SelK基因表达水平的荧光定量PCR检测试剂盒及方法

摘要

本发明提供了一种SelK基因表达水平的荧光定量PCR检测试剂盒，包括特异性引物和荧光探针；其中，特异性引物包括具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的上游引物F和具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的下游引物R；所述荧光探针具有序列表SEQ.ID.No.3碱基序列，且5’端标记有可淬灭的报告基团，3’标记有BHQ荧光基团。采用本发明中的引物探针可以成功扩增出目的基因，扩增曲线良好，电泳结果显示目的条带清晰；且引物探针反应性能良好，适用于各种人的细胞或组织鉴定SelK的表达。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种SelK基因表达水平的荧光定 量PCR检测试剂盒及方法。

背景技术

硒是一种人类和动物必需的微量元素，与许多疾病密切相关，如癌症、神 经退行性疾病及心血管病等，并在一些重大疾病的防治中起到重要作用。

在现有已发现的25种硒蛋白中，硒蛋白K(SelK)是2003年被Gladyshv实 验室鉴定出的一种新型硒蛋白；SelK是一个含有94个核苷酸，大小为10.6KD 的小分子蛋白。关于SelK的生物学功能尚不明确，近几年发现SelK可能有如 下功能：SelK在心肌细胞中参与应对氧化应激；在人肝癌细胞中参与调节内质 网应激；在受体介导的免疫细胞活化过程中促进钙流；参与内质网相关蛋白降 解；参与调节巨噬细胞表面CD36棕榈酰化；影响泡沫细胞的形成和动脉粥样 化等。因此硒蛋白K的表达水平对于多种生命活动中的症状诊断具有非常重要 的参考价值。

而现有对于SelK表达水平的检测方法中，多通过传统的蛋白质染色印迹或 者荧光定量PCR的方法进行。其中，荧光定量PCR可以快速实时的监测并计 算模版的初始浓度，为研究蛋白在转录水平上的表达提供了便捷的一种方法。 而现有的荧光定量PCR中的染料法是属于非特异性的检测方法，不如荧光探针 法对模版没有特异性；同时，现有荧光探针法的引物和探针多只适用于某一特 定的局部组织或者细胞，在其他的组织细胞检测中经常扩增不到目的条带，使 用中存在不足。

发明内容

本发明实施例的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种适用于各种 人的细胞或组织鉴定SelK基因表达水平的荧光定量PCR检测试剂盒及方法。

为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：

一种SelK基因表达水平的荧光定量PCR检测试剂盒，包括特异性引物和 荧光探针；其中，

所述特异性引物包括具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的上游引物F和具 有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的下游引物R；

所述荧光探针具有序列表SEQ.ID.No.3碱基序列，且5’端标记有可淬灭的 报告基团，3’标记有BHQ荧光基团。

采用本专利中的引物探针可以成功扩增出目的基因，扩增曲线良好，电泳 结果显示目的条带清晰；且引物探针反应性能良好，适用于各种人的细胞或组 织鉴定SelK的表达。

本发明进一步还提出一种采用上述试剂盒进行SelK基因表达水平的荧光 定量PCR检测方法，包括如下步骤：

提取待测样本RNA；

将所述待测样本RNA进行反转录，得到反转录DNA；

以所述反转录DNA为模板，进行实时荧光PCR；

检测PCR过程中的荧光信号；

其中，所述实时荧光PCR过程中采用的引物包括具有序列表SEQ.ID.No.1 碱基序列的上游引物F和具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的下游引物R；

所述实时荧光PCR过程中采用的荧光探针具有序列表SEQ.ID.No.3碱基序 列，且5’端标记有可淬灭的报告基团，3’标记有BHQ荧光基团。

本发明的上述检测方法，实时反映靶基因扩增的过程，并根据内参或外参 直接反映出靶基因的拷贝数；具有灵敏度高、特异性强等优点；并且引物和探 针基于硒蛋白表达的mRNA的特定的区域设计，适用于各种人的细胞或组织鉴 定SelK的表达。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为本发明实施例SelK基因表达水平的荧光定量PCR检测的荧光变化 图；

图2为本发明实施例SelK基因表达水平的荧光定量PCR扩增产物的电泳 结果图；

图3为图1中荧光荧光曲线对应的扩增样本和统计数据图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实 施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅 仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供一种SelK基因表达水平的荧光定量PCR检测方法，包 括如下步骤：

S10，获取待测样本，并提取待测样本的RNA；

S20，以提取的待测样本的RNA模板进行实时荧光RT-PCR；

S30，RT-PCR过程中的荧光信号。

本发明上述过程通过对提取的待测样本的RNA进行扩增，并通过扩增过 程中荧光探针产生的荧光信号变化，从而便可以得知待测样本中SelK基因表达 水平；当然，基于实时荧光RT-PCR进行，重点在于针对目的SelK基因的特异 性引物和荧光探针。其中，本发明的步骤S20中的特异性引物和荧光探针为：

从上表可以看出，本发明的特异性引物包括具有序列表SEQ.ID.No.1碱基 序列的上游引物F和具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的下游引物。而荧光探 针为双标记荧光探针，其基础碱基序列具有序列表SEQ.ID.No.3碱基序列，并 且荧光探针的5’和3’端两端均标记有荧光报告基团。上述特异性引物和探针基 于SELK基因的mRNA设计，其中SELK基因的mRNA信息如下：

靶序列种类 生物种 基因名称 GenBank Accession mRNA human selenoprotein K(SELK) NM_021237.3

其序列具有832bp长度，而上述上游引物F结合位点从mRNA的58位的 碱基开始，上游引物R的结合位点为mRNA的258位的碱基；最终整体扩增的 产物条带为201bp长度。通过对mRNA(NM_021237.)3的特异性位点区域的 考量，结合其保守区域的筛选和特异性表达中序列的特点，设计上述特异性引 物。

