来源于大豆的根特异性启动子GmTIPp-1201及其应用

摘要

本发明公开了一种来源于大豆的根特异性启动子GmTIPp-1201及其应用。本发明所提供的启动子为如下中的至少一种：a）至少含有序列表中序列2的第854-2054位核苷酸序列，并且从序列2的第854位开始按照序列2的核苷酸序列向序列2的5′端延长，得到长度为1201至1546bp的任意一个DNA片段；b）与a）限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段；c）在严格条件下与a）或b）限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。本发明所提供的启动子能够有效启动目的基因在根中的特异性表达。本发明为植物在根部的分子改良提供了一种手段，对植株的抗逆研究就有一定意义，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种来源于大豆的根特异性启动子GmTIPp-1201及其应用。

背景技术

启动子是基因的组成部分，控制基因表达的起始和表达程度。在转基因育种中， 外源基因在植物体中的精确调控主要是通过合适的启动子实现的。目前，在基因工程 中广泛使用的是组成型启动子，但是由于组成型启动子驱使目的基因在植物组织中的 表达是恒定和持续的，不受时空和外界因素的限制，会过度消耗细胞内的物质和能量， 产生大量异源蛋白质或代谢产物，破坏了植物原有的生理代谢平衡，导致植物生长异 常甚至死亡。与组成型启动子相比，根特异性启动子它所驱动的外源基因在受体植物 根中表达，克服了组成型启动子由于持续、高效的启动外源基因非特异性表达而造成 的细胞物质的过度消耗。随着转基因植物安全标准的提高，包括所有商业化转基因农 作物在内，要求必须对所用启动子的表达活性、潜在重组能力、对周边环境以及安全 性影响进行详细的研究。

大豆是一种重要的粮油饲兼用作物，在我国大豆产区大多处于干旱、盐碱及高寒 等区域，应用的大豆品种耐逆性不强，严重的旱涝病虫害等非生物和生物逆境胁迫显 著影响大豆产量。目前在转基因大豆中使用的都是CaMV35S启动子，根特异启动子 应用到大豆转基因中，为大豆转基因研究提供更加丰富的启动子元件，同时也为培育 耐旱、耐盐、耐冷等转基因大豆新品种提供一种手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有启动子功能的DNA分子。

本发明所提供的具有启动子功能的DNA分子，来源于豆科大豆属栽培大豆 （Glycine max(L.)Merr.）Williams82，是下述a）-c）中任一DNA片段：

a）至少含有序列表中序列2的第854-2054位核苷酸序列，并且从序列2的第854 位开始按照序列2的核苷酸序列向序列2的5′端延长，得到长度为1201至1546bp的 任意一个DNA片段；

b）与a）限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA片 段；

c）在严格条件下与a）或b）限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA 片段。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2× SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

所述启动子的最后一位核苷酸是序列2的第2054位。

在本发明中，所述具有启动子功能的DNA分子为序列表中序列2的第854-2054 位核苷酸所示的DNA分子，命名为GmTIPp-1201。

其中，序列2由2054个核苷酸组成，为序列1的第1-2054位。

含有所述DNA分子（启动子）的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也 属于本发明的保护范围。

在本发明中，所述重组载体为在pC13P1载体的多克隆位点（如KpnⅠ和PstⅠ） 插入所述DNA分子得到的重组质粒。

所述pC13P1载体是以pCAMBIA1301载体为基础改造得到的环形载体，所述 pC13P1载体上不含有任何启动子的序列，用来满足研究启动子功能的需要。

具体的，所述pC13P1载体的序列如序列表中序列3所示。

所述表达盒可以由具有启动子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子启动表达 的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因 连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。

