纳他霉素-羟丙基-β-环糊精包合物的制备方法

摘要

本发明涉及一种纳他霉素-羟丙基-β-环糊精包合物的制备方法。纳他霉素存在两种典型构型：烯醇式结构和酮式结构，在许多溶剂中具有低溶解性，限制了其的推广应用。本发明将纳他霉素溶解于碱；加入羟丙基-β-环糊精，在15℃-40℃温度条件下与纳他霉素进行包合反应，纳他霉素与羟丙基-β-环糊精的摩尔比为1:4.5-6；反应结束后，在反应体系中加入酸溶液进行中和，经干燥后得到纳他霉素-羟丙基-β-环糊精包合物粉剂。本发明不使用有机试剂，工艺简单，周期短，成本低，制备的包合物为粉剂，溶解度提高1000倍以上，稳定性强，生物利用率更有效，可以使纳他霉素在食品、农业、医药及其他领域中抗真菌利用发挥更大作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种抑菌剂的制备方法，具体涉及一种纳他霉素-羟丙基-β-环糊精包合物的制备方法。

背景技术

纳他霉素主要由纳塔尔链霉菌（Streptomyces natalensis）产生，也称游链霉素（Pimaricin），是一种多烯烃大环内酯类抗真菌剂，对霉菌、酵母菌具有极强的抑制作用。其抗菌机理在于它能与细胞壁及细胞膜上的甾醇化合物反应，尤其是麦角甾醇形成一种复合物，由此引发细胞膜结构改变，导致细胞内容物的渗漏使细胞死亡。研究表明，绝大多数霉菌在0.5-6ppm 的纳他霉素浓度下被抑制，极个别的种在10-25ppm的纳他霉素浓度下被抑制；多数酵母在1.0-5.0ppm的纳他霉素浓度下被抑制。因此，纳他霉素对真菌极为敏感，微量使用即可起作用，作为防腐剂的用量仅为山梨酸钾的 1/50-1/100。纳他霉素用于食品防腐不仅可以解决食品腐败，还能减少真菌毒素对人类的毒害，与其他抗菌成分相比，纳他霉素对哺乳动物细胞的毒性极低，无致癌、致畸、致突变作用，可以广泛应用于真菌引起的疾病。目前，纳他霉素已被50多个国家和地区批准应用于乳制品、肉类、水果、饮料、医药及其他可抗真菌领域中。

由于纳他霉素结构上存在两种典型构型：烯醇式结构和酮式结构，这就决定了它在许多溶剂中具有低溶解性的缺陷。室温下纳他霉素在水中的溶解度为30-50mg／L。目前作为食品防腐剂主要用于对食品的表面进行处理，因为溶解的纳他霉素只有与目标物结合才能发挥作用，纳他霉素的低水溶性不利于它的生物利用度，这严重影响了纳他霉素的使用效果，也限制了纳他霉素的使用范围。同时纳他霉素对温度,紫外光,氧化剂以及重金属等因子比较敏感，尤其是对光照敏感，其光稳定性差，纳他霉素的抑菌性随着紫外光照射时间的增加而迅速减弱，紫外（10W，30cm）照射处理在60min后基本失去活性。如作为生物农药由于光稳定差，其利用度就大为降低。实验也证实纳他霉素对食品的防腐效果亦会随时间延长而降低。虽然纳他霉素的活性较高，但是它在水里溶解度很低和对光稳定性较差，因而限制了其的推广应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种条件温和、工艺简单、包合产率高的纳他霉素-羟丙基-β-环糊精包合物的制备方法，制备出抑菌性强、溶解度高的新型抑菌剂。

本发明所采用的技术方案是：

纳他霉素-羟丙基-β-环糊精包合物的制备方法，其特征在于：

由以下步骤实现：

步骤一：将纳他霉素溶解于碱溶液中, pH值为11.5-13；

步骤二：加入羟丙基-β-环糊精，在15℃-40℃温度条件下与纳他霉素进行包合反应，纳他霉素与羟丙基-β-环糊精的摩尔比为1: 4.5-6；

步骤三：反应结束后，在反应体系中加入酸溶液进行中和，经干燥后得到纳他霉素-羟丙基-β-环糊精包合物粉剂。

步骤一中，碱溶液选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、氢氧化钙溶液，摩尔浓度为0.02-0.2mol/L。

