针对疟原虫乳酸脱氢酶和富含组氨酸蛋白II的核酸适体及其用于疟疾诊断的用途

摘要

本发明提供了结合疟原虫蛋白乳酸脱氢酶和富含组氨酸蛋白II的核酸适体及其用于诊断疟疾的用途。针对富含组氨酸蛋白II的适体可用于通常检测疟原虫物种的存在，而针对乳酸脱氢酶的适体可用于特异性检测恶性疟原虫。

说明书

交叉引用相关申请

本申请要求2012年2月9日提交的美国临时申请序列号61/596,774的权益，所述申请以其整体通过引用并入本文。

发明领域

本发明涉及特异性结合疟原虫(Plasmodium)乳酸脱氢酶(LDH)和富含组氨酸蛋白II (HRPII)的DNA适体及其用于诊断疟疾的用途。

背景

疟疾，热带和亚热带地区广泛传播的传染性疾病，由寄生原生生物疟原虫的感染引起。尽管存在可以感染人的四种疟原虫，但物种恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)引起疟疾的最危险形式，具有最高的死亡率。根据世界卫生组织(WHO)，每年有超过两亿确诊的疟疾病例，导致近一百万例死亡。

此外，疟疾对国家和个人的财富具有负面影响。根据世界银行，疟疾使非洲每年花费约120亿美元，且每年使国内生产总值(GDP)减缓超过1％。疟疾的负担使家庭和社区陷入由于生产力损失导致的更深的贫困和对国内和国外投资和旅游业的负面影响。此外，疟疾大大影响社会的结构，因为高死亡率经常折磨五岁龄以下的年龄组。

美国疾病控制和预防中心注意到，虽然彻底消除疟原虫将是最优的，但这对于大部分疟疾流行的国家是不现实的。疟疾病例的改进管理对于控制疟疾传播是根本性的。

快速诊断测试(RDT)对于管理疟疾以减少疟疾的发病率、死亡率和传播是至关重要的。对于疟疾常用的RTD包括显微镜测定法、聚合酶链式反应(PCR)测定法、和基于抗体的测定法。疟疾的显微镜诊断，其基于血液涂片中疟原虫的显微镜观察，可以区分不同种的疟原虫。基于PCR的检测也可以以高灵敏度区分不同种的疟原虫。然而，显微镜和基于PCR的诊断测试两者都需要昂贵的设备和训练有素的健康护理工作人员，这通常对于发展中国家中的大多数处于风险中的群体是不可得的。

基于抗体的测定法利用抗体来检测疟原虫抗原。用于疟疾诊断的常用疟原虫抗原包括疟原虫乳酸脱氢酶(pLDH)、富含组氨酸蛋白2 (PfHRP2)和醛缩酶。尽管基于抗体的快速诊断测定法已经使疟疾管理大大受益，但它们具有显著的缺点，包括热不稳定性、批次间变化和高生产成本。

因此，对于用于疟疾诊断的改进方法存在需求。

概述

本发明提供了结合疟原虫乳酸脱氢酶和疟原虫富含组氨酸蛋白II的核酸适体(本文中被称为“疟疾适体”)和使用这些疟疾适体诊断和治疗疟疾的方法。

在一个实施方案中，本发明提供了以高特异性和亲和力靶向并结合两种疟疾蛋白乳酸脱氢酶和富含组氨酸蛋白II的核酸适体。针对乳酸脱氢酶的适体可用于泛物种检测(pan-species detection)疟原虫，而针对富含组氨酸蛋白II的适体可用于特异性检测恶性疟原虫。并行地，可以将这两种适体并入装置以通常检测疟原虫和诊断疟疾，以及确定疟疾是否特异性地由恶性疟原虫引起。

本发明涉及使用疟疾适体作为用于诊断疟疾的诊断装置的组分的方法。该方法提供了基于疟疾适体与疟疾蛋白目标的结合的特异性的疟疾抗原的特异性检测。

在某些实施方案中，本发明提供了包含本发明的核酸适体、或此类适体的稳定的衍生物、或其药学上可接受的盐的制剂。该制剂可以包含结合疟原虫乳酸脱氢酶或疟原虫富含组氨酸蛋白II或其变体或片段的任何适体。

本发明还提供了使用本发明的核酸适体用于通过特异性结合疟原虫编码蛋白和/或抑制疟原虫编码蛋白的功能而诊断或治疗疟疾的方法。

在诊断方面，本发明可以与其它诊断方法组合使用。在一个实施方案中，本发明可以给个体施用单独或与其它药物组合的一定量的疟疾适体。

在一个实施方案中，本发明还提供了定量样品中疟原虫蛋白水平的诊断方法。疟疾适体可以通过可检测物质进行标记，所述可检测物质包括但不限于荧光材料、酶、发光材料和放射性材料。本发明的此类实施方案可以用于检测生物样品中的疟原虫蛋白水平。

附图简述

图1是描绘使用“通过指数富集配体的系统进化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)”(SELEX^TM)方法体外选择适体的示意图。

图2显示体外选择LDH适体的琼脂糖凝胶分析。在第1、第3、第5、第7、第9、第12、第15、第18、第19和第20轮采集的样品。

图3显示本发明的适体的实施方案的核酸序列。所述适体特异性结合恶性疟原虫乳酸脱氢酶(PfLDH)或富含组氨酸蛋白2(HRP2)。分别在20轮针对恶性疟原虫PfLDH或针对恶性疟原虫富含组氨酸蛋白II(HRP2)的SELEX(包括通过使用人LDH和磁珠的反向SELEX方法)之后从ssDNA库克隆并测序适体。

图4是显示使用等温滴定量热法的2009(在每个5'和3'末端具有两个18聚体(18-mer)序列的PfLDH适体)和2009s之间的比较的图。左侧小图是2009的原始量热法数据和结合等温线，右侧小图是2009s(SEQ ID NO:3)的原始量热法数据和结合等温线。通过连续注射用适体滴定PfLDH，且使用单一结合位点模型拟合结合等温线。

图5是显示PfLDH适体(SEQ ID NO:1; 2004s)和重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶之间的结合的等温滴定量热法分析结果的图。上面小图是用连续注射PfLDH适体剂(SEQ ID NO:1; 2004s)滴定PfLDH的原始量热法数据。下面小图是针对适体稀释的热校正之后由原始量热法数据的整合产生的结合等温线。

