恶性疟原虫乳酸脱氢酶基因的克隆、表达、单抗制备及疟疾诊断研究

摘要

该研究利用PCR技术钓取了恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)的乳酸脱氢酶编码基因,测定的序列与恶性疟原虫Honduras-1株LDH、诺氏疟原虫LDH以及其它生物LDH序列进行同源性分析,以探讨恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDHpf)独特的理化、免疫学及酶学特性的分子机制.将LDHpf编码基因克隆至pGEX-4T-1表达载体,并在大肠杆菌中进行了表达,分析重组蛋白的免疫原性,纯化重组蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体,结合免疫胶体金技术和LDHpf的酶学特性分别建立了免疫胶体金层析测试(GICA)法和免疫捕获LDH活性检测(ICpLDH)法,并以镜检法、PCR法为对照,评价其检测恶性疟原虫的敏感性和特异性,同时与国外疟疾诊断试剂盒ICT2进行平行检测对照.另外,根据LDHp能迅速地利用APAD作为辅酶参与原虫无氧酵解获得大部分三磷酸腺苷(ATP),而LDHr参与此反应很慢这一特性,我们利用同工酶电泳技术对两者进行鉴别,利用酶经色法对LDHpf活性与原虫密度、培养时间的关系进行了初步研究.该研究为间日疟原虫乳酸脱氢酶(LDHpv)单克隆抗体的制备提供了新的思路.由于间日疟原虫尚未能在体外培养,加之虫体的感染率比较低,使得提纯LDHpv还存在困难,因而制约了抗LDHpv抗体的制备和免疫诊断试剂的开发.我们可以从LDHpv的基因入手,获得重组抗原制备LDHpv种特异性单抗.则应用以抗LDHpf和LHpv单抗为基础建立的GICA法,不仅能够诊断单纯的恶性疟原虫或间日疟原虫感染,而且可以诊断混合感染,必将成为一种极有前景的疟疾诊断方法.然而目前对LDHp基因的研究只局限于恶性疟原虫和诺氏疟原虫的研究,LDHpv基因还未见报道,因此钓取LDHpv基因已迫在眉睫,我们也正在进行这方面的工作.

目录

缩略词

前言

第一部分恶性疟原虫乳酸脱氢酶重组表达质粒的构建及鉴定

材料和方法

一、材料

二、实验方法

结果

一、LDH基因的扩增

二、重组克隆的筛选及鉴定

三、序列的测定及同源性分析

讨论

小结

第二部分重组蛋白的表达、纯化及免疫原性研究

一、材料

二、实验方法

(一)LDH基因的诱导表达

(二)表达产物SDS-PAGE分析

(三)表达产物酶活性测定

(四)表达产物的纯化

(五)表达产物抗原性分析

结果

一、重组质粒的表达

二、表达蛋白的纯化

三、表达产物免疫学鉴定

四、多抗制备及鉴定

讨论

小结

第三部分单克隆抗体的制备及鉴定

一、材料

二、实验方法

(一)抗原制备

(二)动物免疫

(三)细胞融合

(四)阳性克隆的筛选与克隆化

(五)单克隆抗体的Ig类与亚类鉴定

(六)杂交瘤细胞的染色体分析

(七)诱生腹水

(八)效价测定

(九)单克隆抗体的SDS-PAGE分析

(十)单克隆抗体特异性鉴定

结果

一、杂交瘤细胞株的建立

二、单克隆抗体的类及亚类

三、单克隆抗体的效价

四、染色体鉴定

五、单克隆抗体的SDS-PAGE分析

六、单克隆抗体特异性鉴定

讨论

小结

第四部分疟疾诊断研究

材料和方法

一、材料

二、实验方法

结果

一、镜检

二、PCR检测

三、ICT2检测

四、免疫胶体金层析法(GICA)检测

五、LDH活性检测法

六、免疫捕获LDH活性检测法

讨论

一、PCR法

二、免疫胶体金层析检测

三、酶活性检测

四、免疫捕获LDH活性检测法

小结

总结

参考文献

致谢

综述一

综述二

附录1：博士期间论文发表情况

附录2：Genbank登录情况