一种酵母筛选培养基及其用途和筛选酵母菌株的方法

摘要

本发明公开了一种酵母筛选培养基，其中，该酵母筛选培养基含有葡萄糖和含乙酸根离子源。本发明还公开了上述酵母筛选培养基在筛选酵母菌株中的用途。此外，本发明还公开了一种筛选酵母菌株的方法，其中，该方法包括：将待筛选的酵母细胞在第一方面的酵母筛选培养基中进行培养。通过上述技术方案，本发明能够筛选得到能耐受多重抑制物而具有高抗逆性的酵母菌株。

说明书

技术领域

本发明涉及一种酵母筛选培养基及其在筛选酵母菌株中的用途和利用 该酵母筛选培养基筛选酵母菌株的方法。

背景技术

由于传统化石能源用量急增，能源紧缺已成为世界性问题，能源多元化 发展和加快可再生能源开发已成为世界各国的研发重点，其中，燃料乙醇的 生产和应用在经济发展和战略安全上显示出重大意义。以燃料乙醇等替代能 源为代表的能源供应多元化战略已成为我国能源政策的重要方向。纤维素是 十分丰富而廉价的生物质原料，可以被降解为可发酵性糖，用于燃料乙醇的 生产。大力发展生物质燃料乙醇作为可再生能源，有助于缓解石油资源短缺， 改善大气环境等问题，在稳定粮食生产、促进农业生产与消费的良性循环和 可持续发展等方面具有积极作用。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为单细胞真核生物，具有易培 养、生长周期短的特点，已广泛应用于异源基因的表达。虽然普通酿酒酵母 能够高效利用葡萄糖产乙醇，但对发酵液中的抑制物和高浓乙醇耐受性 (Almeida J R M et al.,2007)较差，特别是对纤维素水解液中的抑制成分敏 感，使酿酒酵母无法成为木质纤维素乙醇生产的优势菌株。其次，纤维素乙 醇生产中，纤维素原料预处理过程产生和残留的降解物会对后续菌株发酵造 成不同程度的抑制，其中乙酸、糠醛、酚类和SO₄^2-等抑制因子对酵母有较 强毒害作用，会显著抑制细胞的生长及其发酵性能。

目前，在纤维素乙醇生产菌种——酿酒酵母的研究领域，大多集中于将 各种实验室缺陷型菌种为研究对象进行改造，而缺乏能够应用于生产的野生 型酵母模型，能够耐受多重抑制物、具有高抗逆性的酿酒酵母具有更强的实 用性，显然，研究新的能够用于筛选酵母菌株的培养基对筛选获得具有上述 特性的酵母模型极为重要。

发明内容

本发明的目的是克服现有方法筛选得到的酿酒酵母难不能耐受多重抑 制物而抗逆性低的缺陷，提供一种用于筛选且抗逆性高的酵母菌株的酵母筛 选培养基及其在筛选酵母菌株中的用途和利用该酵母筛选培养基筛选酵母 菌株的方法。

本发明的发明人发现，虽然酿酒酵母能够高产乙醇，但是对发酵液中的 抑制物抗性较差，这使得酿酒酵母无法成为木质纤维素乙醇生产的优势菌 株。基于此，本发明的发明人进一步对抑制因子和酿酒酵母的关系进行的研 究，结果发现，采用含有葡萄糖和含乙酸根离子源的培养基进行筛选，得到 的酵母菌株能够在多重抑制物存在下稳定发酵产乙醇。因此，为了实现上述 目的，第一方面，本发明提供了一种酵母筛选培养基，其中，该酵母筛选培 养基含有葡萄糖和含乙酸根离子源。

第二方面，本发明提供了上述第一方面的酵母筛选培养基在筛选酵母菌 株中的用途。

第三方面，本发明提供了一种筛选酵母菌株的方法，其中，该方法包括： 将待筛选的酵母菌株在第一方面的酵母筛选培养基中进行培养。

通过上述技术方案，本发明的酵母筛选培养基能够耐受多重抑制物而具 有高抗逆性的酵母菌株。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描 述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“抗逆性”是指微 生物在偏离其最佳生长条件下的环境中的生长和发酵能力，比如较高或较低 的温度，较高或较低的pH，较高或较低的渗透压，较高的反馈抑制，有毒 物质的存在等环境。