图6是显示PfLDH适体(SEQ ID NO:2; 2008s)和重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶之间的结合的等温滴定量热法分析结果的图。上面小图是用连续注射PfLDH适体(SEQ ID NO:2; 2008s)滴定PfLDH的原始量热法数据。下面小图是针对适体稀释的热校正之后由原始量热法数据的整合产生的结合等温线。

图7是显示PfLDH适体(SEQ ID NO:3; 2009s)和重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶之间的结合的等温滴定量热法分析结果的图。上面小图是用连续注射PfLDH适体(SEQ ID NO:3; 2009s)滴定PfLDH的原始量热法数据。下面小图是针对适体稀释的热校正之后由原始量热法数据的整合产生的结合等温线。

图8是显示PfLDH适体(SEQ ID NO:4; 2021s)和重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶之间的结合的等温滴定量热法分析结果的图。上面小图是用连续注射PfLDH适体(SEQ ID NO:4; 2021s)滴定PfLDH的原始量热法数据。下面小图是针对适体稀释的热校正之后由原始量热法数据的整合产生的结合等温线。

图9显示四聚的PfLDH与两个本发明的DNA适体的结合。(A) 四聚的LDH在与本发明的DNA适体的两个具体实施方案的复合体中的晶体结构。(B) 复合状态中本发明的DNA适体的具体实施方案的结构，以及该DNA适体的核酸序列。(C) 适体与PfLDH(左)和人LDHA1和LDHB (右)结合的等温滴定量热法滴定。

图10显示在蛋白：适体结合：适体结合界面处的底物特异性环决定适体对于PfLDH相比于hLDH的辨别。(A) DNA适体与PfLDH的直接相互作用。(B) 适体结合的辨别是由于底物特异性环中的差异。PfLDH和hLDHB的底物特异性环显示于(B)。

图11显示用于分子诊断中的缀合至金纳米颗粒的适体。(A) 方法的原理。(B)单独的纳米颗粒(左)、适体缀合的纳米颗粒(中)和在PfLDH 存在的情况下适体缀合的纳米颗粒(右)的TEM。(C) 使用纳米颗粒来检测具体以25 ng/μl的PfLDH的定性观察。(D) (C)中数据的定量吸光度。

序列概述

SEQ ID NO: 1是结合恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)的DNA适体的核酸序列。

SEQ ID NO: 2是结合恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)的DNA适体的核酸序列。

SEQ ID NO: 3是结合恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)的DNA适体的核酸序列。

SEQ ID NO: 4是结合恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)的DNA适体的核酸序列。

SEQ ID NO: 5是结合恶性疟原虫富含组氨酸蛋白II(HRPII)的DNA适体的核酸序列。

SEQ ID NO: 6是结合恶性疟原虫富含组氨酸蛋白II(HRPII)的DNA适体的核酸序列。

SEQ ID NO: 7是结合恶性疟原虫富含组氨酸蛋白II(HRPII)的DNA适体的核酸序列。

SEQ ID NO: 8是结合恶性疟原虫富含组氨酸蛋白II(HRPII)的DNA适体的核酸序列。

SEQ ID NO: 9是结合恶性疟原虫富含组氨酸蛋白II(HRPII)的DNA适体的核酸序列。

SEQ ID NO: 10是结合恶性疟原虫富含组氨酸蛋白II(HRPII)的DNA适体的核酸序列。

SEQ ID NO: 11是结合恶性疟原虫富含组氨酸蛋白II(HRPII)的DNA适体的核酸序列。

SEQ ID NO: 12是根据本发明有用的引物的核酸序列。

SEQ ID NO: 13是根据本发明有用的引物的核酸序列。

SEQ ID NO: 14是根据本发明有用的核酸序列。

SEQ ID NO: 15是根据本发明有用的引物的核酸序列。

SEQ ID NO: 16是根据本发明有用的引物的核酸序列。

SEQ ID NO: 17是根据本发明有用的引物的核酸序列。

SEQ ID NO: 18是根据本发明有用的引物的核酸序列。

SEQ ID NO: 19是根据本发明有用的引物的核酸序列。

SEQ ID NO: 20是根据本发明有用的引物的核酸序列。

详述

本发明提供了结合疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)或疟原虫富含组氨酸蛋白II(HRPII)的核酸适体。本发明的核酸适体可以包含DNA或RNA核苷酸。在一个实施方案中，本发明提供了结合疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)或疟原虫富含组氨酸蛋白II(HRPII)的DNA适体。

在某些具体实施方案中，本发明提供了包含选自SEQ ID NOs:1-11的核酸序列的十一种不同的DNA适体序列。这些适体中的四种(SEQ ID NOs:1-4)针对疟原虫乳酸脱氢酶进行选择，且这些适体中的七种(SEQ ID NOs:5-11)针对富含组氨酸蛋白II进行选择。

等温滴定量热法结果显示本发明的适体与它们各自的目标(疟原虫乳酸脱氢酶和疟原虫富含组氨酸蛋白II)的紧密结合(图4-8)。这些适体还显示与对照蛋白的可忽略的结合，表明与各自目标的特异性结合。具体而言，本发明的疟原虫LDH适体不结合人LDH。

本发明还提供了本发明的核酸适体用于快速且灵敏地检测样品中的疟原虫，以及用于检测个体中的疟疾的用途。

结合疟原虫LDH和疟原虫HRPII的适体

本发明提供了结合疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)或疟原虫富含组氨酸蛋白II(HRPII)的核酸适体。本发明的核酸适体可以包含DNA或RNA核苷酸。在一个实施方案中，本发明提供了结合疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)或疟原虫富含组氨酸蛋白II(HRPII)的DNA适体。

在一个实施方案中，本发明提供了结合或特异性结合疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)的核酸适体，其中所述适体包含SEQ ID NOs:1-4中的任一种：  

。

在另一个实施方案中，本发明提供了结合或特异性结合疟原虫富含组氨酸蛋白II(HRPII)的核酸适体，其中所述适体包含SEQ ID NOs:5-7中的任一种：

。

如等温滴定量热法的结果(图4)中显示，当与具有SEQ ID NO:3的适体相比时，在SEQ ID NO:3的5'和3'末端添加两个18聚体序列的适体具有相似的对疟原虫LDH的化学计量、解离常数和结合亲和力(在纳摩尔范围内的相似结合亲和力)。

