用于猪细小病毒5型实时荧光定量PCR方法的引物及探针

摘要

本发明提供了一种猪细小病毒5型实时荧光定量PCR方法的引物和探针，所述引物序列为：上游引物：5’- GGAGGTACAATAGGTGAA -3’，下游引物：5’- GGAGCAGATAATTCTTCAA -3’，所述探针序列为：5’ - (FAM) AACTGCTGGATCTTGTCTATTATCTAA (Eclipse)-3’。本发明根据美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库中的所有猪细小病毒5型基因组序列，设计特异性的引物和探针，于国内外率先建立猪细小病毒5型实时荧光定量PCR方法，该方法灵敏度高，最低可检测2.76copies，特异性强，重复性好。

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪细小病毒5型实时荧光定量PCR方法的引物和探针，属于病毒分子生物学领域。

背景技术

随着病毒宏基因组学的研究的不断深入，新发病毒的发现的报道越来越多。近年来，猪群中DNA病毒的报道越来越多，除去经典的猪细小病毒（porcine parvovirus，PPV）和猪圆环病毒（porcine circovirus type ⅠandⅡ，PCV1和PCV2），还见有猪细小病毒2型（porcine parvovirus type 2，PPV2）、猪细小病毒3型（porcine parvovirus type 3，PPV3）、猪细小病毒4型（porcine parvovirus type 4，PPV4）以及多种亚型的猪博卡病毒（porcine bocavirus，PBoV）。【参考文献：Xiao CT, Giménez-Lirola LG, Jiang YH, Halbur PG, Opriessnig T. Characterization of a novel porcine parvovirus tentatively designated PPV5. PLoS One, 2013, 8(6): e65312.】。猪细小病毒5型（porcine parvovirus type 5，PPV5）最早在美国报道。【参考文献：Xiao CT, Halbur PG, Opriessnig T. Complete genome sequence of a novel porcine parvovirus (PPV) provisionally designated PPV5. 2013, Genome Announc, 1: e00021–00012.】。

目前，在对新发病毒进行分子流行病学采用的方法有PCR方法和实时荧光定量PCR方法。荧光PCR是在普通PCR的基础上，在扩增反应体系中加入一对特异性引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，使用实时监测的荧光PCR检测仪来检测靶核苷酸序列的技术，具有特异性强、灵敏度高、定量准确、适用性广等优点。目前，还未见针对猪细小病毒5型实时荧光定量PCR方法，但该属其他类型病毒如PPV1、PPV2和PPV4均已经有相应的荧光定量PCR检测方法。本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪细小病毒5型实时荧光定量PCR方法的引物和探针。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

用于检测猪细小病毒5型（PPV5）的引物和探针包括：

一种用于检测猪细小病毒5型（PPV5）的引物，所述引物序列如下：上游引物：5’- GGAGGTACAATAGGTGAA -3’，下游引物：5’- GGAGCAGATAATTCTTCAA -3’。

一种用于检测猪细小病毒5型（PPV5）的探针，其特征在于，所述探针序列为：5’ - (FAM) AACTGCTGGATCTTGTCTATTATCTAA (Eclipse)-3’。

所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团（R）和荧光淬灭基团（Q）的寡核苷酸。

利用本发明的引物和探针可用于对猪细小病毒5型（PPV5）的分子流行病学检测，尤其适用于基于荧光定量PCR技术的检测。通过对反应体系和反应条件的各种优化，建立一套可用于检测PPV5的荧光定量PCR方法。

具体操作方法如下：

1、引物和探针设计：参考美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库中的所有猪细小病毒5型基因组序列，利用序列比对软件MEGA进行同源性分析比较，利用Oligo 7.软件，设计引物和探针，探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为Eclipse，采用局部序列比对基本检索工具（basic local alignment search tool，BLAST）工具进行检索，验证引物和探针序列的特异性。

2、反应体系的优化：

优化出的25μL 最佳反应体系为： Premix Ex Taq^TM （2×）12.5 μL、上、下游引物（10 μM） 各0.4 μL、荧光探针（5 μM）0.8μL、模板2 μL、水补足至终体系25 μL。最佳反应条件为：95 ℃，1 min预变性；95 ℃ 10s、55 ℃15 s、72 ℃ 20s，共45个循环。

3、阳性标准品的制备：以提取的PPV5阳性DNA为模板，按照常规方法进行PCR扩增，将扩增的产物回收、纯化，连接到pMD18-T载体上，转化，提取质粒，得到阳性标准品。

