INTS6基因小激活RNA在制备抗前列腺癌药物中的应用

摘要

本发明提供一种靶向上调INTS6基因的小RNA在制备抗激素非依赖性前列腺癌药物中的应用。所述的小RNA的核苷酸序列由4条21个核苷酸的正义链和反义链组成，每条链的3’端均悬挂突出两个核苷酸，通常为dTdT，中间19个核苷酸配对。本发明通过特定序列的小双链RNA诱导激素非依赖性前列腺癌细胞中INTS6基因的表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖和运动能力，达到抑制肿瘤生长和进展的目的。本发明的小RNA操作简单，成本较低；用量较少，20nM的转染浓度即可达到良好的激活效果；激活作用确切，靶基因mRNA和蛋白水平均有升高。另外saRNA诱导基因表达属于表观遗传学调节，不破坏基因组的完整性，因此应用较为安全。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及靶向上调INTS6基因的小激活RNA在制备抗前列腺癌，提别是激素非依赖性前列腺癌药物中的应用。

背景技术

前列腺癌正严重威胁着我国50岁以上男性的健康。内分泌治疗是临床上治疗前列腺癌的常用方法。但是绝大多数前列腺癌患者在内分泌治疗1~2年内病情出现进展，继续应用内分泌治疗药物，并不能控制病情发展。前列腺癌细胞由激素依赖转变为激素非依赖，是前列腺癌内分泌治疗失败、患者死亡最主要的原因。

2006 年Li等报道靶向基因启动子区的dsRNA(双链RNA,double-stranded RNA)能引起序列特异性的基因转录激活。并把此现象命名为RNA引起的基因激活(RNA activation,RNAa)，而把这样的dsRNA称为小激活RNAs (small activating RNAS,saRNAs)。该项技术通过改变染色体的结构导致内源性靶基因表达增强。它能激活许多失活的抑癌基因或增加活性较低的基因的表达量，从而起到治疗肿瘤的作用。

INTS6是一种抑癌基因，全称Integrator complex subunit 6 gene,1999年由I Wieland和Zhengnan Yin两个团队同时报道，在《Oncogene》杂志的同一期刊登。INTS6定位于人类染色体13q14.2附近，由于这一区段在许多肿瘤细胞中存在缺失，因此INTS6又被命名Delete In Cancer 1（DICE1)。INTS6调控的信号网络仍未完全阐明，有研究指出INTS6可能参与WNT信号通路的调节,在肿瘤中扮演抑癌基因的角色。INTS6在前列腺癌组织和细胞株中存在表达缺失。文献报道，杂合性缺失（loss of heterozygosity,LOH）和表观遗传学改变双重打击造成前列腺癌中INTS6表达下调。INTS6成为RNA激活干预前列腺癌的理想靶标。

发明内容

本发明的目的是提供一种靶向上调INTS6基因的小RNA在制备抗激素非依赖性前列腺癌药物中的应用。本发明通过特定序列的小双链RNA诱导激素非依赖性前列腺癌细胞中INTS6基因的表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖和运动能力，达到抑制肿瘤生长和进展的目的。

所述靶向上调INTS6基因的小RNA的核苷酸序列由2对（4条）21个核苷酸的正义链和反义链组成，其序列分别为：dsINTS6-374 S（SEQ ID NO:1）：5’-CCA CUU UAC UCA ACC CUU C [dTdT] -3’， dsINTS6-374 AS （SEQ ID NO:2）：5’-GAA GGG UUG AGU AAA GUG G [dTdT] -3’；dsINTS6-390 S （SEQ ID NO:3）：5’-CUA ACC AGG UGU UUG UCC A [dTdT] -3’，dsINTS6-390 AS （SEQ ID NO:4）：5’-UGG ACA AAC ACC UGG UUA G [dTdT] -3’。每条链的3’端均悬挂突出两个核苷酸（通常为dTdT，中间19个核苷酸配对）。

本发明的有益之处：小RNA操作简单，成本较低；用量较少，20nM的转染浓度即可达到良好的激活效果；激活作用确切，靶基因mRNA和蛋白水平均有升高。另外saRNA诱导基因表达属于表观遗传学调节，不破坏基因组的完整性，因此应用较为安全。

