用于检测β-受体兴奋剂的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒

摘要

本发明公开了一种能识别β-受体兴奋剂的单克隆抗体，所述单克隆抗体是由杂交瘤细胞Sal所分泌的，该杂交瘤细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C201187。本发明还公开了用于检测β-受体兴奋剂的酶联免疫方法和试剂盒及其在β-受体兴奋剂检测中的应用。与现有技术相比，本发明制备的单克隆抗体能够识别8种β-受体兴奋剂类药物，识别范围广，本发明制备的单克隆抗体、酶联免疫试剂盒以及提供的酶联免疫方法灵敏度高，能检测更低浓度的β-受体兴奋剂残留。

说明书

技术领域

本发明属于兽药残留分析和免疫学技术领域，具体涉及一种能识别8种 β-受体兴奋剂的单克隆抗体及酶联免疫方法和试剂盒。

背景技术

β－受体兴奋剂是一组结构和生理功能类似肾上腺素和去甲肾上腺素 的苯乙醇胺类衍生物，能与动物体内大多数组织细胞上的β-肾上腺素 能受体结合，并激活β-肾上腺素能受体，从而加速细胞内脂肪的分解 和游离脂肪酸的氧化．因此，β－受体兴奋剂的主要功效是促进动物 肌肉组织的增长，减少胴体脂肪的含量，提高瘦肉率．与此同时，可 以不同程度的提高生长速度和饲料利用率。欧盟和其他一些国家和地 区立法禁止使用β－受体兴奋剂，我国农业部第235号公告规定禁止在 动物性食品中使用。

有效控制β-受体兴奋剂类药物滥用和残留，检测方法是关键。国内外 文献中关于β-受体兴奋剂残留检测方法，虽然仪器检测的灵敏度和准 确度越来越优化和提高，但是有其难以避免的缺陷，有的提取方法繁 琐，有的采用的仪器设备一般实验室少有配备（如超临界萃取），并 且检测所需时间长，不利于大批量样品的筛选，不能快速的在现场进 行检测。酶联免疫分析方法(ELISA)可以克服仪器分析的缺陷，是一种 有效的大批量残留筛选方法，在此类药物上的应用有着很大的发展前 景。酶联免疫分析法是将抗原抗体反应与现代测试手段结合的超微量 分析法，集现代测试方法的高灵敏度和抗原–抗体反应的强特异性于 一体（李俊锁等，2002）。相对于仪器分析法，免疫学分析法具有操 作简单、快速、灵敏度高、特异性强、检测费用低等优点，适用于大 批量样品的初筛。

Guy等(1993)将沙丁胺醇与牛血清蛋白结合制备完全抗原，免疫新西兰 大白兔后得到对沙丁胺醇等5种β-受体兴奋剂类药物偶交叉反应的多 克隆抗体，其建立的酶免疫方法检测尿液样品中沙丁胺醇含量，最低 检测限为0.14ng。Lei等（2008）用沙丁胺醇为半抗原制备的单克隆抗 体对沙丁胺醇、克伦特罗、特布他林、肾上腺素有交叉反应，建立的 ELISA方法最低检测限可达0.052ng/mL。上述研究中多克隆抗体的灵敏 度较高，但不利于标准化；单克隆抗体虽利于标准化生产，但是灵敏 度又不够，且检测的药物种类有限。因此，制备一种灵敏度高的能用 于检测多种β-受体兴奋剂的单克隆抗体和酶联免疫试剂盒，并建立相 应的ELISA检测方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种能识别八种β-受体兴奋剂（克伦特罗、沙丁 胺醇、西马特罗、马布特罗、克伦丙罗、马喷特罗、特布他林和妥洛 特罗）的单克隆抗体以及酶联免疫方法和试剂盒，本发明还提供所述 单克隆抗体在制备检测β-受体兴奋剂的酶联免疫试剂盒中的应用以及 酶联免疫方法和试剂盒在β-受体兴奋剂检测中的应用。

上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种能识别β-受体兴奋剂的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO :C201187的杂交瘤细胞Sal所分泌的。

所述的杂交瘤细胞Sal，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为C CTCC NO:C201187。