在某些实施方案中，本发明提供了结合疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)的核酸适体，其中所述适体包含核酸序列，所述核酸序列与SEQ ID NOs:1-4中的任一种具有至少约80％同一性，或高于80%的任何百分比，诸如，至少85%、90%、92%、93%、94%、95%或98%。

在某些实施方案中，本发明提供了结合疟原虫富含组氨酸蛋白II(HRPII)的核酸适体，其中所述适体包含核酸序列，所述核酸序列与SEQ ID NOs:5-11中的任一种具有至少约80％同一性，或高于80%的任何百分比，诸如，至少85%、90%、92%、93%、94%、95%或98%。

在某些实施方案中，本发明提供了结合疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)的核酸适体，其中所述适体包含核酸序列，所述核酸序列相对于SEQ ID NOs:1-4中的任一种具有不超过8、7、6、5、4、3、2或1个核酸的修饰(诸如添加、缺失、取代)。

在某些实施方案中，本发明提供了结合疟原虫富含组氨酸蛋白II(HRPII)的核酸适体，其中所述适体包含核酸序列，所述核酸序列相对于SEQ ID NOs: 5-11具有不超过15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个核酸的修饰(诸如添加、缺失、取代)。

在一个实施方案中，本发明提供了特异性结合疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)或疟原虫富含组氨酸蛋白II(HRPII)的核酸适体。在一个实施方案中，本发明提供了特异性结合恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)或恶性疟原虫富含组氨酸蛋白II(HRPII)的核酸适体。

“特异性结合”或“特异性”是指适体可检测地结合呈递在抗原上的表位，同时具有与其它蛋白或结构相对小的可检测的反应性的能力。特异性可以通过，例如，与特定抗原的结合相比于与其它无关分子的非特异性结合的亲和力/亲和力(affinity/avidity)的约10:1、约20:1、约50:1、约100:1、10.000:1或更高比例来表现。

除非另有说明，如本文所用，两个序列的百分比序列同一性和/或相似性可以使用如Karlin和Altschul(1993)中修改的Karlin和Altschul(1990)的算法来确定。将此类算法并入Altschul等人(1990)的NBLAST和XBLAST程序中。可以用NBLAST程序、评分= 100、字长= 12进行BLAST搜索，以获得具有期望百分比序列同一性的序列。为了获得用于比较目的的有缺口的比对，可以如Altschul等人(1997)中所述使用Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各自程序(NBLAST和XBLAST)的默认参数。参见NCBI/NIH网站。

适体序列的修饰

可以对适体进行各种修饰，以降低外切核酸酶降解并增加其用于诊断或用于治疗的寿命。用反转胸苷、脱氧胸苷核苷酸和聚乙二醇(PEG)修饰适体的3'末端可以降低寡核苷酸适体的降解并且增加适体的稳定性。在一个实施方案中，PEG具有约20 - 80 kDa的平均分子量。

进一步，还可以修饰适体的脱氧核糖-磷酸酯骨架的磷酸二酯键，以改善稳定性。

在一个实施方案中，本发明的核酸适体是寡核酸分子，其包含式1所示结构的重复单元。波浪线区别一个核苷酸和/或重复单元与邻近的核苷酸和/或重复单元。

在一个实施方案中，式1的每个重复单元具有连接至普通核苷酸碱基(B)(诸如，腺苷、胞苷、鸟苷、胸苷和尿苷)之一的脱氧核糖部分。对于每个重复单元的碱基(B)独立于其它重复单元。本文公开的核苷酸序列描述碱基(B)在适体中从适体的5'末端到适体的3'末端上的重复单元的出现次序。

在一个实施方案中，“L”是连接邻近重复单元的脱氧核糖部分的接头基团。在众所周知的DNA结构中，L基团是磷酸酯基团(phosphate group) PO₄H，其可以作为盐或以中性质子化形式存在。脱氧核糖部分连同接头基团一起形成适体的骨架，其中核苷酸碱基“B”独立地改变在重复单元之间的屏障。在适体中形成式1的重复单元的大部分接头基团(L)是磷酸酯基团。因此，适体的大部分骨架可以被称为脱氧核糖-磷酸酯骨架。存在许多核酸酶，其可以降解寡核苷酸分子，而无对于寡核苷酸分子的特定核苷酸碱基序列的特异性。不希望受任何一种具体理论束缚，除磷酸酯以外的接头基团“L”可以并入寡核苷酸或适体内，以防止核酸酶的降解。

在一个实施方案中，L可以用如式2中所示的基团替换，其中X_1-4独立地是O或S。X₂和X₃可以与脱氧核糖部分的3'碳或5'碳的键合。在一个实施方案中，X₁是O，并且X₄是O，其可以是质子化或未质子化的。在另一个实施方案中，X₂和/或X₃中的一个或多个是S，并且X₁和X₄是O，其中O可以是质子化或未质子化的。当X₂和/或X₃之一是S时，适体可以被称为在脱氧核糖-磷酸酯骨架中具有硫酯键。

在另一个实施方案中，接头基团“L”是如式3中所示的含酰胺基团，其中R可以选自氢、取代或未取代的C₁-C₁₀烃基。“烃”或“烃基”是指排他性地由元素碳和氢组成的有机化合物或基团。烃基包括烷基、烯基、炔基和芳基部分。烃基还包括烷基、烯基、炔基和被其它脂族、环状或芳香烃基取代的芳基部分，诸如烷芳基、烯芳基和炔芳基。在一个实施方案中，接头基团“L”是具有式3的基团，且适体在脱氧核糖-磷酸酯骨架中包含一个或多个酰胺键。式3的“NR”基团可以与脱氧核糖部分的3'碳或5'碳键合。在一个实施方案中，R是甲氧基甲基或甲氧基乙基。

在一些实施方案中，核酸适体具有约14至约100个核苷酸碱基和/或重复单元，或14至100之间任何数目的核苷酸碱基或重复单元，诸如20至50个核苷酸碱基和/或重复单元。在一些实施方案中，适体具有约14至约50个核苷酸碱基和/或重复单元。在一些实施方案中，适体具有约30至约35个核苷酸碱基和/或重复单元。