附图说明

图1是不同位点dsRNAs对PC3细胞内INTS6 mRNA表达的影响程度，数据来源于3次独立实验的平均值和标准差。

图2是不同位点dsRNAs对Du145细胞内INTS6 mRNA表达的影响程度，数据来源于3次独立实验的平均值。

图3是dsINTS6-374/-390上调PC3细胞内INTS6蛋白的表达，β-actin表达量作为内参。

图4是dsINTS6-374/-390上调Du145细胞内INTS6蛋白的表达，β-actin表达量作为内参。

图5是MTT法提示dsINTS6-374/-390能明显抑制PC3细胞活性，数据以平均值±标准差表示。

图6是MTT法提示dsINTS6-374/-390能明显抑制Du145细胞活性，数据以平均值±标准差表示。

图7是dsINTS6-374/-390处理后PC3细胞平板克隆形成能力减弱。

图8是流式细胞仪检测提示dsINTS6-374/-390能诱导PC3细胞发生G1期周期阻滞，数据来源于3次独立的实验，结果以平均值和标准差显示。

图9是dsINTS6-374/-390处理组穿至transwell膜下表面的PC3细胞数较少，Migration：细胞迁移实验；invation：细胞侵袭实验。

图10是dsINTS6-374/-390处理组穿至transwell膜下表面的Du145细胞数较少，Migration：细胞迁移实验；invation：细胞侵袭实验。

图11是dsINTS6-374/-390处理后，PC3裸鼠移植瘤生长较对照组明显放缓。

图12是免疫组化显示处理组移植瘤组织中，肿瘤细胞尤其是胞核中INTS6表达增强。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的实质，本发明结合附图和实施例作进一步的说明。但这些具体实施方案不是要以任何方式限制所要求保护的发明范围。

实施例1  dsRNAs上调前列腺癌细胞中INTS6基因的表达

实验方案：

1．细胞系：人激素非依赖性前列腺癌细胞株PC3、Du145（上海细胞所）

2．dsRNAs合成：dsRNAs均由上海吉凯生物技术有限公司化学合成。

3．实验分组：

20nM的dsINTS6-374和-390组、无意义dsRNA对照组（dsControl）和空白转染试剂组（mock）。dsControl组dsRNA与已知人基因组序列非同源: 正义链, 5’-ACU ACU GAG UGA CAG UAG A[dTdT]-3’（SEQ ID NO:5）；反义链, 5’-UCU ACU GUC ACU CAG UAG U[dTdT]- 3’（SEQ ID NO:6）。

4．细胞培养及转染：

细胞培养在含10％灭活新生牛血清的RPMI1640培养基中，放置于CO2含量为5％的37oC细胞培养箱内。转染前一天细胞传代后种于培养板中，密度大约30～40％。dsRNAs经过脂质体Lipofectamine 2000包裹后转染入细胞，以6孔板为例（其余培养器皿根据底面积之间的比例调整试剂量），每孔取3μl 20μM dsRNAs储存液和5μl脂质体分别溶于250μl无血清培养基，5min后混合，室温静置20min后加入培养板中，补充含血清培养基使dsRNA终浓度为20nM，作用持续48至144小时。

5．逆转录－聚合酶链反应（RT-PCR）：

利用 Trizol Reagent将各实验组的细胞提取总RNA ,紫外分光光度计准确定量。取3μg总RNA进行逆转录。GAPDH上游引物（SEQ ID NO:7）：5’-ATGGCACCGTCAAGGCTGAG-3’，下游引物（SEQ ID NO:8）：5’-GCAGTGATGGCATGGACTGT-3’，INTS6 上游引物（SEQ ID NO:9）：5’- TGCCCATCTTACTGTTCCTG-3’，下游引物（SEQ ID NO:10）：5’- TCTTCGAAAGTGACCAGC-3’。采用SYBR Green染料法进行荧光实时定量PCR（real-time PCR）检测，结果按照2-delta法标准化到对照组进行比较。

6.蛋白印迹（Western Blot）：

细胞转染72 h后，收集细胞，利用RIPA细胞裂解液提取总蛋白，BCA（二喹啉甲酸）法测定蛋白浓度，并调整待测样本的蛋白质含量。每孔加20ug的蛋白电泳、转膜、封闭，把膜放入稀释的一抗中，温和振荡3h后置4度冰箱中过夜。再温和振荡2 h ,回收一抗后在Tris缓冲液中洗膜30 min，中间更换Tris缓冲液2-3次，分别把膜置于稀释的二抗中温和振荡1h，后在Tris缓冲液中洗膜30 min，中间换液3-4次。曝光、显影及定影，用底片扫描仪扫描X线胶片。

