产蛋白酶的菌株、制备蛋白酶液的方法及使用该酶液于改善低次等烟叶品质

摘要

本发明公开了一种利用细菌发酵蛋白酶液改善低次等烟叶品质的方法。按以下步骤进行：1)细菌发酵蛋白酶液的制备：①产蛋白酶的芽孢杆菌菌种经LB培养基活化后接入灭菌的种子培养基，于37℃、150rpm恒温摇床培养12h，按1∶100的比例转接于1L摇瓶中发酵60h制得发酵蛋白酶液；②发酵蛋白酶液的加工：发酵好的蛋白酶液经0.22μm中空纤维管过滤除菌，10000MWCO超滤浓缩制得粗酶液；2)改善低次等烟叶品质：粗酶液按一定2％的比例均匀地喷施于烟丝，置于自封袋中室温下作用12h，90℃、30min使酶失活，置于22℃，相对湿度55％的恒温恒湿箱平衡烟丝水分24h。感官评吸结果显示，此菌株发酵的蛋白酶液可以改善烟叶香气质，杂气减轻，质感、口感较好，烟叶品质明显改善。

说明书

技术领域

本发明涉及一株产蛋白酶的细菌菌株、制备蛋白酶液方法及使用其蛋白酶液改善低次等烟叶品质，具体地说是利用来自烟叶上的优势菌株发酵蛋白酶液改善低次等烟叶品质的方法。 

背景技术

我国是烤烟生产和消费大国，烤烟生产在烟草的发展中占据重要地位。目前我国烟叶质量与生产水平同国际先进水平相比，仍然有较大差距，还远不能满足提高国内卷烟质量和扩大出口的需要。提高烟叶品质和可用性直接关系到我国烟草行业持续、稳定、健康发展，也是增强我国烟叶国际市场竞争力的必由之路。 

由于烟的品种、种植和烘烤等原因，我国烤烟蛋白质、淀粉等大分子物质含量往往偏高。蛋白质含量与烟叶品质优劣存在紧密相关性，蛋白质含量过高，不仅会降低烟制品的燃烧性，而且有似烧焦羽毛的臭味，同时伴有辛辣、苦涩的感觉。此外会使烟气中有害成分如HCN等含量增加，严重影响烟叶的香味品质和吸食安全性。另一方面烟叶蛋白质水解产物可以进一步转化生成有利于烟叶品质的致香物质。因此，降低烟叶中蛋白质含量对改善烟叶品质、提高烟叶可用性和吸食安全性极为重要。 

在蛋白酶催化作用下烟叶上的蛋白质可以被水解为氨基酸等小分子物质，不但降解了蛋白质，且水解产物和进一步转化的产物又可以产生烟草致香物质。蛋白酶来源即可购买商品酶也利用微生物发酵制备，但商品酶价格较高，这无形中增加了卷烟成本，而利用细菌发酵蛋白酶液操作方便且工艺简单。 

发明内容

本发明的目的是提供一株产蛋白酶的细菌菌株及利用细菌发酵蛋白酶液，使用经过滤除菌及超滤浓缩液作为改善低次等烟叶品质的方法。 

本发明的技术方案如下：一株短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）0855-9菌株，菌株保藏号是（CGMCC No. 5310），保藏单位: 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心, 保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期:  2011年9月29日,该菌株分离自醇化烟叶，产蛋白酶能力较强。 

该0855-9菌株筛选培养基采用酪蛋白琼脂培养基：酪蛋白10g，牛肉膏3g，Na₂HP0₄2g，NaCl 5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，0.4％溴麝香草酚蓝溶液12.5mL，pH7.4，观察水解圈产生情况，复筛采用福林-酚法测定蛋白酶的酶活。 