在一些实施方案中，适体包含一个或多个具有选自式2-3的接头“L”的重复单元。 在本发明的适体的一些实施方案中，具有选自式2-3的接头“L”的重复单元的数目为1至15，或其间的任何数目，诸如例如，1至10，2至8，和3至5。重复单元中未选自式2-3的接头基团是磷酸酯。

在本发明的适体的一些实施方案中，约10％至约100％(或其间的任何百分比，诸如例如约20％至约90％，约30％至约50％)的重复单元具有选自式2-3的接头“L”。在本发明的适体的一些实施方案中，约10％至约70％的重复单元具有选自式2-3的接头“L”。在本发明的适体的一些实施方案中，约10％至约50％的重复单元具有选自式2-3的接头“L”。在本发明的适体的一些实施方案中，约10％至约30％的重复单元具有选自式2-3的接头“L”。在本发明的适体的一些实施方案中，约10％至约20％的重复单元具有选自式2-3的接头“L”。重复单元中未选自式2-3的接头基团是磷酸酯。

各种核酸酶是从5'或3'末端降解寡核苷酸的外切核酸酶。因此，在一个实施方案中，选自式2-3的接头基团L位于距离适体5'或3'末端约5个重复单元内。在另一个实施方案中，选自式2-3的接头基团L位于距离适体5'或3'末端约3个重复单元内。在又另一个实施方案中，选自式2-3的接头基团L是适体5'或3'末端上的重复单元的部分。

适体的降解还可以通过包括修饰的核苷酸碱基(B)得到降低。嘧啶核苷酸碱基胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶可以替换为烷基化嘧啶。烷基化嘧啶的实例包括假异胞嘧啶；N4,N4-桥亚乙基胞嘧啶；4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶；5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶；二氢尿嘧啶；1-甲基假尿嘧啶；3-甲基胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；5-甲基氨基甲基尿嘧啶；5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶；5-甲氧基羰基甲基尿嘧啶；5-甲氧基尿嘧啶；尿嘧啶-5-羟乙酸甲基酯；假尿嘧啶；2-硫胞嘧啶；5-甲基-2硫尿嘧啶；2-硫尿嘧啶；4-硫尿嘧啶；5-甲基尿嘧啶；N-尿嘧啶-5-羟乙酸甲基酯；尿嘧啶5-羟乙酸；2-硫胞嘧啶；5-丙基尿嘧啶；5-丙基胞嘧啶；5-乙基尿嘧啶；5-乙基胞嘧啶；5-丁基尿嘧啶；5-戊基尿嘧啶；5-戊基胞嘧啶；甲基假尿嘧啶；和1-甲基胞嘧啶。嘌呤核苷酸碱基腺嘌呤和鸟嘌呤可以替换为烷基化嘌呤。烷基化嘌呤的实例包括8-羟基-N6-甲基腺嘌呤；肌苷；N6-异戊基-腺嘌呤；1-甲基腺嘌呤；1-甲基鸟嘌呤；2,2-二甲基鸟嘌呤；2-甲基腺嘌呤；2-甲基鸟嘌呤；N6-甲基腺嘌呤；7-甲基鸟嘌呤；2甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤；和1-甲基鸟嘌呤。

在一个实施方案中，核酸适体的至少一个脱氧核糖或核糖被吗啉环替代。在一个实施方案中，核酸适体的至少一个硫代磷酸酯或磷酸二酯键被磷酸二酰胺酯(phos-phorodiamidate)替代。

可以取代DNA的天然核苷酸的核苷酸具有碱基部分，所述碱基部分可以包括，但不限于，肌苷、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、次黄嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、5-甲基胞嘧啶和三苯甲基化的碱基。序列中的核苷酸的糖部分也可以进行修饰，并且包括，但不限于，阿拉伯糖、木酮糖和己糖。此外，可以用乙酰基、甲基、和/或硫代基团修饰核苷酸的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶碱基。含有核苷酸取代、缺失、和/或插入的序列可以使用本领域已知的标准技术进行制备和测试。

疟原虫感染的检测 

本发明还提供了用于诊断疟疾和用于检测样品中的疟原虫(诸如恶性疟原虫)的方法。

在一个实施方案中，用于诊断个体中疟原虫感染或疟疾的方法包括：

从个体获得生物样品；

将所述生物样品与核酸适体接触，所述核酸适体包含SEQ ID NOs:1-11中任一种，或与SEQ ID NOs:1-11中任一种具有至少85％同一性的序列；

确定所述核酸适体和疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)或疟原虫富含组氨酸蛋白II(HRPII)之间的结合复合体的形成，

其中所述结合复合体的存在表明所述个体具有疟原虫感染。

在一个实施方案中，所述方法包括将样品与核酸适体接触，所述核酸适体包含SEQ ID NOs:1-4中任一种，或与SEQ ID NOs:1-4中任一种具有至少85％同一性的序列，以及确定所述核酸适体和疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)之间的结合复合体的形成。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于检测样品中疟原虫的存在的方法，其中所述方法包括：

将样品与核酸适体接触，所述核酸适体包含SEQ ID NOs:1-11中任一种，或与SEQ ID NOs:1-11中任一种具有至少85％同一性的序列；

确定所述核酸适体和疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)或疟原虫富含组氨酸蛋白II(HRPII)之间的结合复合体的形成，其中所述结合复合体的形成表明所述样品中疟原虫的存在。

在进一步的实施方案中，所述方法进一步测定样品中疟原虫的浓度或量，其包括测定本发明的适体和疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)或疟原虫富含组氨酸蛋白II(HRPII)之间的结合复合体的浓度或量。

在另一个实施方案中，所述方法包括将样品与核酸适体接触，所述核酸适体包含SEQ ID NOs:5-11中任一种，或与SEQ ID NOs:5-11中任一种具有至少85％同一性的序列，以及确定所述核酸适体和疟原虫富含组氨酸蛋白II(HRPII)之间的结合复合体的形成。

针对乳酸脱氢酶的适体可用于泛物种检测疟原虫，而针对富含组氨酸蛋白II的适体可用于特异性检测恶性疟原虫。

如本文所用，术语“个体”描述生物体，其包括哺乳动物诸如灵长类。受益于本方法(the subject methods)的哺乳动物物种包括但不限于猿、黑猩猩、猩猩、人、猴；和驯养和/或实验室动物诸如狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、鸡、小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。通常，个体是人。