4、标准曲线的建立：以优化的反应体系进行PCR扩增，以拷贝数为横坐标，以Ct值为纵坐标建立标准曲线，判定阳性的标准。

该方法可用于PPV5的流行病学检测，为疾病的早期预防控制奠定技术基础。

本发明的有益效果：

本发明根据PPV5基因组序列，设计引物和探针，于国内外首先建立PPV5的荧光定量 PCR方法，该方法灵敏度高，最低可检测2.76copies，特异性强，重复性好。

附图说明

图1 PPV5的荧光定量PCR方法的扩增曲线。

图2为PPV5的荧光定量PCR方法的标准曲线。

具体实施方式

实施例1 PPV5的荧光定量PCR方法的建立

一、实验步骤

1、仪器与试剂

Primix Ex Taq ^TM (Probe qPCR)、pMD18-T载体、DL500 DNAMarker均购自宝生物工程（大连）有限公司；快速DNA提取检测试剂盒(KG203)、胶回收试剂盒、质粒小量抽提试剂盒、Taq PCR Mastermix(KT201)购自天根生化科技（北京）有限公司；定量PCR管购自Axygen。

2、引物和探针

引物和探针的特异性是本实验所建立方法的最重要因素，通过BLAST比对分析，验证设计引物的特异性。

3、阳性标准品的制备

按照快速DNA提取检测试剂盒说明书，提取PPV5基因组DNA。用所设计的特异性引物（上游引物：5'- TTCGGCCTGTATTTGAAGATGGAA -3'；下游引物:5'- AAGCATTGTTTTGCCATATATCCT -3'，扩增片段大小约848bp，进行PCR扩增后，扩增体系为50μL，其中Taq PCR Mastermix 25μL、上下游引物（20μM/mL）各1μL、模板DNA1μL、灭菌去离子水22 μL。反应条件为94℃预变性5min，随后进行94℃ 50s、52℃ 30s、72℃ 50s 循环35个循环后， 72℃延伸10min。反应结束后，取PCR产物5μL，在1.0%琼脂糖凝胶上电泳。将PCR产物经胶回收试剂盒纯化后与pMD18-T载体连接，转化DH5α感受态细胞，用PCR和双酶切方法鉴定重组质粒。阳性重组质粒进行序列测定。测序结果表明，阳性重组质粒符合预期，即做为阳性标准品。

4、实时荧光定量PCR反应条件的优化

采用25 μL反应体系［Premix Ex Taq^TM （2×）12.5 μL、上、下游引物（10 μM） 各0.4 μL、荧光探针（5 μM）0.8μL、模板2 μL、水补足至终体系25 μL］，以出现最高的荧光值（△Rn）、最小的Ct值为指标，对退火温度（52～66℃）、引物终浓度（0.1～1μM）及探针终浓度（0.05～0.5μM）进行优化。

最佳反应条件为：95 ℃，1 min预变性；95 ℃ 10s、55 ℃15 s、72 ℃ 20s，共45个循环。

5、建立的标准曲线

用微量核酸测定仪测定阳性标准品260 nm处光吸收值（A260），计算DNA拷贝数，随后将阳性标准品进行连续10倍系列稀释（10^-2～10^-8），以优化的条件进行扩增，以拷贝数为横坐标，以Ct值为纵坐标建立标准曲线。

对阳性标准品的扩增曲线和标准曲线显示，荧光定量PCR方法对PPV5的最低检测限为2.76拷贝数/反应，并且CT与拷贝数在2.76～2.76×10⁷拷贝/反应范围内有很好的线性关系，相关系数为0.997，扩增效率为99.9%，斜率为-3.36，Y轴截距为24.41。扩增曲线见图1，标准曲线见图2。

6、特异性检测

6.1 特异性检测

用优化的条件分别检测猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪博卡病毒（PBoV）、猪伪狂犬病毒（PRV）核酸样品，用优化的条件进行实时荧光定量PCR检测，对其特异性进行评价。结果检测均为阴性，荧光定量PCR产物经3.0% 琼脂糖凝胶电泳也未见条带。

6.2 组内和组间实验

对同一阳性标准品设3个重复管，用实时荧光定量RT-PCR进行检测，评价其重复性，计算组内变异系数；将阳性标准品置于－20℃冰箱保存，分别于第2周、第4周和第6周重检，评价其再现性，计算其组间变异系数。计算得组内变异系数为0.34%～1.18%，组间变异系数为0.58%～2.62%，可重复性好，符合实验要求。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  福建农林大学

 

<120>  用于猪细小病毒5型实时荧光定量PCR方法的引物及探针

 

<130>  3

 

<160>  3    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

ggaggtacaa taggtgaa                                                   18

 

 

<210>  2

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

ggagcagata attcttcaa                                                  19

 

 

<210>  3

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

aactgctgga tcttgtctat tatctaa                                         27