本发明提供的酵母筛选培养基含有葡萄糖和含乙酸根离子源。

本发明中，只要含有葡萄糖和含乙酸根离子源即可实现本发明的目的， 对其含量没有特别的要求。优选地，葡萄糖的含量为5-100g/L，更优选为 10-80g/L。优选地，以乙酸根的含量计，含乙酸根离子源的含量为0.5-60g/L， 更优选为2-40g/L。

本发明中，含乙酸根离子源可以为各种能够提供乙酸根离子的化合物， 如水溶性的乙酸和/或乙酸盐，优选为乙酸、乙酸钠、乙酸钾和乙酸铵中的至 少一种。

根据本发明的一种优选实施方式，所述酵母筛选培养基含有1-5g/L的乙 酸、20-40g/L的NH₄Ac、20-40g/L的NaAc和5-40g/L的KAc中的至少一种。 根据本发明更优选的实施方式，所述酵母筛选培养基含有1-3g/L的乙酸、 20-40g/L的NH₄Ac、30-40g/L的NaAc和10-30g/L的KAc中的至少一种。

本发明中，除了葡萄糖和含乙酸根离子源以外，所述酵母筛选培养基优 选还含有氯化物(可以为氯化钠、氯化钾和氯化铵中的至少一种)、硫酸盐 (可以为硫酸钠和/或硫酸钾)、碳原子数为2-8的醛(如糠醛)和碳原子数 为6-16的酚(如苯酚)中的至少一种。更优选地，所述酵母筛选培养基还 含有25-95g/L(最优选为20-60g/L)的氯化物、0.5-10g/L(最优选为4-6g/L) 的硫酸盐、0.1-1g/L(最优选为0.1-0.5g/L)的碳原子数为2-8的醛和0.1-1g/L (最优选为0.1-0.5g/L)的碳原子数为6-16的酚中的至少一种。

为了获得抗逆性更佳的酵母菌株，在本发明优选的实施方式中，所述酵 母筛选培养基还含有1-6g/L的Na₂SO₄、20-60g/L的NaCl、10-30g/L的KCl 和0.1-0.5g/L的糠醛中的至少一种。最优选地，所述酵母筛选培养基还含有 4-6g/L的Na₂SO₄、35-40g/L的NaCl和20-30g/L的KCl中的一种或两种；或 者，所述酵母筛选培养基还含有0.15-0.3g/L的糠醛。

本发明中，所述酵母筛选培养基还可以含有蛋白胨和酵母抽提物，为菌 株提供氮源和生长因子等。其中，蛋白胨的含量优选为5-20g/L，酵母抽提 物的含量优选为2-8g/L。

根据本发明的一种优选实施方式，本发明的酵母筛选培养基含有A组分 和B组分，其中，所述A组分为10-80g/L的葡萄糖和1-3g/L的乙酸，所述 B组分为4-6g/L的Na₂SO₄、35-40g/L的NaCl、20-30g/L的KCl、20-40g/L 的NH₄Ac、30-40g/L的NaAc和10-30g/L的KAc中的一种或两种。

本发明还提供了上述酵母筛选培养基在筛选酵母菌株中的用途。本发明 的酵母筛选培养基尤其适用于筛选具有高抗逆性的酿酒酵母。

此外，本发明还提供了一种筛选酵母菌株的方法，其中，该方法包括： 将待筛选的酵母菌株在上述本发明的酵母筛选培养基中进行培养。

本发明中，只要在本发明的酵母筛选培养基中培养酵母细胞即可实现本 发明的目的，对培养的具体条件没有特别的限定，可以采用本领域常规的培 养条件。优选情况下，所述培养的条件包括：温度为28-33℃，时间为24-72 小时。