在某些实施方案中，本发明可用于检测疟原虫物种的存在，其包括但不限于恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)、诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi)、Plasmodium brasilaneum、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)、夏氏疟原虫(Plasmodium chabaudi)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)、里氏疟原虫(Plasmodium reichenowi)和鸡疟原虫(Plasmodium gallinaceum)。

在一个具体实施方案中，本发明可用于检测样品中恶性疟原虫的存在，以及诊断个体是否具有恶性疟原虫感染引起的疟疾。

本发明的适体可用可检测物标记，并根据可检测物的存在在生物样品中定位。可检测物的实例包括但不限于以下放射性同位素(例如³H、¹⁴C、³⁵S、¹²⁵I、¹³¹I)、荧光标记(例如FITC、罗丹明、镧系磷光体(lanthanide phosphors))、发光标记诸如鲁米诺；酶标记(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶、乙酰胆碱酶)、生物素基团(其可通过标记的抗生物素蛋白检测，抗生物素蛋白例如含有可通过光学方法或量热方法检测的荧光标记物或酶活性的链霉抗生物素蛋白)、由第二报道分子所识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链成对序列，第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。

术语“检测(detecting)”或“检测(detect)”包括测定或以其它方式确立目标疟原虫LDH或HRPII或试剂结合目标的组合的存在或不存在。

“样品”(生物样品)可以是来自人或非人个体的目标物处于任何物理状态(例如固体、液体、半固体、气体(vapor))和以任何复杂度(complexity)的任何组合物。优选地，样品是液体(生物液体)。样品优选包括人样品。可将样品包含在试管、培养容器、多孔板或任何其它容器或支持基材中。样品可以是例如细胞培养物或人组织。

如本文所用，术语“生物样品”包括但不限于从个体分离的含有组织、细胞和/或生物流体的样品。生物样品的实例包括，但不限于，组织、细胞、活检样品、血液、淋巴液、血清、血浆、尿液、唾液和泪液。在多个实施方案中，生物样品获得自或者源自，血液，包括血浆、血清和血细胞。

在某些实施方案中，本发明的检测和诊断测定法可以使用测定装置，诸如侧流装置和用于比色测定法的装置来进行。

试剂盒

在一个方面，本发明包括包含用于检测样品中的疟原虫所需元件的试剂盒。在一个实施方案中，所述试剂盒包含一种或多种本发明的核酸适体。

优选地，所述试剂盒包含用于收集样品的容器和用于检测疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)或疟原虫富含组氨酸蛋白II(HRPII)的存在的试剂。试剂盒的其它组分可以包括但不限于：用于采集生物样品的工具、用于标记检测试剂(结合剂)的工具、固体支持物、缓冲液、标记、标签和防腐剂。试剂盒也可含有固体支持物诸如微量滴定多孔板、标准品、测定稀释剂、洗涤缓冲液、粘性盖板(adhesive plate cover)和/或使用试剂盒进行本发明方法的说明书。在一个实施方案中，试剂盒包含用于待测定的生物样品(诸如血液或尿液)的一种或多种蛋白酶抑制剂(例如蛋白酶抑制剂混合物)。

如本文所用，术语“标记”和“标签”是指可赋予可检测信号的物质，包括，但不限于，酶(诸如碱性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和辣根过氧化物酶、核酶)、复制酶诸如QB复制酶的底物、助催化剂(promoters)、染料、荧光剂(诸如荧光素、罗丹明化合物、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺)、化学发光剂(诸如异氨基苯二酰肼)、敏化剂、辅酶、酶底物、放射性标记、颗粒(诸如胶乳颗粒或碳颗粒)、脂质体、细胞等，其可进一步用以下标记：染料、催化剂或其它可检测基团。

如本文所用，术语“缀合物”是指包含两个或多个分子的化合物，其任选通过接头基团键合在一起而形成单一结构。结合可通过分子间直接连接(例如化学键)或通过使用接头基团而进行。

如本文所用，术语固体“支持物”、“基材”和“表面”是指多孔或非多孔的水不溶性材料的固相，其可具有多种形状中的任一种，诸如条、棒、颗粒、珠或多孔板。在一些实施方案中，支持物具有优选作为组织基质(matrix)起作用的固定组织支持基质，诸如微量滴定盘。固体支持物材料包括但不限于纤维素、多糖诸如Sephadex、玻璃、聚丙烯酰吗啉、硅石、可控多孔玻璃(CPG)、聚苯乙烯、聚苯乙烯/胶乳、聚乙烯诸如超高分子量聚乙烯(UPE)、聚酰胺、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚四氟乙烯(PTFE；TEFLON)、羧基改性的聚四氟乙烯、尼龙、硝酸纤维素以及金属和合金诸如金、铂和钯。固体支持物可以是生物的、非生物的、有机的、无机的或它们的任何的组合，作为颗粒、线、沉淀、凝胶、薄片、垫、卡片、条、量杆、测试条、管、球、容器、毛细管、垫、切片、薄膜、板、玻片等存在，视具体应用而定。优选地，固体支持物形状是平的，以利于与生物样品(诸如尿液、全血、血浆、血清、腹腔液或腹水液)接触。其它合适的固体支持物材料对本领域技术人员而言将是显而易见的。固体支持物可以是有或无背衬(例如聚苯乙烯或聚酯卡片背衬)的膜，诸如可得自Millipore Corp. (Bedford, MA)的那些，例如Hi-Flow? Plus膜卡片。固体支持物表面可含有用于连接核酸、蛋白质等的反应性基团，诸如羧基、氨基、羟基、巯基等。虽然并非总是如此，但固体支持物上的表面有时会由与支持物相同的材料构成。因此，表面可以由各种各样材料中的任一种构成，诸如聚合物、塑料、树脂、多糖、硅石或基于硅石的材料、碳、金属、无机玻璃、膜或任何前述支持物材料(例如，作为层或涂层)。

