硕士学位论文，2013)。这种培养基的缺点是多酚产量较低。本发明提供一种新的技术方案。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种提高产品质量，降低生产成本的粒毛盘菌液体发酵产多酚的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种粒毛盘菌液体发酵产多酚的方法，该方法具体步骤如下：

(1)、从保藏粒毛盘菌CCTCC No：M 209193的斜面上取菌丝接种于马铃薯葡萄糖固态培养基上；

(2)、取1厘米*1厘米菌块接种至装有种子液培养基的三角瓶中；

(3)、按发酵培养基体积的2-5％将种子液接种于装有发酵培养基的5L机械搅拌发酵罐；

所述的发酵培养基中各组分重量百分含量为：甘油1.5～3％，酵母粉0.1～0.5％，余量为水。

优选地，步骤(1)所述的菌丝在马铃薯葡萄糖固态培养基上，在28～30℃下活化培养72～96小时。

优选地，步骤(2)所述的菌块在种子液培养基中，在28～30℃振荡培养48～72小时。

优选地，步骤(3)所述的发酵罐中发酵培养基的发酵条件为：28～30℃下，转速为180～250r/min，通气量为2～3L/min，培养120～144小时。

优选地，步骤(2)所述的种子液培养基中各组分重量百分含量为：甘油2～4％，酵母粉0.5～1％，余量为水。

本发明的有益效果：本发明培养基组成简单，发酵过程中泡沫少，多酚含量高，发酵时间短，从而提高了生产效率和产品率，降低了生产成本。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做更详细的描述，这些实施例仅仅是对本发明最佳实施方式的描述，并不对本发明的保护范围有限制。

实施例1

从保藏粒毛盘菌CCTCC No：M 209193的斜面上用接种铲将菌丝接种于马铃薯葡萄糖固态培养基上，在30℃恒温培养72小时，取1厘米*1厘米菌块接种至装有100mL种子液培养基(组成为甘油2％，酵母粉0.6％)的250mL三角瓶中，30℃，150r/min下振荡培养48小时。将100mL种子液接种于装有4L发酵培养基的5L机械搅拌发酵罐(发酵培养基组成：甘油1.5％，酵母粉0.2％，余量为水，pH自然)，28～30℃，200r/min，通气量2.5L/min，培养132小时，发酵液中多酚含量为0.7963mg/ml(福林酚法，以没食子酸折算)。

实施例2

从保藏粒毛盘菌CCTCC No：M 209193的斜面上用接种环挑取一环菌丝接种于马铃薯葡萄糖固态培养基上，30℃下培养96小时。取1厘米*1厘米菌块接种至装有200mL种子液培养基(组成为甘油2％，酵母粉0.8％)的500mL三角瓶中，30℃，150r/min下振荡培养72小时。将200mL种子液接种于装有4L发酵培养基的5L机械搅拌发酵罐(发酵培养基组成：甘油2％，酵母粉0.5％，余量为水，pH自然)，28～30℃，230r/min，通气量3.0L/min，培养144小时，发酵液中多酚含量为0.7663mg/ml(福林酚法，以没食子酸折算)。

实施例3

从保藏粒毛盘菌CCTCC No：M 209193的斜面上用接种铲将菌丝接种于马铃 薯葡萄糖固态培养基上，28℃下培养72小时，取1厘米*1厘米菌块接种至装有150mL种子液培养基(组成为甘油2％，酵母粉0.5％)的500mL三角瓶中，30℃，150r/min下振荡培养48小时。将150mL种子液接种于装有4L发酵培养基的5L机械搅拌发酵罐(发酵培养基组成：甘油3％，酵母粉0.1％，4L水，pH自然)，28～30℃，180r/min，通气量2.2L/min，培养120小时，发酵液中多酚含量为0.8573mg/ml(福林酚法，以没食子酸折算)。

对比实施例 

从保藏粒毛盘菌CCTCC No：M 209193的斜面上用接种铲将菌丝接种于马铃薯葡萄糖固态培养基上，30℃下培养72小时，取1厘米*1厘米菌块接种至装有150mL种子液培养基(组成为甘油2％，酵母粉0.5％)的500mL三角瓶中，30℃，150r/min下振荡培养48小时。将150mL种子液接种于装有4L发酵培养基的5L机械搅拌发酵罐(发酵培养基组成：甘油3％，酵母粉1％，4L水，pH自然)，28～30℃，180r/min，通气量2.2L/min，培养120小时，发酵液中多酚含量为0.5265mg/ml(福林酚法，以没食子酸折算)。

上述粒毛盘菌CCTCC No：M 209193，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学生命科学学院，保藏日期2009年9月3日，保藏编号CCTCC No：M 209193，分类命名：粒毛盘菌(Lachnum sp.)。

通过研究发现，传统培养基中添加的生长因子如酪氨酸、无机盐等，可通过改变培养及组成而不需另外添加生长因子。本发明所采用的粒毛盘菌CCTCC No：M 209193发酵培养基组成为甘油、酵母粉，不需要添加其他生长因子。

甘油作为生物柴油生产过程的副产物，价格低廉。我们研究发现粒毛盘菌胞外多酚主要是通过莽草酸途径和聚酮途径合成的，甘油能够促进粒毛盘菌中莽草酸途径和聚酮途径的代谢通量，促进了多酚的合成；另一方面，甘油还能够促进粒毛盘菌代谢产生曲酸，曲酸能够抑制多酚氧化酶的活性，从而减少了多酚向黑色素的转化，提高了多酚的产量。发酵过程中泡沫较少。

粒毛盘菌合成的多酚是次级代谢产物，在营养物质消耗殆尽时才开始合成。 我们研究发现培养基氮源是酵母粉时有利于多酚的合成，添加少量的酵母粉可使粒毛盘菌提前进入次级代谢阶段，发酵时间缩短到120～144小时；少量的酵母粉使得生物量减少，但有利于更多的甘油转化为多酚；低含量的酵母粉减少发酵液中氨基酸浓度，有利于多酚的进一步纯化，降低了生产成本。

本发明的培养基pH约为6.5(灭菌后)，粒毛盘菌在pH4.5～8.0范围内生长良好，因此本培养基在灭菌前无需酸碱调节pH，简化了操作。

本发明培养基中的碳氮比比较合理，前期发酵过程的酸碱度变化不大，发酵后期由于多酚和曲酸的产生使pH值降低，到发酵结束时pH约为4.0～4.5，有利于多酚的形成。

本发明所述的种子液培养基的目的是长菌体，种子培养基换成其他成分发酵产物量影响不大，但可能周期会稍长点。

采用本发明的培养基，使发酵时间缩短到120～144小时，5L发酵罐中多酚含量为0.75～0.90mg/ml(福林～酚法，折算为没食子酸)，提高了产品质量，降低了生产成本。

本发明发酵温度较高，为28～30℃，该温度范围内菌体生长迅速且利于多酚的合成，并缩短了发酵周期。

以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。