异常汉逊酵母菌在制备柑橘实蝇类引诱饵剂中的应用

摘要

本发明公开了一种异常汉逊酵母菌（Hansenulaanomala）在制备柑橘实蝇类引诱饵剂中的应用。本发明还公开了一种柑橘实蝇类引诱饵剂，由异常汉逊酵母菌水解发酵液和辅助饵剂组成，所述辅助饵剂为多价蛋白胨、红糖、食醋或醋酸铵、防腐剂、水的组合物或糖醋液。本发明的柑橘实蝇类引诱饵剂对柑橘大实蝇和橘小实蝇的引诱效果好，并且对柑橘大实蝇和橘小实蝇的雌虫和雄虫均有良好的引诱效果，且安全无毒、无残留、对人和其它有益昆虫无害。

说明书

技术领域

本发明属于柑橘害虫防治领域，具体涉及一种异常汉逊酵母菌（Hansenula anomala）在制备柑橘实蝇类引诱饵剂中的应用，本发明还涉及柑橘实蝇类引诱饵剂。 

背景技术

柑橘大实蝇Bactrocera ( Tetradacus ) minax，又名橘大实蝇，属双翅目，实蝇科，寡鬃实蝇亚科，俗称“柑蛆”，是柑橘的一种毁灭性害虫。柑橘大实蝇一年发生一代，被害果实称为蛆果或蛆柑。柑橘大实蝇以蛹在土壤中越冬，一般于5月中下旬开始羽化出土。成虫性成熟后，飞往橘树上交尾产卵,雌成虫产卵于果实的内皮层，一般每个产卵孔里有卵13-17粒，最多可达35粒。被害果由硬变软且有弹性，未熟先黄，多数脱落、腐烂。 

由于柑橘大实蝇成虫产卵于果实内，幼虫在柑橘果内蛀食为害，所以喷施药剂很难达到杀虫效果，而且化学农药对人和其他益虫有毒，易产生农药残留和害虫的抗药性。成虫诱杀技术是柑橘大实蝇综合防控的重要环节之一，目前，柑橘大实蝇的引诱饵剂主要有糖醋混合饵剂和蛋白饵剂，对柑橘大实蝇引诱效果有限。 

柑橘小实蝇 (Bactrocera dorsails Hendel)，又名橘小实蝇，属双翅目实蝇科果实蝇属，又名东方果实蝇，危害杨桃、番石榴、柑橘、芒果、香蕉，芭蕉、葡萄和瓜类等250多种蔬菜和水果，是一种世界性的检疫害虫，同时也是我国重要的农业性有害生物。橘小实蝇在我国一年大约发生3-6代，无严格的越冬过程，世代重叠，导致同一地区各种虫态并存，给橘小实蝇的综合防治带来很多困难。 

和柑橘大实蝇一样，橘小实蝇对果实的危害主要通过成虫产卵，孵化后的幼虫在果实内部危害果肉，造成果实脱落、腐烂，严重影响果实的产量和质量，给农业生产带来巨大的损失。目前橘小实蝇引诱物质主要有：(1) 水解蛋白类。该类物质对雌雄个体都有作用，诱捕的范围较广。(2) 植物源类。这类物质来源于植物或植物的次生代谢产物，一般对雌雄个体均有引诱作用，但效果有限。(3) 化学合成类。其中甲基丁香酚是目前应用最广泛的引诱剂，但只引诱雄虫。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种异常汉逊酵母菌在制备柑橘实蝇类引诱饵剂中的应用，本发明的另一目的在于提供两种引诱效果好的柑橘实蝇类引诱饵剂。 

上述目的是通过以下技术方案实现的： 

异常汉逊酵母菌在制备柑橘实蝇类引诱饵剂中的应用。

所述的异常汉逊酵母菌，属子囊菌纲，内孢霉目，毛霉科，异常汉逊酵母属。 

异常汉逊酵母菌落呈圆形、乳白色，平坦、中心稍隆起酵母样、无光泽，表面有干涩感、边缘稍不整、四周呈浅波纹样菌落，有自菌落中心向外周的放射形嵴状隆起。其主要用途为产脂，增加饮料酒香味，能利用酒精为碳源在饮料表面形成皮膜，为酒类酿造的有害菌，能引起糖浆、果酱、 果汁等食品的变质。因能产生乙酸乙脂，也可用于食品的增香。 