在本发明的一个实施例中，所述目的基因具体为GUS基因（来源于所述pC13P1 载体）；所述转录终止序列具体为NOS转录终止子（来源于所述pC13P1载体）。

所述DNA分子在植物中启动目的基因表达中的应用也属于本发明的保护范围。

在所述应用中，所述表达为根特异性表达。

进一步，所述根特异性表达为根中高表达，具体为根中的表达量显著高于其他组 织（如叶柄、叶片主脉、花、果荚外壳），在其他组织中表达量极低。

在所述应用中，所述目的基因可为GUS基因。所述植物可为双子叶植物或单子 叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥或大豆。

在本发明的一个实施例中，所述植物具体为拟南芥（Arabidopsis thaliana(L.) Heynh.）Columbia。

另外，扩增所述DNA分子（启动子）的引物对也属于本发明的保护范围。

在本发明中，扩增所述DNA分子（启动子）的引物对为如下：

5'-GGTACCAAAAGAAACATGCTGAT-3'；

5'-CTGCAGTTTGGCACCTCACCTCAC-3'。

实验证明，本发明所提供的GmTIPp-1201启动子能够有效启动目的基因在根中的 特异性表达。本发明为植物在根部的分子改良提供了一种手段，对植株的抗逆研究就 有一定意义，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

附图说明

图1为第一轮PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。箭头所示为目的条带。

图2为第二轮PCR产物GmTIPp-2054的琼脂糖凝胶电泳图。箭头所示为目的条 带。

图3为GmTIPp-1546和GmTIPp-1201启动子的PCR检测结果。其中，泳道M 为DL2000plus的DNA分子量标准；泳道1、2分别为用引物对F-1546/R和F-1201/R 进行PCR扩增所得的PCR产物的电泳图。

图4为重组质粒pMD18-GmTIPp-1546和pMD18-GmTIPp-1201，以及pC13P1载 体的KpnⅠ和PstⅠ双酶切电泳图。其中，泳道M为DL2000plus的DNA分子量标准； 泳道1、2、3分别为pMD18-GmTIPp-1546、pMD18-GmTIPp-1201和pPC13P1。

图5为pC13P1载体的质粒图谱。

图6为pC13（Delta）GUS载体的质粒图谱。

图7为转基因拟南芥T₁代的分子检测结果。其中，A、B分别代表转 pCAM-TIPp-1546、pCAM-TIPp-1201拟南芥植株检测结果。A和B中，泳道M为 DL2000plus的DNA分子量标准；泳道CK+为阳性对照；泳道CK-为阴性对照；其他 泳道分别为不同转基因株系，有目的条带（箭头所示位置）出现的为阳性。

图8为转基因拟南芥T₃代的营养生长阶段不同发育时期GUS染色结果。

图9为转基因拟南芥T₃代的生殖生长阶段不同发育时期GUS染色结果。

图10为转基因拟南芥T₃代的植株根和叶中的GUS活性定量测定结果。其中， WT表示未转基因的野生型拟南芥Columbia；T1546-19、T1546-43和T1546-45是三 株鉴定阳性的转pCAM-TIPp-1546拟南芥植株；T1201-3、T1201-10、T1201-64是三株 鉴定阳性的转pCAM-TIPp-1201拟南芥植株。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中 的引物合成及测序工作均由华大公司完成。

栽培大豆（Glycine max(L.)Merr.）Williams82：记载于“许硕.野生大豆盐胁迫 相关microRNA的功能分析.2011年中国农业科学院硕士论文”一文，由中国农业科 学院作物科学研究所供给。

pC13P1载体和pC13（Delta）GUS载体：均为环形载体，由中国科学院亚热带农 业生态研究所Pedro S.C.F.Rocha研究员提供。pC13P1载体上不含有任何启动子，但 含有GUS报告基因（如图5）；pC13（Delta）GUS载体不含有GUS基因，但含有卡 那霉素抗性和潮霉素抗性（如图6）。所述pC13P1载体的序列如序列表中序列3所示； 所述pC13（Delta）GUS载体的序列如序列表中序列4所示。

拟南芥（Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.）Columbia：记载于“郭晓丽.Columbia 型拟南芥愈伤组织培养研究.河南农业科学,2009年01期”一文，由中国农业科学院 作物科学研究所供给。