所述的单克隆抗体在制备检测β-受体兴奋剂的酶联免疫试剂盒中的应 用。

包含所述的单克隆抗体的试剂盒。

所述试剂盒是用于检测β-受体兴奋剂的酶联免疫试剂盒。

所述的试剂盒在β-受体兴奋剂检测中的应用。

进一步，本发明提供了一种检测β-受体兴奋剂的酶联免疫方法，包括 以下步骤：

（1）将半抗原琥珀酸酐沙丁胺醇（SAL-SA）与牛血清白蛋白（BSA） 偶联得到免疫原（SAL-SA-BSA）；

（2）将半抗原对氨基苯甲酸沙丁胺醇（SAL-ABA）与卵清蛋白（OVA） 偶联得到包被原（SAL-ABA-OVA）；

（3）利用步骤（1）的免疫原制备得到保藏号为CCTCC NO:C201187的 杂交瘤细胞Sal；

（4）利用保藏号为CCTCC NO:C201187的杂交瘤细胞Sal制备单克隆抗 体；

（5）用步骤（2）的包被原包被固相载体；

（6）样品前处理：猪尿样品加乙腈处理离心后取上清；猪肉样品经酸 处理后用乙酸乙酯反萃，再取乙酸乙酯层氮气吹干，残渣复溶后离心 取上清，得待测物；

（7）对步骤（6）的待测物进行检测。

所述的酶联免疫方法在β-受体兴奋剂检测中的应用。

本发明的有益效果是：

1．本发明制备的单克隆抗体能够识别8种β-受体兴奋剂类药物，识别 范围广；

2. 本发明制备的单克隆抗体、酶联免疫试剂盒以及建立的酶联免疫 方法灵敏度高，能检测更低浓度的β-受体兴奋剂类残留，同时具有精 密度高、灵敏度好的特点。

附图说明

图1为本发明的技术路线图。

图2为本发明的以克伦特罗为标准品的间接竞争ELISA反应标准曲线， X轴为克伦特罗（CL）标准溶液浓度对数值，Y轴为克伦特罗标准品溶 液的光密度值除以“零”孔光密度值（B/B₀）。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。

实施例1 免疫原和包被原的制备

1.1 沙丁胺醇免疫半抗原（SAL-SA）的合成

沙丁胺醇免疫半抗原（SAL-SA）依如下路线合成：称取沙丁胺醇碱80 mg（0.33 mmol）用10mL甲醇溶解，旋转蒸发为黄色油状物，再加16 mL无水乙醇溶解，并不断搅拌，然后逐滴加入丁二酸酐36mg（溶于吡 啶溶液中，0.36mmol）。出现白色混浊后，用薄层色谱检测琥珀酸酐 的结构。在室温条件下反应3h后，停止搅拌，2750r/min离心15min， 弃去上清液，用无水乙醇洗涤沉淀物3次，蒸干溶剂所得白色固体即为 半抗原SAL-SA。

1.2 沙丁胺醇免疫原（SAL-SA-BSA）的制备

将SAL-SA 40mg溶于2mL N，N－二甲基甲酰胺（DMF），1mL 1,4-二 氧六环、30μL三正丁胺的混合溶液中，室温下搅拌30min，冰浴中加 入氯甲酸异丁脂30μL，4℃搅拌反应5h得到A液。准确称取BSA 86mg ，使其充分溶解在25mL硼酸盐缓冲溶液（pH8.5）中为B液。冰浴中， 磁力搅拌下将A液缓慢滴加到B液中，4℃下搅拌反应过夜，之后装入透 析袋，在pH7.4磷酸盐缓冲液中透析72h，期间换透析液6次。低压冻干 ，即得偶联物SAL-SA-BSA，置-20℃保存，作为免疫原用。

1.3 沙丁胺醇包被半抗原（SAL-ABA）的合成

沙丁胺醇包被半抗原（SAL-ABA）依如下路线合成。称取对氨基苯甲酸 137mg，溶于3mL 1mol/L的HCl中，冰浴搅拌。称取NaNO₂ 160mg溶于1 mL超纯水中，低速搅拌状态下，将NaNO₂溶液每次100μL每隔15s滴加 到对氨基苯甲酸溶液中，用TLC监测反应。称取沙丁胺醇240mg，溶于 5mL硼酸盐缓冲液（0.05mol/L）中，待上述反应结束，将沙丁胺醇溶 液逐 滴加入，反应过夜，得到深红色半抗原溶液。