结果如下：

1.两对dsRNAs对激素非依赖前列腺癌细胞内INTS6 mRNA表达的影响

对激素非依赖前列腺癌细胞PC3和Du145分别转染20nM dsRNAs（dsINTS6-374、-390）以及对照dsRNA（dsControl）并设置空白对照组，72小时后利用RT-PCR检测INTS6的mRNA表达情况，与对照组相比，dsINTS6-374、-390作用组细胞内的INTS6 mRNA明显增加，是对照组的2倍以上（参见图1，图2）。

2.dsINTS6-374/-390上调前列腺癌细胞内INTS6蛋白的表达

进一步通过Western Blot检测PC3和Du145细胞转染72小时后各作用组细胞内INTS6蛋白表达情况，与对照组相比，dsINTS6-374/-390作用组细胞内的INTS6蛋白增加（参见图3、4）。

实施例2  dsINTS6-374/-390上调INTS6在体外对激素非依赖前列腺癌细胞的抑制作用

实验方案：

1.细胞系：同实施例1。

2.dsRNAs合成：同实施例1。

3.实验分组：同实施例1。

4.细胞培养及转染：同实施例1。

5.四唑盐（MTT）比色法：

取对数生长期的癌细胞，胰酶消化制成单细胞悬液，以每孔2000～5000个细胞的密度将细胞种于96孔培养板内（为保证结果的准确性，在实验前测定细胞的贴壁率、倍增时间以及不同接种数目细胞的生长曲线，再确定每孔细胞的接种数，以保证培养终止时细胞不至于过满），将培养板置于37^oC，5% CO₂及饱和湿度的细胞培养箱内培养过夜后，吸去旧培养液，加入20nM dsINTS6-374/-390，并设立阴性对照（dsControl）和空白对照（Mock）。作用48～144小时后，每孔加入20μl MTT溶液（5 mg/ml），37^oC孵育4小时后弃培养基，每孔加入DMSO 150μl，室温放置10分钟，待结晶溶解后用酶标仪在490 nm波长处测定其吸光度（OD）值。按下述公式计算细胞存活率：存活率＝治疗组OD值/空白对照组OD值×100%；

6.平板克隆形成

经胰酶消化后收集20nM dsINTS6-374/-390、dsControl以及Mock组处理72h后的细胞，分别取400个细胞种于六孔板的孔中培养，直至出现肉眼可见的克隆形成，100%甲醛固定细胞，结晶紫染色，观察各处理组细胞克隆形成的数量。

7.流式细胞仪检测细胞周期

经胰酶消化后收集20nM dsINTS6-374/-390、dsControl以及Mock组处理72h后的细胞，70%酒精固定，用PBS洗涤并细胞计数，取含有1×10⁵个细胞的悬液，RNA酶处理细胞去除RNA，4^oC、2000rpm离心5分钟，弃上清液，每个样本加入500μl的PI染料，室温避光保存30分钟， Beckman Coulter FC500流式细胞仪检测，粗数据使用modfit软件判读，计算G0/G1、S和G2/M各期细胞的比例。

8.Transwell穿膜实验检测细胞运动能力

利用孔径8μm（略小于细胞直径）的transwell小室检验细胞的迁移和侵袭能力。小室的上室采用无血清的培养基，小室的下室采用含20%血清的培养基，由此建立趋化梯度。经胰酶消化后收集20nM dsINTS6-374/-390、dsControl以及Mock组处理72h后的细胞，分别将8×10⁴个不同处理组的细胞置于上室的低血清环境中培养，比较一定时间后趋化至下室的细胞数，从而评价细胞的运动能力。其中，使用无基质胶的transwell小室评价细胞的迁移能力，使用基质胶预先处理的transwell小室评价细胞的侵袭能力。