根癌农杆菌GV3101：记载于“赵湛,李文生.不同根癌农杆菌菌株类型对木霉菌 遗传转化效率的影响.北方园艺,2006年03期”一文，由中国农业科学院作物科学研 究所供给。

实施例1、GmTIPp全长启动子的克隆及序列测定

以栽培大豆（Glycine max(L.)Merr.）Williams82为材料，采用CTAB法提取大豆 根系基因组DNA。根据大豆基因组数据库查找TIP基因及其上游序列，设计特异引物 上游引物F1和下游引物R1，以提取的总DNA为模板，进行PCR扩增。

F1：5'-TCAGGAGGACGAATAGCCCA-3'（序列1的第1-20位）；

R1：5'-CAACACCAGCGAACACGAAA-3'（序列1的第2145-2163位的反向互补 序列），

反应程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min30s，35个循环；72 ℃延伸10min。

反应结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

结果见图1，其中，泳道M为DL2000plus的DNA分子量标准，泳道1为PCR 产物。用回收试剂盒纯化回收PCR产物，PCR产物回收后与pMD18-T-Simple载体 （TaKaRa，目录号：D103A）连接，连接产物转化E.coli感受态细胞DH5α（TIANGEN， 目录号：CB101），提取质粒，经PCR扩增为阳性的重组质粒送去测序。测序结果表 明，PCR产物为2163bp，如序列1所示，其中包括109bp TIP基因CDS序列（序列 1的第2055-2163位）。

为了得到不含TIP基因CDS序列的启动子片段，从翻译起始密码子ATG开始， 新设计了一条下游引物R2进行第二轮PCR扩增，以第一轮PCR产物（序列1）为模 板，以F1和R2为引物进行第二轮PCR扩增。

F1：5'-TCAGGAGGACGAATAGCCCA-3'（序列2的第1-20位）；

R2：5'-TTTGGCACCTCACCTCAC-3'（序列2的第2037-2054位的反向互补序列）。

反应程序：94℃5min；94℃30s，52℃30s，72℃2min15s，35个循环；72 ℃延伸10min。

反应结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

结果见图2，其中，泳道M为DL2000的DNA分子量标准，泳道1为PCR产物。 用回收试剂盒纯化回收PCR产物，PCR产物回收后与pMD18-T-Simple载体连接，连 接产物转化E.coli感受态细胞DH5α，提取质粒，经PCR扩增为阳性的重组质粒送去 测序。测序结果得到了2054bp的GmTIPp全长启动子序列，如序列2所示，命名为 GmTIPp-2054。将测序正确的重组质粒命名为pMD18-GmTIPp。

实施例2、含有GmTIPp-2054启动子5’缺失片段的系列重组表达载体的构建

一、大豆GmTIPp-2054启动子序列5’缺失序列的获得

本发明的发明人对GmTIPp-2054序列的5’进行了缺失。由于pMD18-T-Simple 载体不带有酶切位点，根据GmTIPp-2054序列（序列2），分别设计了2条带KpnⅠ酶 切位点的上游引物（F-1546、F-1202）和1条带PstⅠ酶切位点的下游引物R，以实施 例1获得的重组质粒pMD18-GmTIPp为模板，分别进行PCR扩增。

引物序列如下：

F-1546：5'-GGTACCGAGTATAAAACCCAAAATC-3'（下划线后的序列为序列2 的第509-527位）；

F-1201：5'-GGTACCAAAAGAAACATGCTGAT-3'（下划线后的序列为序列2的 第854-870位）；

R：5'-CTGCAGTTTGGCACCTCACCTCAC-3'（下划线后的序列为序列2的第 2037-2054位的反向互补序列）。

采用引物对F-1546/R或F-1201/R进行PCR扩增的反应程序均为如下：94℃5 min；94℃30s，54℃30s，72℃2min，35个循环；72℃延伸10min。