实施例

以下是说明用于实施本发明的程序和实施方案的实施例。实施例不应解释为限制性的。

实施例1 -结合疟原虫LDH和HRPII的适体的特性

要求保护的适体和它们的目标之间的相互作用的热力学通过使用等温滴定量热法来研究。如图4-8中显示，观察到要求保护的适体以纳摩尔亲和力(K_d)特异性结合它们的目标，而不结合对照。

在图5的上小图中，在每次将2004s注射至PfLDH溶液后观察到放热热脉冲。使用单位点结合模型来拟合数据，然后结果显示2004s-PfLDH复合体的化学计量为0.152 ± 0.003位点，这表明在25℃溶液中每个PfLDH分子可以结合多于一个2004s。

在图6的上小图中，在每次将2008s注射至PfLDH溶液后观察到放热热脉冲。使用单位点结合模型来拟合数据，然后结果显示2008s-PfLDH复合体的化学计量为0.166 ± 0.003位点，这表明在25℃溶液中每个PfLDH分子可以结合多于一个2008s。

在图7的上小图中，在每次将2009s注射至PfLDH溶液后观察到放热热脉冲。使用单位点结合模型来拟合数据，然后结果显示2009s-PfLDH复合体的化学计量为0.451 ± 0.007位点，这表明在25℃溶液中每个PfLDH分子可以结合两个2009s分子。

在图8的上小图中，在每次将2021s注射至PfLDH溶液后观察到放热热脉冲。使用单位点结合模型来拟合数据，然后结果显示2021s-PfLDH复合体的化学计量为0.177 ± 0.003位点，这表明在25℃溶液中每个PfLDH分子可以结合多于一个2021s。

材料与方法

本发明描述了结合PfLDH和HRP的适体。PfLDH通过从恶性疟原虫3D7 cDNA文库中分子克隆PfLDH的cDNA而获得。PfLDH的编码区通过PCR用正向引物和反向引物进行扩增。将PCR产物用NheI/ XhoI消化，通过凝胶纯化进行纯化并连接到NheI/ XhoI消化的pET-28a载体以变成表达质粒pET28a-PfLDH。

PfLDH在大肠杆菌BL21(DE3) pLysS中异源表达。将pET28a-PfLDH转化至大肠杆菌BL21(DE3) pLysS细胞中，用于重组蛋白表达。通过将单个菌落接种至含有50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中，并随后在37℃孵育过夜而制备过夜培养物。对于PfLDH表达，将过夜培养物以1:50比率稀释在LB培养基中，并在37℃孵育，直到OD₆₀₀达到0.5，然后将异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)添加至培养物至0.5 mM的最终浓度，以诱导PfLDH表达。将诱导的培养物在室温进一步孵育4小时，并通过离心收获细胞。

为了从大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS细胞中提取重组PfLDH，将收获的细胞悬浮于裂解缓冲液(50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.3 M NaCl, 20 mM咪唑与蛋白酶抑制剂和核酸酶(Benzonase))中，裂解缓冲液与细胞培养物比率为1:50。将细胞悬浮液在冰上孵育30分钟，随后以9秒开和5秒关的循环超声处理10分钟。将细菌细胞裂解物以18000xg离心20分钟，收集上清液可溶性蛋白提取物用于PfLDH纯化。

将重组PfLDH通过亲和层析纯化。将可溶性蛋白提取物上样于镍亲和柱上，并将PfLDH通过50 mM Tris-HCl, pH7.5, 0.3 M NaCl中不同的150 mM咪唑进行洗脱。

PfLDH适体通过在PfLDH固定化磁珠上进行的SELEX和在人乳酸脱氢酶固定化磁珠和裸磁珠上进行的反向SELEX (counter SELEX)进行选择。通过将含有侧接两个18聚体引发区域的35聚体随机区域的单链DNA (ssDNA)文库与PfLDH固定化磁珠孵育而开始PfLDH适体的选择。孵育后，将未结合的种类去除，并将ssDNA-PfLDH-磁珠复合体悬浮在10 μL水中。

进行PCR用于扩增PfLDH结合的种类。用于PCR的反应混合物含有10 μL Pwo SuperYield PCR缓冲液、10 mM dNTPs、20 mM正向引物、20 mM反向引物(5'-生物素-、10 μL磁珠悬浮液、2.5 U Pwo SuperYield DNA聚合酶和使最终体积为100 μL的水。PCR条件为：95℃变性15秒，50℃退火30秒和72℃延伸15秒，10个循环。

将PCR产物收集，并与链霉抗生物素蛋白磁珠孵育。将未生物素化的ssDNAs通过添加100mM NaOH进行洗脱。第一至第三轮选择，将洗脱的ssDNAs通过乙醇沉淀而浓缩，而QIAquick凝胶纯化试剂盒用于后续轮次。得到的ssDNA库用于下一轮选择。第四和第七轮中包括通过使用裸磁珠的反向选择，第六和第十轮中包括hLDHA1固定化磁珠，且第五和第九轮中包括hLDHB固定化磁珠。最终，克隆来自第二十轮的ssDNA库，并挑取菌落用于测序。

对于针对HRP2的适体的表达、纯化和选择，采取类似的方法。

对于等温滴定量热法，将PfLDH适体和PfLDH在含有0.1 M NaCl和20 mM咪唑的25 mM Tris-HCl, pH 7.5中进行透析。在ITC实验之前，将所有缓冲液、蛋白和适体在25℃脱气10分钟。所有实验都使用iTC₂₀₀微热量计(MicroCal Inc.)在25℃在含有0.1 M NaCl和20 mM咪唑的25 mM Tris-HCl, pH 7.5中进行。ITC实验通过将PfLDH适体注射至PfLDH而进行。通过使用Origin v7.0软件(MicroCal Inc.)以整合滴定曲线用于提取热力学参数、化学计量(N)、平衡结合常数[K_a (=K_d^-1)]和结合焓(binging enthalpy) (ΔH)而分析ITC数据。

对于适体与HRPII的结合的研究，采取类似的方法。

实施例2 - DNA适体识别疟原虫乳酸脱氢酶的结构基础

本实施例显示针对疟疾泛物种诊断目标恶性疟原虫乳酸脱氢酶(PfLDH)的DNA适体的一个实施方案的晶体结构和应用。本实施例还显示本发明的发夹DNA适体分子识别恶性疟原虫乳酸脱氢酶(PfLDH)的新机制。