本领域技术人员能够理解的是，在培养结束后，可以挑取能够在本发明 的酵母筛选培养基中繁殖的酵母细胞进行扩大培养并进行菌种保存，从而完 成酵母菌株的筛选。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中的实验和检测 方法，如无特殊说明，均为常规方法；所使用仪器，如无特殊说明，均为常 规检测和操作仪器；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂 公司购买得到的；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取 平均值。实施例中采用的培养基等如下：

实施例中使用的酵母菌株——酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) RIPP-0于2013年9月24日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心(缩写为CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中 国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC No.8202。

YEPD培养基：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L。

筛选培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，琼脂粉 20g/L，乙酸3g/L，胁迫因子(Na₂SO₄、NaCl、KCl、NH₄Ac、NaAc等) 5-40g/L，自然pH，倒平板备用。

酸性种子培养基：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，乙 酸1-3g/L，pH5.0。

葡萄糖发酵培养基：葡萄糖80g/L，蛋白胨5g/L，酵母抽提物3g/L， CaCl₂0.25g/L，MgCl₂0.25g/L，KH₂PO₄2.5g/L，pH5.5。根据需要单独加 入乙酸、糠醛等胁迫因子(抑制成分)作为含有抑制成分的葡萄糖发酵培养 基。

发酵液的成分采用高效液相色谱法测定：样品经准确稀释后，先经10000 r/min高速离心10min，上清液经0.45μm微孔滤膜过滤后进样测定。高效液 相色谱条件为：Agilent 1260液相色谱仪，Hi-plex H(8μm，7.7×30μm)色 谱柱，柱温60℃，流动相为乙腈：水(80:20)，流速0.5mL/min。

糖利用率(％)＝(培养基中的糖含量-发酵液中残糖含量)/培养基中糖 含量×100％。

乙醇产量(g/L)定义为每升发酵液中乙醇的含量，其值越高，表明菌 株发酵产乙醇的能力及乙醇耐受性越强。

制备实施例1

(1)委托上海吉玛(GenePharma)公司合成碱基序列如SEQ ID NO： 1所示的突变的核酸lsm6，参照《分子克隆实验指南(第三版)》(Sambrook J,2001)中的方法，将lsm6连接在酿酒酵母质粒pAUR123的BamHI酶切 位点和XhoI酶切位点之间，构成重组表达载体pAUR-lsm6。

(2)挑取酿酒酵母RIPP-0单菌落至酵母菌YEPD培养基中，30℃、180 r/min培养至对数中后期(约16h)，4000r/min离心5min收集细胞，用4℃ 无菌水和pH7.5、10mM的Tris-HCl缓冲液洗涤两次，加入0.6M山梨醇溶 液悬浮细胞，稀释至浓度约为105-106个细胞/mL，取0.2ml菌液，将步骤(1) 获得重组表达载体pAUR-lsm6以电击转化法(参照《分子克隆实验指南(第 三版)》，Sambrook J，2001)转入酿酒酵母RIPP-0宿主菌中，菌液加入1mL YEPD培养基，于30℃下孵育1h。

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实施例1-4

(1)将制备实施例1孵育1h后的菌液均匀涂布于含有3g/L乙酸和30 g/L NH₄Ac、以及3g/L乙酸和40g/L NaAc的两种复合筛选平板上，30℃下 培养60h，得到初筛菌株64株。

(2)将初筛菌株接入酸性种子培养基中，30℃、200r/min培养24h后， 得到生物量正常、镜检正常的菌株35株，离心收集细胞得到菌泥，并将菌 泥接入装有100mL葡萄糖发酵培养基(加入有3g/L的乙酸)的250mL三 角瓶中，初始细胞浓度约为1.0-1.2g/L(细胞干重计)，30℃、120r/min进 行复筛。分析上述菌株的乙酸耐受性和乙醇产量，从中获得9株30℃耐受3 g/L乙酸、乙醇产量大于30g/L的重组菌株。进而分别采用表1所示的4种 酵母筛选培养基1-4对9株菌进行进一步的筛选，获得耐受多重抑制成分而 具有高抗逆性且乙醇产量大于28g/L的酿酒酵母菌株1^#-4^#。