反应结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

结果如图3所示。将所得两种PCR产物分别进行测序，结果显示：引物对F-1546/R 所得PCR产物的序列为“GGTACC+序列2的第509-2054位+CTGCAG”；引物对 F-1201/R所得PCR产物的序列为“GGTACC+序列2的第854-2054位+CTGCAG”。

进一步将所得的GmTIPp-2054序列（序列2的第1-2054位）的两个5’缺失序列 命名如下：将序列2的第509-2054位命名为GmTIPp-1546；将序列2的第854-2054 位命名为GmTIPp-1201。将以上两种PCR产物分别与pMD18-T-Simple载体连接，依 据所得重组质粒中外源片段的不同，依次命名为pMD18-GmTIPp-1546和 pMD18-GmTIPp-1201。

二、含有5’缺失片段的系列重组表达载体的构建

将步骤一获得pMD18-GmTIPp-1546和pMD18-GmTIPp-1201分别进行KpnⅠ和 PstⅠ的双酶切，回收酶切产物，将所得两种回收片段分别与经过同样双酶切的pC13P1 载体（质粒图谱如图5所示）的骨架大片段相连（酶切图谱如图4所示），获得两种重 组质粒。将经酶切鉴定正确的质粒送样测序。将经测序表明在pC13P1载体的多克隆 位点KpnⅠ和PstⅠ之间插入序列表中序列2的第509-2054位核苷酸的重组质粒命名 为pCAM-TIPp-1546；将经测序表明在pC13P1载体的多克隆位点KpnⅠ和PstⅠ之间 插入序列表中序列2的第854-2054位核苷酸的重组质粒命名为pCAM-TIPp-1201。

在重组表达载体pCAM-TIPp-1546和pCAM-TIPp-1201中，相应启动子 （GmTIPp-1546和GmTIPp-1201）均位于GUS基因上游，驱动GUS基因的转录，同 时在GUS基因下游均连接有终止其转录的NOS终止子。

实施例3、转GmTIPp-1546、GmTIPp-1201拟南芥的获得及表达特性研究

一、浸花法转化拟南芥及鉴定

YEP液体培养基：溶剂为水，溶质及其浓度如下：5g/L NaCl，5g/L酵母提取物， 10g/L胰蛋白胨；pH7.0。各浓度为相应组分在培养基中的终浓度。

1/2MS固体培养基：溶剂为水，溶质及其浓度如下：2.17g/L MS盐（Phyto Tech, 目录号：M524）、7g/L琼脂、30g/L蔗糖，1ml/L MS有机（Phyto Tech,目录号：M533）， pH5.8。各浓度为相应组分在培养基中的终浓度。

1、用实施例2获得的两种重组质粒pCAM-TIPp-1546、pCAM-TIPp-1201，以及 pC13P1空载体分别转化根癌农杆菌GV3101感受态细胞，得到3种重组农杆菌。将3 种重组农杆菌分别接种于YEP液体培养基（含卡那霉素50mg/L），28℃、220rmp振 荡培养，得到OD600=0.4-0.6的3种重组农杆菌菌液。

2、将pC13（Delta）GUS载体（质粒图谱如图6所示）转化根癌农杆菌GV3101 感受态细胞，得到重组农杆菌。将重组农杆菌接种于YEP液体培养基（含卡那霉素 50mg/L），28℃、220rmp振荡培养，得到OD600=0.4-0.6的重组农杆菌菌液。

3、将步骤1得到的3种重组农杆菌菌液分别与步骤2中的重组农杆菌菌液按体积 比1:1混合，加入0.5%（v/v）silwet L-77，共得到3种农杆菌混合液，用来浸染植株。

4、浸染植株的准备：将拟南芥（Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.）Columbia的种 子在10%（v/v）次氯酸钠的水溶液中消毒15min，用无菌水洗3-4次后，将种子种于 1/2MS固体培养基上，4℃培养3d后，置于22℃培养箱中培养，光照16h/黑暗8h。 生长2周的植株从培养基中移栽到土壤基质中继续生长，生长到开花期的拟南芥用来 浸染。