本发明提供的一种柑橘实蝇类引诱饵剂，由异常汉逊酵母菌水解发酵液和辅助饵剂组成，所述辅助饵剂由下述质量百分比的成份组成： 

多价蛋白胨          5-20％；

红糖                8-20％；

食醋10-20％或醋酸铵1.2-3％；

防腐剂             0.1-0.3％；

水                    余量，

其中：防腐剂为苯甲酸钠或对羟基苯甲酸甲酯，

所述异常汉逊酵母菌水解发酵液与辅助饵剂的体积比为1:0.5－2。

优选的，所述异常汉逊酵母菌水解发酵液与辅助饵剂的体积比为1:1。 

优选的，所述辅助饵剂由下述质量百分比的成份组成： 

多价蛋白胨          15％；

红糖                10％；

醋酸铵              1.5％；

对羟基苯甲酸甲酯    0.15％；

水                   余量。

本发明提供的另一种柑橘实蝇类引诱饵剂，由异常汉逊酵母菌水解发酵液和辅助饵剂组成，其体积比为1:1，所述辅助饵剂为糖醋液，所述糖醋液中糖、醋、水的质量比为1:1:8。 

本发明的有益效果是： 

本发明的柑橘实蝇类引诱饵剂对柑橘大实蝇和橘小实蝇的引诱效果好，并且对柑橘大实蝇和橘小实蝇的雌虫和雄虫均有良好的引诱效果，且安全无毒、无残留、对人和其它有益昆虫无害。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述。 

实施例1 

一种柑橘实蝇类引诱饵剂，由异常汉逊酵母菌水解发酵液和辅助饵剂组成，所述异常汉逊酵母菌水解发酵液与辅助饵剂的体积比为1:1。

所述辅助饵剂由下述质量百分比的成份组成： 

多价蛋白胨          15％；

红糖                10％；

醋酸铵              1.5％；

对羟基苯甲酸甲酯    0.15％；

水                   余量。

制备方法包括以下步骤： 

1、材料准备

异常汉逊酵母菌株购于中国农业微生物菌种保藏管理中心（Agricultural Culture Collection of China，英文缩写ACCC）、多价蛋白胨购自青岛高科园海博生物技术有限公司，红糖、食醋、醋酸铵、防腐剂均为市售产品，其中食醋为白醋或陈醋或老陈醋。

YPD培养基成分（质量%）：1%酵母浸粉（北京双旋微生物培养基制品厂）、2%胰蛋白胨（北京双旋微生物培养基制品厂）、2%葡萄糖，若制固体培养基，则再加入2%的琼脂粉（Biosharp公司）。配制方法： 

(1) 溶解10g酵母浸粉，20g胰蛋白胨于900ml水中，如制平板加入20g琼脂粉。

(2) 高压 121℃，20min。 

(3) 加入100ml 10%葡萄糖（葡糖糖溶液灭菌后加入）。 

注：葡萄糖，酵母浸粉，胰蛋白胨溶液混合后在高温下可能会发生化学反应，导致培养基成分变化，所以要分别灭菌后再混合。 

2、菌株的恢复培养 

(1) 用无菌吸管吸取0.3-0.5ml适宜的液体培养基，滴入安瓿管内，轻轻震荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状。

(2) 吸取菌体悬浮液，移植于适宜的琼脂斜面或平板培养基上，然后在建议的温度下培养。建议一只安瓿管菌种只转接2至3只斜面。所有菌粉必须一次性用完。 

注意事项： 

(1) 菌种活化前，将安瓿管保存在6-10℃的环境下。

(2) 某些菌种经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，需连续两次继代培养才能正常生长。 

3、菌发酵液的制备 

准备摇床培养用发酵培养基，用250ml锥形瓶配制，每瓶规格200ml培养基，高压121℃灭菌20min。用灭过菌的接种环从菌种生长情况良好的平板或斜面培养基上挑取2-3环菌体，接种于发酵培养基中，震荡均匀。将接完种的锥形瓶放入恒温摇床，220rpm，30℃培养3天，取出4℃冷藏备用。