1.4 沙丁胺醇包被原（SAL-ABA-OVA）的合成

取SAL-ABA 3mL，加入40μL三正丁胺，冰浴搅拌15min后，加入40μ L氯甲酸异丁酯，活化反应5.5h得到A液。称取OVA 46mg溶于20 mL  pH9.6的碳酸盐缓冲溶液中为B液。将A液缓慢加入B液中，冰浴搅拌反 应8h，之后装入透析袋，在pH7.4磷酸盐缓冲液中透析72h，期间换透 析液6次。低压冻干，既得偶联物SAL-ABA-OVA，置-20℃保存。作为包 被原用。

实施例2 单克隆抗体的制备

2.1 小鼠免疫

参照薛庆善《体外培养的原理与技术》科学出版社 2001年版中的方 法：以实施例1制备的SAL-SA–BSA偶联物为免疫原，免疫Balb/C雌性 小鼠。免疫程序采用一次基础免疫及数次加强免疫。首次免疫时用与 等体积的弗氏完全佐剂乳化的含100μg免疫原的蛋白乳液注射于小鼠 的颈背部皮下进行基础免疫，以后每隔15天用弗氏不完全佐剂乳化的 含100μg免疫原的蛋白乳液进行加强免疫。从免疫三次起，每次免疫 后第8天采尾血，分离血清，间接ELISA法检测血清抗体效价。免疫合 格的小鼠（效价高、灵敏度好）停止免疫以备融合。

2.2 细胞融合与筛选

在融合前3天（最好与上次免疫相隔3周以上）给免疫合格的小鼠腹腔 注射含100μg免疫原的蛋白溶液（不加佐剂），强化免疫。根据骨髓 瘤细胞的计数结果，取3～5×10⁷个骨髓瘤细胞与免疫脾细胞混合（比 例为1:10～5:10）。1500r/min离心5min，将离心管上清倒尽后，倒扣 在吸水纸上，控干水滴。轻轻地敲击管底，使管底细胞成糊状，将其 放置于37℃水浴中，将吸有0.8mL预温至37℃的50% 聚乙二醇（PEG， 购自Amersco）的lmL刻度吸管插入到管底，60sec内缓缓加PEG到混合 细胞上，边加边轻轻搅拌，加完后静置90sec，将离心管插到离心管架 上。移走水浴杯，用吸管吸取10mL预温至37℃的RPMI–1640基础培养 液（购自Hyclone）沿管壁缓缓加到融合细胞上，边加边轻轻晃动离心 管，第1分钟逐滴加入1mL（3sec/滴），第2分钟再加2mL，最后加完剩 下的7mL（5min内加完）。加完第一个10mL后，接着沿管壁补加RPMI– 1640培养基至50mL，加完后拧紧盖，缓慢颠倒几次，混匀。1500r/mi n离心5min，弃去上清，用含有饲养细胞的72mL HAT完全培养基轻轻 将融合细胞搅拌重悬。将融合细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，2滴 /孔。一次融合可接种5块96孔细胞培养板，置于37℃ 5%CO₂培养箱中 培养。从融合当天算起为0d，前面3d尽量不要动细胞板，保持培养箱 内环境稳定。 第3d每孔补加1滴HAT完全培养基（购自Amersco）并观察集落生长情况 ；第5d每孔吸出l/2培养上清（100μL），再加入1滴HT完全培养基（ 购自Amersco）；以后每隔3d同上法吸去l/2培养上清，换入HT完全培 养基。根据细胞的生长情况，当细胞生长至占孔底面积1/4左右即可取 细胞培养上清，以发明人制备的SAL-ABA–OVA偶联物为包被原，利用 ELISA方法筛选出分泌β-受体兴奋剂类抗体的阳性细胞孔。对筛选出 来的阳性细胞孔利用有限稀释法连续3次克隆化，最终建立一株稳定分 泌抗β-受体兴奋剂类抗体的杂交瘤细胞株， 对该杂交瘤细胞株进行 染色体计数平均值为103.3条，高于亲本细胞的染色体数目（SP2/0骨 髓瘤细胞的染色体平均数为58条，脾细胞染色体为40条），说明融合 细胞的确是SP2/0骨髓瘤细胞与脾细胞的杂交产物。申请人将该杂交瘤 细胞命名为Sal，并于2011年9月8日送交位于湖北省武汉市武汉大学内 的中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，其保藏号为CCTCC NO∶ C201187。