5、浸染：将上述步骤4中生长到花期的拟南芥植株在步骤3中制备好的3种农杆 菌混合液中浸泡1min，浸染后的植株遮光过夜，浸染第二天后，恢复正常培养，一周 后采用同样方法对植株进行第二次浸染。直至收获T₁代种子。

6、将收获的T₁代种子消毒后，种植于含50mg/L潮霉素的1/2MS培养基上，4 ℃培养3d后，置于22℃培养箱中培养，光照16h/黑暗8h，筛选出能够正常生长的 植株，将生长2周的植株从培养基中移栽到土壤基质中继续生长，收获T₂代种子。同 时提取T₁代植株的基因组DNA，进行PCR检测。具体如下：以基因组DNA为模板， 对于转入pCAM-TIPp-1546的抗性转基因拟南芥，采用引物对F-1546/R进行PCR检 测，得到大小约为1546bp目的条带（序列2的第509-2054位）的拟南芥为阳性。对 于转入pCAM-TIPp-1201的抗性转基因拟南芥，采用引物对F-1201/R进行PCR检测， 得到大小约为1201bp目的条带（序列2的第854-2054位）的拟南芥为阳性。各处理 均同时设置以未转基因的野生型植株基因组DNA代替模板的阴性对照，以及以对应 质粒代替模板的阳性对照。PCR检测结果如图7所示。

7、检测出目的条带的株系，其T₂代种子采用步骤6中同样的方法种植培养，收 获T₃种子，选择T₃代不再分离的纯合株系的种子用来后续的试验。

二、转GmTIPp-1546、GmTIPp-1201拟南芥表达特性的研究

1、营养生长阶段不同发育时期的组织表达特性

取生长1d、3d、7d、20d的T₃代转基因拟南芥植株进行GUS组织染色。同时 以未转基因的野生型拟南芥Columbia和转入pC13P1空载体的拟南芥植株作为对照。 实验重复三次。

GUS组织化学染色参照Jefferson的方法。具体如下：将待染色的组织样品放入检 测液中，37℃温育12-16h。70%，90%乙醇分别浸泡2h后，70%乙醇过夜，以除 去绿色组织中的叶绿素。显微镜下或用肉眼观察供试样品的染色结果，并照相。白色 背景下的蓝色即为GUS表达位点。其中，检测液配方如下：50mmol·L^-1磷酸缓冲液 （配方：4.095g Na₂HPO₄和2.537g NaH₂PO₄定容到1L水溶液中），pH7.0，10mmol·L^-1EDTA，0.1％（w/v）Triton X-100，2mmol·L^-1铁氰化钾，2mmol·L^-1亚铁氰化钾，5 ％（w/v）X-Gluc。各浓度为相应组分在检测液中的终浓度。

结果如图8所示，从图中可以看出，在所有转GmTIPp-1546和GmTIPp-1201拟 南芥植株中，从种子萌发开始，在其不同生长时期，在根和下胚轴中检测到GUS基因 的表达活性（蓝色），在其转基因植株叶片中几乎没有检测到。而作为对照的未转基因 的野生型拟南芥Columbia和转入pC13P1空载体的拟南芥植株均无GUS表达。三次 重复实验结果一致。

2、生殖生长阶段的组织表达特性

将生长2周的T₃转基因拟南芥植株从培养基中移栽到土壤基质中继续生长，在开 花结荚期对其各组织器官（叶、花、果）进行GUS组织染色，方法同步骤1。同时以 未转基因的野生型拟南芥Columbia和转入pC13P1空载体的拟南芥植株作为对照。实 验重复三次。