细菌发酵制备蛋白酶液具体步骤为： 

①芽孢杆菌的活化和培养：该芽孢杆菌的菌株保藏号是(CGMCC No.5310)，经LB培养基活化后接入灭菌的种子培养基，于37℃、150rpm恒温摇床培养12h，按1∶100的比例 转接于1L摇瓶中发酵60h制得发酵蛋白酶液； 

②发酵蛋白酶液的加工：发酵好的蛋白酶液经0.22μm中空纤维管过滤除菌，再经10000MWCO超滤浓缩制得粗酶液； 

以上所述的种子培养基及发酵培养基均是LB培养基，其主要组分为：NaCl 10g，酵母粉5g，胰蛋白胨10g，加蒸馏水至1000ml，用NaOH溶液调节pH值至7.0，121℃高压灭菌20min。 

酶活性测定：细菌发酵蛋白酶液采用福林-酚法测定酶活性，其活力单位定义(U)：在37℃每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，定义为1个酶活力单位。 

使用制备的蛋白酶液作为改善低次等烟叶步骤是： 

将上部烟叶回潮后抽去烟梗，切丝，称取一定量的烟丝，分为两份；其中一份烟丝在室温下(24℃左右)按2％的比例均匀地喷施值得的粗酶液和蒸馏水，置于自封袋中在室温下使酶作用12h；然后于90℃条件下烘干30mins使酶失活，置于22℃、相对湿度55％的恒温恒湿箱平衡烟丝水分24h；以此烟丝为单一原料卷烟后进行评吸鉴定，另一份烟丝作为该组比对参照物使用。 

本发明菌株发酵的蛋白酶液可以改善烟叶香气质，杂气减轻，质感、口感较好，烟叶品质明显改善。烟草科技工作者研究表明烟叶上微生物所产酶能促进烟叶上大分子物质的转化，有利于提高烟叶品质，所以利用分离自烟叶的产酶菌株发酵蛋白酶液改善低次等烟叶品质有重要的研究价值，为利用细菌发酵酶液改善烟叶品质、提高烟叶可用性提供了一种途径。 

附图说明

图1：蛋白酶酶活测定标准曲线。 

具体实施方式

本发明的发酵蛋白酶液来源：产酶菌株是短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)0855-9菌株，菌株保藏号是(CGMCC No.5310)。该菌株分离自醇化烟叶，产蛋白酶能力较强，能有效地改善烟叶品质。 

1、细菌发酵蛋白酶液的制备： 

①芽孢杆菌的活化和培养：该芽孢杆菌的菌株保藏号是(CGMCC No.5310)，经LB培养基活化后接入灭菌的种子培养基，于37℃、150rpm恒温摇床培养12h，按1∶100的比例转接于1L摇瓶中发酵60h制得发酵蛋白酶液。 

以上所述的种子培养基及发酵培养基均是LB培养基，其主要组分为：NaCl 10g，酵母粉5g，胰蛋白胨10g，加蒸馏水至1000ml，用NaOH溶液调节pH值至7.0，121℃高压灭菌20min。 

②发酵蛋白酶液的加工：发酵好的蛋白酶液经0.22μm中空纤维管过滤除菌，再经10000MWCO超滤浓缩制得粗酶液。 

2、酶活性测定： 

细菌发酵蛋白酶液采用福林-酚法测定酶活性，其活力单位定义(U)：在37℃每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，定义为1个酶活力单位。 

3、改善低次等烟叶品质的方法 

将上部烟叶回潮后抽去烟梗，切丝，称取一定量的烟丝，分为两份。在室温下(24℃左右)按2％的比例均匀地喷施值得的粗酶液和蒸馏水，置于自封袋中在室温下使酶作用12h；然后于90℃条件下烘干30mins使酶失活，置于22℃、相对湿度55％的恒温恒湿箱平衡烟丝水分24h；以此烟丝为单一原料卷烟后进行评吸鉴定。 