克隆PfLDH和两种相关的人同源hLDHA1和hLDHB，在大肠杆菌中表达并纯化。从具有针对纯化的PfLDH的35个碱基随机区域的库中选择DNA适体，并反向选择以去除结合密切相关的人同源hLDHA1和hLDHB的适体。20轮选择后，获得51个序列并比对，揭示存在保守序列特征和基序。观察到这些适体中的许多特异性结合PfLDH(具有20-50 nM范围内的Kd最有希望)，而不结合hLDHA1和hLDHB，如通过等温滴定量热法(图9c)、电泳迁移率改变测定法和表面等离子体共振(SPR)光谱学所确定的。

采取三种结合测定法中显示显著希望的单一DNA适体(2008s) (SEQ ID NO:2)(具有图9b中所示的序列)用于结构分析。

PfLDH:适体复合体的晶体结构通过X-射线晶体学来确定(图9a)。将不对称单元中的四个分子的PfLDH组织成与先前确定PfLDH X射线晶体结构类似的具有特征性222对称性的四聚体。

看到两个ssDNA适体中的每个都结合至由分子A和B(或分子C和D)形成的Q轴二聚体，跨越两个并列单体的大辅因子结构域。

适体没有形成G-四链结构，但显示发夹结构(图9b)。对于不对称单元中两个适体的前27个碱基观察到清晰的电子密度；在适体的3'末端的最后8个碱基的发夹结构外没有观察到电子密度，可能是因为适体尾部是无序的。适体的总体折叠采用扭曲的发夹结构，其具有C¹⁵A¹⁶T¹⁷A¹⁸顶端四环，在一条链具有六个碱基(C⁶G⁷G⁸T⁹A¹⁰G¹¹)且在另一条链具有一个碱基(A²²)的不对称内环，和末端的B形螺旋。适体含有七个Watson-Crick型碱基对，其中五个形成末端的B形螺旋茎DNA双链体。剩余的两个Watson-Crick型碱基对，连同A¹²和G²¹之间的非标准碱基配对，形成侧接内环和顶环之间的DNA双链体。与末端的B-螺旋茎类似，这种短双链体假定B-螺旋几何学。两个B-螺旋以~140°角度取向，导致DNA适体的整体弯曲形状。内环的C⁶参与与它的邻居，茎B-螺旋的G⁵的堆叠相互作用。作为结果，内环的C⁶、G⁷和G⁸保持在茎B-螺旋中，因为它们连续堆叠。G⁷和A¹⁰形成内环中的非标准碱基对。T⁹翻出(flipped out)了内环，并参与如下所述的适体：PfLDH相互作用。在顶端四环中，T¹⁷和A¹⁸两者都参与堆叠相互作用，并保持在侧接顶环和内环的短双链体的螺旋轴中。C¹⁵和A¹⁶翻出顶环，C¹⁵的位置被N4与C¹⁴的骨架磷酸酯的相互作用所稳定，而A¹⁶参与经由水与PfLDH的间接相互作用。

每个适体通过大量盐桥与Q轴二聚体的两个PfLDH分子的辅因子结合位点相互作用(图10a)。适体和PfLDH之间的界面分别掩盖了适体上的1276?2和PfLDH的分子A/C和B/D的895?2和394?2的溶剂可接触的表面。适体经由不同区域与两个邻近的PfLDH分子的辅因子结合位点的尖端的底物特异性环相互作用。分子A/C与内环相互作用，而分子B/D与顶端四环相互作用。

适体经由内环与PfLDH二聚体的分子A相互作用。DNA适体的内环的碱基C⁶、G⁷、G⁸、G¹¹和A²²与延伸的底物特异性环的残基102A-108A形成大量碱基相互作用，还看到与Lys102A和Lys106A的骨架接触，分别与A¹⁰和A²²的磷酸酯形成接触。翻转的碱基T⁹远离弯曲发夹结构延伸进入NADH结合裂隙(binding cleft)的腺嘌呤末端，并由T⁹碱基的N3和Asp53A的侧链，和T⁹碱基的O4与Ile54A的氨基氮之间的氢键稳定。

与内环和PfLDH的分子A的相互作用相比，顶端四环与PfLDH的分子B的相互作用没有那么广泛，且经由水分子参与间接接触。观察到与四环的A18和G19的磷酸酯基团的直接骨架接触，所述四环与NADH结合裂隙的Lys62B和His250B的侧链相互作用。与内环中的T9类似，翻转的碱基A16延伸入分子B的NADH结合裂隙的腺嘌呤末端。然而，代替与蛋白的直接相互作用，顶环的A16的位置由经由经水分子与蛋白的间接相互作用而稳定(图10a)。

该适体与PfLDH的独特延伸的底物特异性环(氨基酸102-108)的广泛相互作用对适体结合PfLDH，而不是人LDH的高特异性有贡献。事实上，人LDHB (PD登录号：1T2F)与我们的PfLDH：适体结构的叠加揭示，人LDH缺乏在底物特异性环处的延伸，导致无法达到适体(图10b)。因此，该适体与人LDH的结合不会发生，这既证明了反向选择策略是成功的，也为我们的结合测定中测定的特异性提供了结构解释。

将PfLDH适体缀合至金纳米颗粒(AuNPs)以开发PfLDH的比色测定法(图11a)。透射电子显微镜揭示，AuNP在PfLDH存在的情况下特异性聚集(图11b)。在25 ng/μl PfLDH存在的情况下，但不是在hLDHA1、hLDHB或其它对照存在的情况下，特征性的红宝石红色(520 nm的吸光度峰)特异性丢失(图11c和11d)。检测限值被确定为0.73 ng/μl PfLDH。

结果显示，鉴定的DNA适体可以由于其不存在于人LDH中的独特环而特异性识别PfLDH。该结果还显示，本发明的DNA适体可用于诊断疟疾。

总之，本实施例显示了针对PfLDH的发夹DNA适体的具体实施方案的鉴定、结构表征和应用。本实施例显示，该DNA适体的特异性由辨别性结合至仅存在于疟原虫、但不存在于人乳酸脱氢酶中的环来实现，在分子水平上证明了反向选择在适体选择中的实用性。该结果显示，本发明的DNA适体可用于疟疾诊断。