结果如图9所示，在生殖生长时期，转GmTIPp-1546和GmTIPp-1201拟南芥植 株中，在其叶、花、果中均几乎没有检测到GUS表达活性。而作为对照的未转基因的 野生型拟南芥Columbia和转入pC13P1空载体的拟南芥植株均无GUS表达。三次重 复实验结果一致。

3、GUS活性的测定

分别取生长20d的转基因拟南芥植株的根和叶，每个转基因植株取3个株系，测 定根和叶中的GUS活性。同时以未转基因的野生型拟南芥Columbia（记为WT）和转 入pC13P1空载体的拟南芥植株作为对照。具体如下：

（1）4-甲基伞形酮（4-MU）标准曲线的制作

4-甲基伞形酮（4-MU）标准品溶液的配制：用0.2M Na₂CO₃水溶液分别配制不同 浓度的4-MU标准品溶液，1mM4-MU、10μM4-MU、1μM4-MU、100nM4-MU、50nM 4-MU、10nM4-MU、5nM4-MU。其中，4-MU标准品为sigma公司产品，目录号为 M1381。测定在激发光365nm，发射光455nm下的荧光光度值。根据4-MU标准品 的浓度及对应荧光光度值绘制标准曲线。

（2）待测样品的制备

将取好的根和叶分别放入研钵中（预冷），用1ml的GUS提取液研磨成匀浆，转 入1.5ml的离心管中，15000rpm，4℃，离心10min，收集上清液，得到待测样品，用 于检测。

其中，GUS提取液配方如下：50mM磷酸缓冲液（配方：4.095g Na₂HPO₄和2.537g NaH₂PO₄定容到1L水溶液中），pH7.0，10mM Na₂-EDTA，pH8.0，10mMβ-巯基乙 醇，0.1%（w/v）Triton X-100。各浓度为相应组分在GUS提取液中的终浓度。

（3）GUS活性测定

A.GUS反应

GUS反应液：4.08g4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷 （4-Methylumbellifery-β-D-Glucuronide简称4-MUG）定容到10ml GUS提取液中，用 来进行酶促反应。其中，4-MUG为INALCO公司产品，目录号为1758-1630。

GUS终止反应液：0.2M Na₂CO₃水溶液，用来终止反应。

反应过程：将90μl的GUS反应液加入1.5ml的离心管中，37℃预热，加入10μl 上述步骤（1）中提取好的上清液，37℃反应60min后，加入900μl的GUS终止反应 液。同时，每一个样品有0min反应的对照，测定365nm/455nm荧光光度值。根据 所测荧光光度值及步骤（1）得到的4-甲基伞形酮（4-MU）标准曲线，计算得到的“单 位时间的4-MU浓度变化”。

B.蛋白含量测定

取上述待测样品（提取好的上清液）10μl，加入200μl考马斯亮蓝，室温反应15 min，在酶标仪上测定595nm的吸光值。

牛血清蛋白（BSA）标准溶液（1mg/ml）由Bradford蛋白质定量试剂盒提供 （TIANGEN，目录号PA102）。分别取0、0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5μl BSA 标准溶液，每个标准样用0.15M NaCl水溶液定容到10μl，加入200μl考马斯亮蓝， 室温反应15min，在酶标仪上测定595nm的吸光值。根据标准样品的浓度换算上述 待测样品（提取好的上清液）中的蛋白含量。

C.GUS活性计算

根据A和B的检测结果，计算待测样品的GUS活性，用“nmol/min/mg蛋白” 表示。具体而言，用“单位时间的4-MU浓度变化”除以“待测样品中的蛋白含量”， 求出单位质量的蛋白单位时间的4-MU浓度变化，即为单位时间内的GUS活性。

实验重复三次，结果取平均值。

结果如图10，在所有转GmTIPp-1546和GmTIPp-1201拟南芥植株中，在根中的 GUS表达活性均显著高于叶中，并且在各转基因植株根中都有较强的表达活性。而作 为对照的未转基因的野生型拟南芥Columbia（WT）和转入pC13P1空载体的拟南芥植 株的根和叶中均无GUS表达。