2.3 腹水单抗制备与鉴定

在接种前7天取Balb/c小鼠数只，每只小鼠腹腔注射0.5ml弗氏不完全 佐剂进行预处理。用RPMI–1640基础培养基悬浮细胞并将细胞数调至 1×10⁶个/mL，每只小鼠腹腔接种0.5ml。待小鼠腹部明显膨大，精神 变差，濒死不动时采集腹水，纯化获得单克隆抗体。以鼠单克隆抗体 快速ELISA同型检测试剂盒确定单克隆抗体为IgG1κ亚型。

实施例3 间接竞争ELISA检测方法的建立

3.1 试剂配制

碳酸盐缓冲液（pH9.6）：准确称取Na₂CO₃ 1.59g、NaHCO₃ 2.93g， 少量超纯水溶解，定容至1000mL。

洗涤液(pH7.4)：准确称取NaCl 8.00g，KH₂PO₄ 0.20g，Na₂HPO₄·12 H₂O 2.90g，KCl 0.20g，少量超纯水溶解，加入Tween 20 0.50m L，定容至1000mL。

磷酸盐缓冲液(pH7.4)：准确称取NaCl 8.00g，KH₂PO₄ 0.20g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.90g，KCl 0.20g，少量超纯水溶解，定容至1000mL 。

封闭液：准确称取卵清蛋白10.00g，加入磷酸盐缓冲液1000mL，搅拌 混匀直至蛋白完全溶解。

底物混合液：准确吸取底物B液（购自武汉市飞远科技有限公司）10m L，加入100μL底物A液（购自武汉市飞远科技有限公司），混匀，现 配现用。

终止液：准确量取浓硫酸100mL，缓慢滴加到800mL超纯水中。

3.2 方阵滴定法

采用方阵滴定初步选择包被原浓度和抗体稀释度。使用碳酸盐缓冲液 将SAL-ABA-OVA包被原倍比稀释成80、40、20、10、5、2.5、1.25μg /mL，从第一至第七行依次横向加入96孔酶 标板，4℃过夜；洗涤3次，拍干，加入封闭液250μL，37℃封闭2h； 洗涤3次，拍干，单克隆抗体使用磷酸盐缓冲液倍比稀释成1:1000、1 :2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000， 从第一至第八列依次纵向加入96孔酶标板加入酶标板，37℃孵育30mi n；洗涤3次，拍干，各孔加入用磷酸盐缓冲液1:5000稀释的辣根过氧 化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体（简称二抗，以下所指二抗均为辣根过氧 化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体，购自武汉飞羿生物技术有限公司）100 μL，37℃孵育30min；洗涤4次，拍干，各孔加入底物混合液100μL， 避光显色15min；加入终止液50μL；用自动酶标仪在450nm波长处测定 光密度值（OD值）。方阵滴定结果见表1，初步选择几个OD值接近2.0 ，且相邻两孔OD值有较大变化的包被浓度及对应的抗体稀释度组合。 结果表明，可选择以下包被原浓度和抗体稀释度组合：（5，16000） 和（10，32000）。

表1单克隆抗体方阵滴定

3.3 最佳包被浓度的选择

以克伦特罗为竞争物，设置为0、0.05、0.1、0.4、0.8、1.6μg/L浓 度梯度，分别以3.2方阵滴定法选择的包被浓度及对应的抗体稀释度组 合进行间接竞争ELISA。以竞争物浓度的对数值作为横坐标、B/B0（以 无药物抑制时的OD值为B0，相应浓度药物抑制时的OD值为B值）作为纵 坐标绘制抑制曲线。结果见表2，以“0”孔OD值和IC₅₀值作为判定指标 ，确定最佳包被原浓度。由数据可见，最佳包被浓度为10μg/mL，抗 体稀释度初步确定为1: 32000。

表2 最佳包被浓度优化

包被原浓度（μg/mL） 抗体系数倍数（1:X） 0孔OD值 IC₅₀值（μg/L） 5 16000 2.324 0.78 10 32000 1.773 0.49

3.4 最佳抗体稀释度的选择

以最佳包被浓度包被酶标板，将抗体以1: 30000为中心浓度等差设计 几个稀释梯度，其 0孔与IC₅₀值见表3。随着抗体稀释度的增加，IC₅₀值降低，但是“0”孔 值接近2.0，当0孔值过低时其IC₅₀值反而升高，因此选择1: 28000为 最佳抗体稀释度。