材料与方法

PfLDH和人乳酸脱氢酶(hLDHA1和hLDHB)的克隆、表达和纯化

通过和扩增PfLDH的可读框(ORF)，随后连接至NcoI/ XhoI消化的pET-28a (Novagen)载体中。

通过和扩增hLDHA1的ORF，随后连接至NheI/ HindIII消化的pET-28a (Novagen)载体中。

通过和扩增hLDHB的ORF，随后连接至NheI/NotI消化的pET-28a (Novagen)载体中。

将质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS中，用于IPTG诱导的表达。通过使用HisTrap柱(GE Lifesciences)进一步纯化表达的蛋白。

DNA适体的体外选择

将含有侧接两个18聚体引发区域的35聚体随机区域)的单链DNA (ssDNA)文库用作用于体外选择的起始材料。将2 nmol ssDNA文库与1nmol缀合Ni-NTA磁珠的目标蛋白孵育。去除未结合的种类，并将ssDNA-蛋白-磁珠复合体悬浮在10 μL水中，用于通过使用正向引物和具有生物素化的5'末端的反向引物(5’– 生物素–PCR扩增PfLDH结合的种类。

PCR条件为：95℃变性15秒，50℃退火30秒和72℃延伸15秒，10个循环。富集的DNA适体库通过链霉抗生物素蛋白磁珠纯化，随后炔基化以去除未生物素化的互补链。所得ssDNA库用于下一轮选择。在SELEX循环之间引入通过使用Ni-NTA磁性琼脂糖珠、hLDHA1固定化的Ni-NTA磁性琼脂糖珠和hLDHB固定化的Ni-NTA磁性琼脂糖珠的反向选择。

结晶和结构解析

通过以1:1摩尔比混合蛋白和DNA形成PfLDH和DNA适体之间的复合体，用于结晶。在291 K使用MOSQUITO?液体处理器(TTP Labtech)使用坐滴气相扩散法通过将100 nl蛋白:DNA复合体与等体积的结晶溶液混合进行结晶条件的筛选。在筛选的576种条件中，观察到蛋白：DNA复合体的几个命中条件。在Hampton Research Natrix Screen的条件26 (0.2 M KCl, 0.1 M乙酸镁，0.05 M甲胂酸钠 pH 6.5, 10% w/v PEG 8000)下获得了最好的晶体。

将PfLDH：适体复合体的晶体在与贮存溶液混合的30％甘油的溶液中冷冻保护。在光束线13B1, NSRRC, Taiwan收集数据。将数据进行索引并与HKL2000整合。通过使用程序PHASER与LDH的结构(PDB登录号1LDG)分子置换解析该结构。用COOT手动建立DNA适体的结构，并在Refmac中精细化复合体结构。

等温滴定量热法(ITC)

对于等温滴定量热法，将PfLDH适体和PfLDH在含有0.1 M NaCl和20 mM咪唑的25 mM Tris-HCl, pH 7.5中进行透析。在ITC实验之前，将所有缓冲液、蛋白和适体在25℃脱气10分钟。所有实验都使用iTC₂₀₀微热量计(MicroCal Inc.)在25℃在含有0.1 M NaCl和20 mM咪唑的25 mM Tris-HCl, pH 7.5中进行。ITC实验通过将PfLDH适体注射至PfLDH而进行。通过使用Origin v7.0软件(MicroCal Inc.)以整合滴定曲线用于提取热力学参数、化学计量(N)、平衡结合常数[K_a (=K_d-1)]和结合焓(ΔH)而分析ITC数据。

电泳迁移率改变测定法(EMSA)

通过在室温将25 nM PfLDH适体2008s与浓度范围为0–22.8 μM的在含有0.1 M NaCl和20 mM咪唑的25 mM Tris-HCl, pH 7.5中的不同蛋白孵育1小时而进行电泳迁移率改变测定法。将反应物上样至12％非变性聚丙烯酰胺凝胶上并通过SYBR?金核酸凝胶染色剂(Invitrogen)显影。

表面等离子共振

使用Biacore X100仪器(GE Healthcare)进行表面等离子共振(SPR)测量。将PfLDH捕获在NTA传感器芯片(GE Healthcare)的表面上。含有25 mM Tris-HCl, pH7.5, 100 mM NaCl, 20 mM咪唑和0.005% (v/v) Tween 20的运行缓冲液用于配体捕获。用运行缓冲液引发NTA芯片的表面，并通过单循环分析以范围0.625–10 μM的浓度一式三份注射PfLDH适体2008s。

所有实验都以30 μL min^?1的流速在25℃进行。所有数据都针对没有捕获PfLDH的表面和缓冲液的空白注射进行参照。用Biacore X100 Plus Package评估软件(GE Lifesciences)分析传感图。

适体固定化的金纳米颗粒的制备

根据Taton⁶所述的改进的方案将PfLDH适体2008s缀合至10 nm胶体金(Sigma)。所有孵育都在室温在黑暗中进行。使用前，将二硫化物官能化的适体在室温由0.1 M二硫苏糖醇(DTT)还原30分钟。还原的适体使用Sephadex G-25 (Pharmacia Biotech.)进行纯化。然后将2.5 nmol还原的适体添加至500 μL AuNP。

孵育24小时后，添加1 M NaCl和0.1 M磷酸钠缓冲液，以分别达到0.1 M NaCl和10 mM磷酸盐缓冲液的最终浓度。将适体/金纳米颗粒混合物在室温再陈化24小时。通过离心将2008s-AuNP从溶液中分离，随后在0.1 M NaCl/10 mM磷酸钠缓冲液, pH 7中洗涤。通过上述程序将37聚体聚胸腺嘧啶(聚T)缀合至AuNP，作为对照实验。将适体-AuNP缀合物储存在0.3 M NaCl/0.01%叠氮化钠/10 mM磷酸钠缓冲液, pH 7.0中。

2008s-AuNP的表征: UV-Vis光谱法

通过Varioskan Flash Multimode Reader (Thermo Scientific)进行了光谱法分析。光谱源自至少三次实验。

2008s-AuNP的表征:透射电子显微术(TEM)

通过Philips CM100 TEM表征寡核苷酸固定化的AuNPs。通过将样品添加至网格并在室温干燥将约10 μL AuNP缀合物包被在200目铜网上。

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