对比例1

按照实施例1的方法进行酵母菌株的筛选，不同的是，步骤(2)采用 的酵母筛选培养基中不含乙酸钾，获得一株乙醇产量大于18g/L的酿酒酵母 菌株D。

表1

测试实施例1

本测试实施例用来说明实施例1-4获得的酵母菌株的葡萄糖发酵性能。

(1)制备种子液

将实施例和对比例获得的酿酒酵母菌株接种于酸性种子培养基(含乙酸 3g/L)，30℃、200r/min振荡培养12h，得到一级种子培养液；

将所述一级种子培养液离心后，细胞转接于种子培养基(不含乙酸)， 30℃、200r/min振荡培养16h，得到种子液。

(2)发酵葡萄糖产乙醇

将步骤(1)得到的种子液离心，收集细胞得到菌泥，将菌泥(以细胞 干重计，控制初始细胞浓度为1.2g/L)接入装有100ml葡萄糖发酵培养基的 250ml的摇瓶中，30℃、120r/min振荡培养，进行厌氧发酵。每次接种3个 平行样，结果取平均值。

上述条件发酵72h后，取5ml发酵液，10000r/min离心10min，上清 液经0.45μm微孔滤膜过滤后进行发酵液成分测定。结果如表2所示。

测试实施例2

本测试实施例用来说明实施例1-4获得的酵母菌株在含有抑制成分(1 g/L乙酸)的葡萄糖发酵培养基中的发酵性能。

(1)制备种子液

同测试实施例1的步骤(1)。

(2)在抑制成分的存在下发酵葡萄糖产乙醇

将步骤(1)得到的种子液离心，收集细胞得到菌泥，将菌泥(以细胞 干重计，控制初始细胞浓度为1.2g/L)接入装有100ml含抑制成分的葡萄糖 发酵培养基的250ml的摇瓶中，其余步骤同测试实施例1的步骤(2)。结果 如表2所示。

测试实施例3

本测试实施例用来说明实施例1-4获得的酵母菌株在含有抑制成分(3 g/L乙酸)的葡萄糖发酵培养基中的发酵性能。

(1)制备种子液

同测试实施例1的步骤(1)。

(2)在抑制成分的存在下发酵葡萄糖产乙醇

将步骤(1)得到的种子液离心，收集细胞得到菌泥，将菌泥(以细胞 干重计，控制初始细胞浓度为1.2g/L)接入装有100ml含抑制成分的葡萄糖 发酵培养基的250ml的摇瓶中，其余步骤同测试实施例1的步骤(2)。结果 如表2所示。

测试实施例4

本测试实施例用来说明实施例1-4获得的酵母菌株在含有抑制成分(1 g/L乙酸和0.2g/L糠醛)的葡萄糖发酵培养基中的发酵性能。

(1)制备种子液

同测试实施例1的步骤(1)。

(2)在抑制成分的存在下发酵葡萄糖产乙醇

将步骤(1)得到的种子液离心，收集细胞得到菌泥，将菌泥(以细胞 干重计，控制初始细胞浓度为1.2g/L)接入装有100ml含抑制成分的葡萄糖 发酵培养基的250ml的摇瓶中，其余步骤同测试实施例1的步骤(2)。结果 如表2所示。

测试实施例5

本测试实施例用来说明实施例1-4获得的酵母菌株在含有抑制成分(1 g/L乙酸和0.3g/L苯酚)的葡萄糖发酵培养基中的发酵性能。

(1)制备种子液

同测试实施例1的步骤(1)。

(2)在抑制成分的存在下发酵葡萄糖产乙醇

将步骤(1)得到的种子液离心，收集细胞得到菌泥，将菌泥(以细胞 干重计，控制初始细胞浓度为1.2g/L)接入装有100ml含抑制成分的葡萄糖 发酵培养基的250ml的摇瓶中，其余步骤同测试实施例1的步骤(2)。结果 如表2所示。

表2

从以上实施例可以看出，使用本发明的酵母筛选培养基能够获得糖利用 率和乙醇产量均较高的酿酒酵母菌株。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实 施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方 案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特 征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必 要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其 不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。