步骤三中，酸溶液选自盐酸溶液、草酸溶液、醋酸溶液，摩尔浓度为0.5-1.5mol/L。

步骤二中，包合方法选自高速组织捣碎法、磁力搅拌法、超声法、电动搅拌法。

步骤三中，包合产物的干燥方法选自减压干燥法、冷冻干燥法、喷雾干燥法。

    本发明具有以下优点：

本发明的制备方法不使用任何有机试剂，工艺简单，反应周期短，成本低，可大批量生产，利用羟丙基-β-环糊精与纳他霉素制备纳他霉素-羟丙基-β-环糊精包合物，生成的包合物质量稳定，有利于提高纳他霉素在水中的溶解度，实验表明，利用本发明的制备方法得到的纳他霉素—羟丙基-β-环糊精包合物粉剂，为固体粉剂，使用方便，其中纳他霉素的水溶性最大≥60g/L(原纳他霉素水中溶解30-50mg/L),相当于溶解度提高1000倍以上，生物利用率更有效，可以使纳他霉素在食品、农业、医药及其他领域中抗真菌利用发挥更大作用。

附图说明

图1为纳他霉素差示扫描热量分析（DSC）图谱；

图2为羟丙基-β-环糊精差示扫描热量分析（DSC）图谱；

图3为纳他霉素-羟丙基-β-环糊精物理混合物差示扫描热量分析（DSC）图谱；

图4为纳他霉素-羟丙基-β-环糊精包合物差示扫描热量分析（DSC）图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。

本发明在不影响纳他霉素的分子结构的前提下，对纳他霉素的溶解性加以改变，增加纳他霉素在水溶液中的溶解度和稳定性，提高纳他霉素的生物利用率。

具体的制备步骤如下：

步骤一：将纳他霉素-羟丙基-β-环糊精溶解于碱溶液中， pH值为11.5-13；碱溶液选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、氢氧化钙溶液，摩尔浓度为0.02-0.2mol/L。

步骤二：加入羟丙基-β-环糊精，在15℃-40℃温度条件下与纳他霉素进行包合反应，纳他霉素与羟丙基-β-环糊精的摩尔比为1: 4.5-6；

包合方法选自高速组织捣碎法、磁力搅拌法、超声法、电动搅拌法。

步骤三：反应结束后，在反应体系中加入酸溶液进行中和，经干燥后得到纳他霉素-羟丙基-β-环糊精包合物粉剂；酸溶液选自盐酸溶液、草酸溶液、醋酸溶液，摩尔浓度为0.5-1.5mol/L。