4、柑橘实蝇类引诱饵剂的配制 

(1)制备异常汉逊酵母菌的水解发酵液：水解条件为PH值6.0，水解温度50℃，水解时间18h，木瓜蛋白酶的加酶量2.0mg/mL。

(2)制备辅助饵剂：取多价蛋白胨、红糖、醋酸铵、对羟基苯甲酸甲酯，加水至配方的全量后，充分搅拌溶解混合均匀。 

(3)以异常汉逊酵母菌水解发酵液为基质，加入辅助饵剂，混合均匀。 

实施例2 

一种柑橘实蝇类引诱饵剂，由异常汉逊酵母菌水解发酵液和辅助饵剂组成，所述异常汉逊酵母菌水解发酵液与辅助饵剂的体积比为1:0.5。

所述辅助饵剂由下述质量百分比的成份组成： 

多价蛋白胨          20％；

红糖                 8％；

食醋                10％；

苯甲酸钠            0.1％；

水                  余量。

制备方法同实施例1。 

实施例3 

一种柑橘实蝇类引诱饵剂，由异常汉逊酵母菌水解发酵液和辅助饵剂组成，所述异常汉逊酵母菌水解发酵液与辅助饵剂的体积比为1:2。

所述辅助饵剂由下述质量百分比的成份组成： 

多价蛋白胨           5％；

红糖                20％；

食醋                20％；

苯甲酸钠            0.3％；

水                  余量。

制备方法同实施例1。 

实施例4 柑橘实蝇类引诱饵剂对柑橘大实蝇的田间引诱效果测定 

1、试验分组：

（1）异常汉逊酵母菌水解发酵液

（2）蛋白饵剂（实施例1中的辅助饵剂）

（3）实施例1、2、3的柑橘实蝇类引诱饵剂（异常汉逊酵母菌水解发酵液+蛋白饵剂）

（4）异常汉逊酵母菌水解发酵液+糖醋液（体积比1:1，糖醋液中糖、醋、水的质量比为1:1:8）

（5）果瑞特果实蝇引诱剂稀释液（购于湖北谷瑞特生物技术有限公司，稀释比例为1:2）

（6）糖醋液（糖、醋、水的质量比为1:1:8）。

2、试验方法：分别取各处理50ml放入黄色诱捕罐中，用铁丝悬挂于柑橘树树冠中部背阴离地1.5m处，每个处理3个重复。不同处理随机均匀间隔20m悬挂在实验橘园内。连续观察3天，记录被引诱的柑橘大实蝇雌雄数。以糖醋液做对照，按照下列公式计算各饵剂对柑橘大实蝇的引诱系数。 

引诱系数=待测饵剂诱到的虫数（头）/对照糖醋液诱到的虫数（头） 

3、试验结果

表1：不同处理饵剂对柑橘大实蝇引诱效果

注：表中数字为“平均值±标准差”，各列不同小写字母间表示在P<0.05的水平上差异显著。

不同配方的饵剂对柑橘大实蝇的引诱效果差异显著（表1）。引诱效果最好的是异常汉逊酵母菌水解发酵液+蛋白饵剂配方，是对照组糖醋液的3.52倍，对雌雄虫均有较好的引诱效果。同时，异常汉逊酵母菌水解发酵液+糖醋液比单独异常汉逊酵母菌发酵液的引诱效果好，差异显著，说明糖醋液有增效作用。蛋白饵剂、异常汉逊酵母菌水解发酵液+糖醋液和异常汉逊酵母菌水解发酵液+蛋白饵剂都比果瑞特的引诱效果好，差异显著。 

实施例5柑橘实蝇类引诱饵剂对柑橘小实蝇的田间引诱效果测定 

1、试验分组：

（1）异常汉逊酵母菌水解发酵液

（2）异常汉逊酵母菌水解发酵液+糖醋液（体积比1:1，糖醋液中糖、醋、水的质量比为1:1:8）

（3）异常汉逊酵母菌水解发酵液+甲基丁香酚（甲基丁香酚体积比1%）

（4）实施例1、2、3的柑橘实蝇类引诱饵剂（异常汉逊酵母菌水解发酵液+蛋白饵剂）

（5）蛋白饵剂（实施例1中的辅助饵剂）

（6）甲基丁香酚石蜡混合液（甲基丁香酚体积分数1%）

（7）糖醋液（糖、醋、水的质量比为1:1:8）。

2、试验方法：用移液器分别量取5ml的诱剂，用脱脂棉吸附制成诱芯。诱捕器购于宁波纽康生物技术有限公司。将诱捕器用铁丝悬挂于橘树树冠中部背阴处，每个处理3个重复，不同处理均匀间隔悬挂。每2天记录实验数据，统计引诱的雌雄橘小实蝇数量，并更换诱剂，以糖醋液作为对照，按照下列公式计算各饵剂对柑橘大实蝇的引诱系数。 

引诱系数=待测饵剂诱到的虫数（头）/对照糖醋液诱到的虫数（头） 

3、试验结果

表2：不同处理饵剂对柑橘小实蝇引诱效果

注：表中数字为“平均值±标准差”，各列不同小写字母间表示在P<0.05的水平上差异显著。

不同配方的饵剂对橘小实蝇引诱效果差异显著。本发明柑橘实蝇类引诱饵剂引诱效果为对照糖醋液的2.7倍，同时也优于蛋白饵剂配方。异常汉逊酵母菌水解发酵液+甲基丁香酚虽然诱到最多的虫数，但与本实验柑橘实蝇类引诱饵剂诱到的虫数无显著性差异，而且对于雌性的引诱效果不好，单独的甲基丁香酚石蜡混合液只能诱到雄虫，综合考虑柑橘实蝇类引诱饵剂的引诱效果最好。而单独的异常汉逊酵母菌水解发酵液与加了糖醋液的异常汉逊酵母菌水解发酵液的引诱效果存在显著差异，说明糖醋液对其有增效作用。