恶性疟原虫乳酸脱氢酶的表达、纯化、单克隆抗体的制备及鉴定

摘要

该研究旨在利用疟原虫的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)为诊断靶抗原,通过对该蛋白进行克隆、表达,制备单抗,并筛选、配对建立反应模式等系列研究,开发用于疟疾快速诊断的免疫层析检测试剂盒.研究中,首先将恶性疟原虫的LDH(Plasmodium falciparum lactate dehydrogenase,LDHpf)基因克隆至pET-23a(+)表达载体中,构建pET23-LDH重组质粒.重组质粒在BL21中得到高效表达,SDS-PAGE显示表达蛋白分子量约为33KDa,与先前报道的疟原虫LDH分子量理论值(31-36Kda)基本符合.表达产物冰浴超声破菌,发现目的蛋白大部分溶于上清中,为可溶性表达,密度扫描显示目的蛋白占菌体总蛋白的41.2％.采用Q-Sepharose High Performance阴离子交换树脂柱层析对pET23-LDH重组蛋白进行纯化,SDS-PAGE电泳经凝胶光密度图象分析系统检测主蛋白纯度可达89.1%,浓度为400μg/ml.用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备免疫血清,ELISA结果显示免疫小鼠血清与pET23-LDH表达产物出现明显反应,而对空载体PET-23a表达产物无反应.Westernblot分析表明特异性区带出现在33kDa处,而空载体诱导后表达的产物无区带出现.进一步用该免疫血清与恶性疟原虫和间日疟原虫反应,Western blot结果表明免疫血清能识别恶性疟原虫和间日疟原虫33KDa处虫源蛋白,而与未感染的红细胞不发生交叉反应,提示pET23-LDH重组蛋白具有良好的抗原性和免疫原性.以纯化后的LDH重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,融合细胞用HAT培养基作选择性培养.采用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株,获得11株能分泌高效价和高特异性的抗LDH重组蛋白单抗的杂交瘤细胞株.Ig类与亚类鉴定结果为2B11、3C9、3D1 0、6D3、7D2、1E7、6G7、1C6、2D7重链类型为I g G 1亚类,轻链为к型;2F12重链类型为I g G 2亚类,轻链为к型;2C6重链类型为IgG1亚类,轻链为λ型.11株单抗培养上清的ELISA效价为1:100~1:400,腹水效价为1:6400~1:51200.从而可为恶性疟原虫免疫胶体金快速诊断试剂盒的研制提供抗体.利用饱和硫酸铵纯化后的11株单抗,建立了同时诊断恶性疟原虫和间日疟原虫的GICA法.

目录

缩略词

前言

第一部分恶性疟原虫乳酸脱氢酶的表达、纯化及免疫活性测定

一、材料

二、实验方法

(一)pET23-LDH重组质粒的构建

(二)pET23-LDH重组蛋白表达

(三)表达产物的纯化

(四)表达产物的免疫学鉴定

结果

一、重组克隆的筛选与鉴定

二、序列测定及同源性分析

三、重组质粒的表达

四、表达产物的纯化

五、表达产物免疫学分析

讨论

小结

第二部分单隆抗体的制备及鉴定

一、材料

二、实验方法

(一)抗原选择

(二)动物免疫

(三)细胞融合

(四)阳性克隆的筛选

(五)杂交瘤细胞的克隆化

(六)单克隆抗体的生产

(七)单克隆抗体的Ig类与亚类鉴定

(八)效价测定

结果

一、杂交瘤细胞株的建立

二、单克隆抗体的Ig类与亚类鉴定

三、效价测定

讨论

小结

第三部分 胶体免疫层析法检测LDHp（疟原虫乳酸脱氢酶）

一、材料

二、实验方法

(一)单抗的纯化

(二)胶体金的制备

(三)胶体金标记物制备

(四)标记胶体金聚酯膜的制备

(五)单克隆抗体及羊抗鼠IgG的包被

(六)试纸条组装

(七)测试方法

结果

一、和硫酸铵法纯化抗体

二、GICA反应模式的建立

三、灵敏度实验

四、特异性实验

五、批内重复性和批间重复性

六、稳定性实验

讨论

小结

总结

参考文献

致谢

综述 疟疾诊断技术与疫苗研究进展

附录：论文发表情况