包合产物的干燥方法选自减压干燥法、冷冻干燥法、喷雾干燥法。

整个反应周期为2-3小时。

实施例一：

步骤一：将纳他霉素溶解于碱溶液中，体系pH为11.5；碱溶液为氢氧化钠溶液，摩尔浓度为0.02mol/L。

步骤二：加入羟丙基-β-环糊精，在15℃温度条件下与纳他霉素进行包合反应，纳他霉素与羟丙基-β-环糊精的摩尔比为1: 4.5。

包合方法为高速组织捣碎法。

步骤三：反应结束后，在反应体系中加入酸溶液进行中和，经干燥后得到纳他霉素-羟丙基-β-环糊精包合物粉剂；酸溶液为盐酸溶液，摩尔浓度为0.5mol/L。

包合产物的干燥方法为减压干燥法。

实施例二：

步骤一：将纳他霉素溶解于碱溶液中，体系pH为11.5；碱溶液为氢氧化钠溶液，摩尔浓度为0.05mol/L。

步骤二：加入羟丙基-β-环糊，在25℃温度条件下与纳他霉素进行包合反应，纳他霉素与羟丙基-β-环糊精的摩尔比为1:5； 

包合方法为高速组织捣碎法。

步骤三：反应结束后，在反应体系中加入酸溶液进行中和，经干燥后得到纳他霉素-羟丙基-β-环糊精包合物粉剂；酸溶液为盐酸溶液，摩尔浓度为0.5mol/L。

包合产物的干燥方法为减压干燥法。

实施例三：

步骤一：将纳他霉素溶解于碱溶液中，体系pH为12；碱溶液为氢氧化钾溶液，摩尔浓度为0.1mol/L。

步骤二：加入羟丙基-β-环糊精，在30℃温度条件下与纳他霉素进行包合反应，纳他霉素与羟丙基-β-环糊精的摩尔比为1:6。

包合方法为磁力搅拌法。

步骤三：反应结束后，在反应体系中加入酸溶液进行中和，经干燥后得到纳他霉素-羟丙基-β-环糊精包合物粉剂；酸溶液为草酸溶液、醋酸溶液，摩尔浓度为1mol/L。

包合产物的干燥方法为冷冻干燥法。

实施例四：

步骤一：将纳他霉素溶解于碱溶液中，体系pH为12.5；碱溶液为氢氧化钾溶液，摩尔浓度为0.15mol/L。

步骤二：加入羟丙基-β-环糊精，在35℃温度条件下与纳他霉素进行包合反应，纳他霉素与羟丙基-β-环糊精的摩尔比为1:5.5。

包合方法为超声法。

步骤三：反应结束后，在反应体系中加入酸溶液进行中和，经干燥后得到纳他霉素-羟丙基-β-环糊精包合物粉剂；酸溶液为盐酸溶液，摩尔浓度为1mol/L。

包合产物的干燥方法为冷冻干燥法。

实施例五：

步骤一：将纳他霉素溶解于碱溶液中，体系pH为13；碱溶液为氢氧化钙溶液，摩尔浓度为0.2mol/L。

步骤二：加入羟丙基-β-环糊精，在40℃温度条件下与纳他霉素进行包合反应，纳他霉素与羟丙基-β-环糊精的摩尔比为1: 5。 

包合方法为电动搅拌法。

步骤三：反应结束后，在反应体系中加入酸溶液进行中和，经干燥后得到纳他霉素-羟丙基-β-环糊精包合物粉剂；酸溶液为草酸溶液，摩尔浓度为1.5mol/L，中和后需过滤，草酸钙会产生沉淀。

包合产物的干燥方法为喷雾干燥法。

本发明利用羟丙基-β-环糊精。与纳他霉素制备纳他霉素-羟丙基-β-环糊精包合物，生成的包合物质量稳定，有利于提高纳他霉素在水中的溶解度，实验表明，本发明的纳他霉素一羟丙基-β-环糊精包合物作为水溶性制剂较之单纯的纳他霉素或市场上纳他霉素商品制剂均具有显著的水溶性及良好的稳定性。

1、本发明的包合物体外抗菌试验结果：

试验采用琼脂稀释法测定不同菌液浓度下试验样品和对照样品的最低抑菌浓度（MIC）。通过观察平板上试验菌株的生长情况，以无菌生长的浓度为MIC，试验表明纳他霉素-羟丙基-β-环糊精包合物与纳他霉素对照品在抑制真菌效果相同（见表1），纳他霉素-羟丙基-β-环糊精包合物的抗菌的生物活性稳定。

表1  最低抑菌浓度（MIC）  （单位：mg / kg） 

2、紫外照射对纳他霉素水溶液稳定性的影响试验结果：

将纳他霉素对照品和纳他霉素-羟丙基-β-环糊精包合物分别处理配制成一定浓度的水溶液，同时放置在紫外光照强度20W，距离30cm处，分别测定0、15、30、45、60、75、90min时纳他霉素相对含量。

试验结果表明纳他霉素-羟丙基-β-环糊精包合物较纳他霉素对照品对紫外线照射的稳定性显著提高（见表2）。

表2  紫外照射对纳他霉素水溶液相对含量的影响

3、水溶性纳他霉素最大溶解度测定：

目的：验证水溶性纳他霉素的溶解度（最大溶解度），由于羟丙基-β-环糊精在水中的溶解性最高可以达到80g/100ml，所以试验采用加入60g羟丙基-β-环糊精/纳他霉素包和的制剂进行测定。

采用平衡法：将过量的溶质加入溶剂中, 恒温振摇至平衡, 经过滤后测定浓度。HPLC方法测定含量，将60g含量为10.36%高水溶性纳他霉素加入水并定容至100ml，然后转入到300ml三角瓶中，在25℃的恒温振荡仪，150r/min进行平衡溶解，同时以100mg的原料纳他霉素做对照，每隔24 h取样测定至浓度不再增加, 即为平衡时间。结果表明高水溶性纳他霉素最大溶解度≥60g/L。

表3 水溶性纳他霉素的溶解度

4、包合物差示扫描热量分析 (DSC)

目的：通过检测包合物的相变温度（熔点）变化，判断包合物的形成与否。

试验材料：

差示扫描热分析仪（DTA 404 PC德国耐驰公司 ）

纳他霉素 （浙江省银象生物 95%）

羟丙基-β-环糊精（西安德立生物有限公司 99%）

纳他霉素/羟丙基-β-环糊精包合物(实验室自制 12.3%)

纳他霉素/羟丙基-β-环糊精混合物（实验室自制1.2：9）

方法与结果：

分别将包合物、物理混合物、纳他霉素和羟丙基-β-环糊精等样品进行差热分析，升温速率10℃/min,升温范围30-400℃。结果见附图。包合物药物、物理混合物的图谱有明显的差异，在图4中纳他霉素熔点处无明显吸热峰，说明羟丙基-β-环糊精已基本包合了纳他霉素。图3基本是图1和图2的叠加。

本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。