表3最佳抗体稀释度优化

抗体系数倍数（1:X） 0孔OD值 IC₅₀值（μg/L） 28000 1.894 0.47 30000 1.654 0.43 32000 1.488 0.38

3.5 标准曲线的建立

将克伦特罗标准品配制成0、0.05、0.1、0.4、0.8、1.6 μg/L等6个 浓度梯度，按照优化后的间接竞争ELISA条件测定，绘制标准曲线（见 附图2），重复5次。间接竞争ELISA检测方法的回归方程和相关指数为 ：y＝－2.2231x＋2.7328，r²＝0.9962，IC₅₀值为0.46±0.075μg/L（ n＝5），线性范围为0.05～1.6 μg/L。

3.6 交叉反应实验

分别将各种β-受体兴奋剂类药物标准品倍比稀释成浓度梯度进行间接 竞争ELISA，绘制标准曲线，计算IC₅₀值，与克伦特罗标准品IC₅₀值对比 得到交叉反应率，结果见表4。该单克隆抗体对8种β-受体兴奋剂类有 识别能力。

表4 单克隆抗体对β-受体兴奋剂类药物的交叉反应率

药物 IC₅₀(μg/L) 交叉反应率（%） 克伦特罗 0.46 100 沙丁胺醇 0.86 53.5 西马特罗 0.55 83.6 马布特罗 0.46 100 克伦丙罗 0.64 71.8 马喷特罗 1.04 44.2 妥洛特罗 7.3 6.3 特布他林 20.0 2.3 莱克多巴胺 ＞10000 ＜0.005 多巴胺 ＞10000 ＜0.005 异丙肾上腺素 ＞100 ＜0.46 利托君 ＞100 ＜0.46 马波特罗 ＞10000 ＜0.005 非诺特罗 ＞100 ＜0.46

实施例4：本发明ELISA检测试剂盒的组装

4.1试剂盒组成：

⑴ 包被有包被原SAL-ABA–OVA的酶标板；

⑵ 克伦特罗标准品溶液6瓶，浓度分别为0、0.05、0.1、0.4、0.8、 1.6 μg/L；

⑶杂交瘤细胞Sal单克隆抗体工作液；

⑷ 辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG抗体工作液；

⑸ 浓缩磷酸盐缓冲液：NaCl 80.0g，KH₂PO₄ 2.0g，Na₂HPO₄·12 H₂O 29.0g，KCl 2.0g，加双蒸水至1000mL；

⑹ 浓缩洗涤液：NaCl 80.0g，KH₂PO₄ 2.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 2 9.0g，KCl 2.0g，Tween-20 5mL，加双蒸水至1000mL

⑺ 底物混合液：准确吸取底物B液（购自武汉市飞远科技有限公司） 10mL，加入100μL底物A液（购自武汉市飞远科技有限公司），混匀， 现配现用。

⑼ 终止液：2mol/L硫酸溶液。

4.2酶标板的制备：

⑴ 包被：用碳酸盐缓冲液将SAL-ABA–OVA稀释成10μg/mL包被原溶 液，准确吸取100μL包被原溶液于各酶标孔，水平放置于湿盒，4℃孵 育12h。

⑵ 洗板：甩出酶标板内包被原溶液，拍干，准确吸取250μL洗涤液 于各酶标孔，静置30s后，甩出洗涤液，在吸水纸上拍干；重复洗涤3 次。

⑶ 封闭：准确吸取250μL封闭液于各酶标孔，水平置于湿盒内，37 ℃培养箱孵育2h。

⑷ 洗板：甩出封闭液，准确吸取250μL洗涤液于各酶标孔，静置30 s后，甩出洗涤液，在吸水纸上拍干；重复洗涤3次。

⑸烘干：在吸水纸上拍干后；将酶标板于37℃培养箱中倒置烘干0.5h 。

⑹封装：酶标板烘干后和干燥剂一起装入铝箔袋，用真空封装机封装 。所述的干燥剂为硅胶或无水氯化钙其中的一种。

实施例5：试剂盒在动物可食性组织中β-受体兴奋剂残留检测中的应 用

5.1试剂配制

0.05mol/L 盐酸：准确量取浓盐酸4.1 mL，加入适量去离子水中混 匀，定容至1000mL，即为0.05 mol/L盐酸。

样品提取液：0.05 mol/L 盐酸: 乙腈=6:4。

洗涤液：将试剂盒中提供的浓缩洗涤液液用去离子水10倍稀释，置4℃ 冰箱保存备用。

样本稀释液：将试剂盒中提供的浓缩样本稀释液用去离子水5倍稀释， 置4℃冰箱保存备用。

5.2组织样品处理

猪尿样品 取1mL澄清猪尿（若尿液混浊，4000r/min离心10min后再取 样）于10mL离心管中，加乙腈50uL，漩涡1min；4000r/min离心5min， 取上清液检测。