并且，更进一步相比现有的荧光探针，本申请中上述荧光探针其结合的位 点为目的mRNA的219位碱基，并且在5’和3’端两端均标记有荧光报告基团， 优选5’采用可淬灭的报告基团，如FAM、HEX、TAMRA、ROX等等，优选采 用FAM荧光报告基团；而3’采用BHQ系列的荧光基团。采用该双标记的荧光 探针，平均15bases的Tm可提高18℃，这样可以使探针的长度缩短，尤其对 AT含量高的序列设计有很大的帮助，并且提高配对与非配对模板间的TM值 差异，使探针的识别灵敏性大大提升。同时，由于在探针的3’端的用不发光的 荧光基团代替作为淬灭基团，并且与报告基因在空间的位置更接近，实验结果 更精确，分辨率更高。而选择BHQ系列的荧光基团进行3’标记，还在于BHQ 系列为非荧光染料，在抑制5’端荧光效果时，其自身不发射荧光，因此，探针 荧光本底低，信噪比差距更大；还能在组合使用之后荧光染料的吸收光谱覆盖 范围则更广，从430nm一直到近红外，可被检测的程度大大提升，可以提升至 更好的检测灵敏度。

在PCR过程中聚合酶在引物的引导下，逐步顺着DNA模板从5’往3’的方 向延伸，遇到探针与模板链杂交的部位会逐步切除探针的碱基，那么在切除的 过程中，碱基上的荧光报告基团随着5’端的碱基切除的同时游离出来，所以产 生的荧光不再能被3’的BHQ分离，因此便能是荧光信号增加。

因此，采用本发明中只能识别目的基因的引物特异性匹配结合所提取的 RNA的反转录DNA模板进行PCR过程中，通过荧光信号的变化情况便可以实 现对待测标样的定性检测。并且采用引物和探针在基因库中进行BLAST比较， 其检测的性能中Tm和GC％含量，可以参见上述表中所示，在性能上相比现有 的其他的探针有明显稳定提升。

本发明在上述方法的基础上，进一步还提出一种SelK基因表达水平的荧光 定量PCR检测试剂盒产品，在试剂盒中包含有上述特异性的引物和荧光探针； 其中，特异性引物包括具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的上游引物F和具有 序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的下游引物R；荧光探针。可淬灭的荧光报告基 团可以从FAM、HEX、TAMRA、ROX等等中进行选择。

在使用中为了更加进一步增加试剂盒的便易性，在试剂盒中还可以添加 RT-PCR反应缓冲液、酶液，以及各种碱基原料等。

为便于结果的对比和验证，试剂盒中还可以提供阳性对照和阴性对照，其 中，阳性对照为能转录出基因库NM_021237.3的表达硒蛋白K的mRNA的 Human cDNA模板；阴性对照采用为RNase free dH2O。通过阳性对照和阴性对 照的结果为待测的标样做参考对比，提升检测结果的准确性。

本发明的上述试剂盒，提供实施本发明上述实时荧光PCR检测方法中所要 具备的特异性引物和探针，是实时反映靶基因扩增的过程，并根据内参或外参 直接反映出靶基因的拷贝数；具有灵敏度高、特异性强等优点；并且引物和探 针基于硒蛋白表达的mRNA的特定的区域设计，适用于各种人的细胞或组织鉴 定SelK的表达。

为使本发明的上述方法过程更加易于理解，以及使本领域技术人员能明确 本方法实施的细节，并且能更加突出检测结果的灵敏性、以及操作的便捷性， 以下通过实施例进行举例说明：

实施例1

在该实施例1中采用能转录出基因库NM_021237.3的表达硒蛋白K的 mRNA的Human cDNA模板(即阳性对照)，进行实时荧光PCR进行标准扩 增，扩增体系为25ul的标准扩增体系，扩增和检测采用ABI-7500荧光PCR仪 进行。扩增中的PCR反应液采用Takara公司的PCR试剂，具体如下：

灭菌超纯水8μl

合计25μl；其中，上述荧光探针5’端标记FAM荧光基团，3’采用BHQ系 列的荧光基团。

PCR过程包括：

在退火阶段，进行荧光信号检测。

当然，在上述标准阳性扩增的情况下可以添加超纯H2O作为阴性对照，同 样均做两个重复对照进行；检测的结果如图1所示。

在PCR完成之后，将PCR产物进行凝胶电泳，电泳的胶片如图2所示。

从检测结果的图1和图2中，对应图1中扩增曲线信息对应的Ct值和曲线 分析如图3，明显可以体现出采用标准阳性样板的human cDNA扩增明显分别 具有荧光信号。并且从图2中，产物的电泳条带中，M带为100bp DNA Laddar  Marker，条带1和条带2分别为2个重复的human cDNAPCR扩增产物，条带 3和条带4分别为阴性对照水的结果扩增产物。

并且在上述标准对照的情况下，进一步进行具体验证：选择使用人白血病 细胞HL60提取的Total RNA(提取过程采用RNA提取试剂盒进行)，之后进 行反转录生成DNA的模板，之后再采用本专利中的引物探针进行PCR扩增， 其扩增的结果中，可以成功扩增出目的基因，扩增曲线良好，电泳结果显示目 的条带清晰；但是ct值偏高，能够说明SelK在该细胞中表达量较低。

因此对比之后，本申请中引物探针反应性能良好，可以用于荧光定量RCR 方法检测人SelK mRNA表达水平的实验。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明 的保护范围之内。