结果如下：

1. dsINTS6-374/-390抑制激素非依赖前列腺癌细胞的活性

为了明确dsINTS6-374/-390对激素非依赖前列腺癌细胞生长和活性的抑制程度，我们进行了MTT试验。在96孔板中，分别对PC3和Du145细胞转染20nM的dsINTS6-374/-390和dsControl RNA，并设置空白对照组mock，每个组共设置4个复孔，结果均标准化到mock组（以mock组为1）。参见图5、6，dsINTS6-374/-390对两种癌细胞的抑制作用出现在48h时间点，且持续至144h。在转染144h时，dsINTS6-374/-390对两种癌细胞的抑制率均超过50%。

2. dsINTS6-374/-390能抑制激素非依赖性前列腺癌细胞的体外克隆形成能力

利用平板克隆形成，研究dsINTS6-374/-390抑制激素非依赖性前列腺癌细胞活性是否与细胞增殖减弱有关。对前列腺癌细胞PC3分别转染20nM的dsINTS6-374/-390和对照dsRNA（dsControl），观察处理后每400个细胞最终在平板中形成克隆的数量。结果显示，与对照RNA组相比，dsINTS6-374/-390处理的PC3细胞形成克隆的数目更少。（参见图7）

3. dsINTS6-374/-390能诱导激素非依赖性前列腺癌细胞发生G1期阻滞

对前列腺癌细胞PC3和Du145分别转染20nM的dsINTS6-374/-390和对照dsRNA（dsCon），72小时后利用PI染色，通过流式细胞仪检测研究细胞周期分布。如图8所示，dsINTS6-374/-390处理组G0/G1期细胞增加而S期细胞减少。

4. dsINTS6-374/-390能抑制激素非依赖性前列腺癌细胞的体外运动能力

利用transwell穿膜实验，研究dsINTS6-374/-390处理后激素非依赖性前列腺癌细胞PC3和Du145运动能力的变化。结果显示，与对照RNA组相比，dsINTS6-374/-390处理的PC3和Du145穿至transwell膜下表面的细胞数较少。（参见图9、10）

实施例3  dsINTS6-374上调INTS6在体内抑制激素非依赖性前列腺癌的生长

实验方案：

1.细胞系：人激素非依赖前列腺癌细胞株PC3。

2.动物模型：采用4周龄BALB-c裸鼠，皮下荷瘤。成瘤后分non-sense dsRNA对照组和dsINTS6-374/-390 RNA组进行干预，每组4只。

3.给药方案：瘤内注射30μg脂质体包被的RNA，3天一次，共三周。

4.结果观察：同步观察瘤体大小变化情况。最后处死裸鼠，免疫组化染色观察肿瘤组织中INTS6蛋白的表达。

结果如下：

小激活RNA能够激活PC3裸鼠皮下移植瘤中INTS6的表达，同时抑制移植瘤的生长

利用PC3细胞在裸鼠皮下成瘤，移植瘤内重复注射dsINTS6-374/-390小激活RNA，移植瘤生长受到抑制，同时瘤组织内INTS6表达增强。（参见图11、12）。

<110> 浙江大学

<120> INTS6基因小激活RNA在制备抗前列腺癌药物中的应用

<160> 10

 

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<223> 最后两位为脱氧核糖核苷酸

<400> 1

cca cuu uac uca acc cuu ctt

 

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<223> 最后两位为脱氧核糖核苷酸

<400> 2

gaa ggg uug agu aaa gug gtt　

 

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<223> 最后两位为脱氧核糖核苷酸

<400> 3

cua acc agg ugu uug ucc att　

 

<210> 4

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<223> 最后两位为脱氧核糖核苷酸

<400> 4

ugg aca aac acc ugg uua gtt　

 

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<223> 最后两位为脱氧核糖核苷酸

<400> 5

ACU ACU GAG UGA CAG UAG ATT　

 

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<223> 最后两位为脱氧核糖核苷酸

<400> 6

UCU ACU GUC ACU CAG UAG UTT　

 

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 作为GAPDH PCR扩增的上游引物

<400> 7

ATG GCA CCG TCA AGG CTG AG

 

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 作为GAPDH PCR扩增的下游引物

<400> 8

GCA GTG ATG GCA TGG ACT GT

 

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 作为PAR-4基因 PCR扩增的下游引物

<400> 9

TGC CCA TCT TAC TGT TCC TG

 

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 作为PAR-4基因 PCR扩增的下游引物

<400> 10

TCT TCG AAA GTG ACC AGC