猪肉样品 称取均质猪肉2.0±0.01g于50mL塑料离心管中，加入6mL样 品提取液，涡旋1min；4000r/min 离心20min，取3mL上层液于10mL塑 料离心管中，加入4mL乙酸乙酯于10mL塑料离心管，涡旋30S，4000r/ min 离心10min。取乙酸乙酯层于30-50℃氮气吹干。加入1mL 样品 稀释液，涡旋30S，再加1mL 正己烷涡旋30S，4000r/min 离心10mi n，取下层检测。

本方法对猪尿和猪肉样品的稀释倍数为1。

5.3  ELISA测定程序

⑴ 取出试剂盒，平衡至室温，将足够标准品和样品所用数量的孔条 插入微孔架。

⑵ 加克伦特罗标准品溶液或样品液50μL到各自微孔中；标准品和样 品做两个平行实验，记录下标准品和样品的位置。加抗体液50μL至各 孔，充分混合；水平置湿盒内，37 ℃孵育60min。

⑶ 甩净孔中液体，在吸水纸上拍干。准确吸取洗涤液250μL于各孔 ，静置30秒左右，甩净洗涤液，在吸水纸上拍干。重复洗涤4次。

⑷ 加辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG抗体工作液100μL至 各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育60min。

⑸ 甩净孔中液体，在吸水纸上拍干。准确吸取洗涤液250μL于各孔 ，静置30秒左右，甩净洗涤液，在吸水纸上拍干。重复洗涤5次。

⑹ 加底物混合液100μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵 育15min。

⑺ 加终止液50μL至各孔；充分混合；30min内在450nm处测量吸光值 。

5.4 结果判定

将标准液或样品液吸光值的平均值除以“0”标准孔的吸光值再乘以1 00 %，即为抑制率。在0.05~1.6μg/L范围内，以抑制率为纵坐标， 标准液浓度的对数为横坐标绘制标准曲线，得到回归方程。按照公式 1计算样品的抑制率，将抑制率代入回归方程，计算出测定浓度，乘以 稀释系数，即为样品中β-受体兴奋剂的残留浓度。

 （公式1）

实施例6：本发明试剂盒的灵敏度、精密度、准确度

6.1本发明试剂盒的灵敏度

以最低检测限作为本发明试剂盒的灵敏度指标。分别取均质空白组织 样品（猪尿和猪肉）各20份，样品处理后ELISA测定。将测定的OD值代 入标准曲线，计算空白样品的测定浓度、平均值及标准差。根据公式 + 3SD，得到克伦特罗在各组织样品的最低检测限，沙丁胺醇在各组 织的最低检测限可根据交叉反应率算出，结果见表5。本试剂盒对克伦 特罗在猪尿和猪肉中的最低检测限分别为0.13μg/kg和0.16μg/kg， 沙丁胺醇在在猪尿和猪肉中的最低检测限分别为0.24μg/kg和0.30μ g/kg。

表5 试剂盒对各组织的最低检测限

6.2本发明试剂盒的精密度

分别将0、0.05、0.1、0.4、0.8、1.6μg/L克伦特罗标准品浓度对应 的OD值代入其标准曲线方程求出ELISA检测的测定值，以标准品浓度测 定值计算间接竞争ELISA标准曲线的板内板间变异系数，结果见表6。 结果表明，标准曲线的板内及板间变异系数均＜15%，说明本研究建立 的间接竞争ELISA方法具有较好的精密度。

表6 标准曲线的板内与板间变异系数

6.3本发明试剂盒的准确度

试剂盒的准确度用添加回收率来表示。将克伦特罗和沙丁胺醇在猪肉 和猪尿中分别添加，使其浓度达到0.5 μg/kg和1.0 μg/kg，样品 前处理后用本试剂盒进行测定，每批5个重复，重复测定3批，计算回 收率和变异性。结果（见表7-表10）显示，本试剂盒在各组织的回收 率均在69.8%～118.6%范围内，批内与批间变异系数＜22.3%。

表7 猪肉中克伦特罗添加回收率与变异系数

表8 猪肉中沙丁胺醇添加回收率与变异系数

表9 猪尿中克伦特罗添加回收率与变异系数

表10 猪尿中沙丁胺醇添加回收率与变异系数