实施例1：产蛋白酶菌株的筛选及鉴定 

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)0855-9菌株，菌株保藏号是(CGMCC No.5310)，分离自优质品种红大自然醇化烟叶上。菌株筛选培养基采用酪蛋白琼脂培养基(酪蛋白10g，牛肉膏3g，Na₂HPO₄ 2g，NaCl 5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，0.4％溴麝香草酚蓝溶液12.5mL，pH7.4)，观察水解圈产生情况，复筛采用福林-酚法测定蛋白酶的酶活。 

利用16S rRNA基因的一对通用引物进行PCR扩增，连接载体转化并进行测序，结果提交NCBI，通过BLAST进行序列同源性检索分析，然后用CLUSTAL X软件进行多序列比对并计算供试菌株与参比菌株之间的序列相似性，采用邻位相接法，应用MEGA4软件构建系统进化树。对该菌株进行测序分析，将其初步鉴定为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)0855-9菌株，菌株保藏号是(CGMCC No.5310)。 

实施例2：蛋白酶粗酶液的制备 

发酵蛋白酶来源为菌株保藏号为(CGMCC No.5310)短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)0855-9菌株，经LB培养基活化后接入灭菌的种子培养基，于37℃150rpm恒温摇床培养12h，按1∶100的比例转接于1L摇瓶中发酵60h制得发酵蛋白酶液。以上所述的种子培养基及发酵培养基均是LB培养基，其主要组分为：NaCl 10g，酵母粉5g，胰蛋白胨10g，加蒸馏水至1000ml，用NaOH溶液调节pH值至7.0，121℃高压灭菌20min。发酵好的蛋白酶液经0.22μm中空纤维管过滤除菌，再经10000MWCO超滤浓缩制得粗酶液。 

细菌发酵蛋白酶液采用福林-酚法测定酶活性，其活力单位定义(U)：在37℃每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，定义为1个酶活力单位。首先制备酪氨酸标准曲线(图1)，然后将含有蛋白酶的发酵液用pH7.2，50mmol/L的磷酸盐缓冲液经适当的稀释后，取稀释的酶液100ul在37℃下保温2min，加入2％干酪素100ul，37℃下保温10min后，加入0.4mol/L的三氯乙酸终止反应，继续保温15min使残余蛋白沉淀完全，13000rpm离心1min，取上清液100ul，然后加入0.4mol/L的碳酸钠500ul，福林酚试剂100ul混匀后，于37℃发色10min，用分光光 度计测定660nm处的吸光值。同时做一份空白对照，唯在添加2％干酪素之前先加三氯乙酸使酶失活，测定660nm处的吸光值。 

实施例3：蛋白酶粗酶液改善低次等烟叶品质的方法 

将上部烟叶回潮后抽去烟梗，切丝，称取50克的烟丝，分为两份。在室温下(24℃左右)按2％的比例均匀地喷施值得的粗酶液和蒸馏水，0855-9发酵酶液的施酶量为48U/g烟叶，置于自封袋中在室温下使酶作用12h，然后于90℃条件下烘干30min使酶失活，置于22℃、相对湿度55％的恒温恒湿箱平衡烟丝水分24h。 

以平衡好的烟丝为单一原料卷烟后进行评吸鉴定，由红塔集团技术中心评吸员完成评吸，采用《玉溪优质烤烟单料烟感官质量评吸方法》(云南省地方标准，标准编号DB53/T182.3-2006)(表1)。 

从评析结果可以看出(表2)：对照烟气浓度较高，杂气显，回味稍差，酸、涩，略有毛刺感，质粗糙；LB发酵培养基对烟叶感官质量无不良影响，也没有改善烟叶品质，所以LB发酵培养基不影响蛋白酶液处理烟叶的结果。评吸结果表明，该菌株发酵的蛋白酶液对烟叶品质的改善较为明显，表现为香气质改善，杂气减轻，质感、口感均较好，劲头略有下降，刺激性有所改善。 

表1：红塔集团单体烟叶感观质量评价方法及指标 

表2：0855-9菌株处理烟丝评吸结果