采用次级离子质谱法(SIMS)高灵敏度检测和定量生物分子的改进方法

摘要

本发明涉及采用SIMS来检测并定量样品中多种生物分子的存在或不存在的改进方法以及用于所述方法的阵列。

说明书

技术领域

本发明涉及采用同位素标记和次级离子质谱法检测和定量生物分子(例 如DNA、RNA或蛋白质)的方法以及设计用于实施所述方法的阵列。

背景技术

在六十年代早期，Castaing和Slodzian采用次级离子开发了质量过滤的 发射离子显微术(mass-filtered emission ion microscopy)，这是后来称为次级离 子质谱法(SIMS)的技术的一部分。利用这种技术，一束离子(初级离子束)用作 探针来将样品的表面原子层溅射到原子或原子簇中，其中一小部分原子被离 子化。在SIMS设备中，这些次级离子根据质量分离，然后用于测定次级离 子电流以产生例如，所分析表面的定量原子质量图像。

SIMS已经成为半导体和表面科学研究、地质化学、有机材料的鉴定和宇 宙化学中的主要工具。然而，在很长时间以来离子显微术仅被视为解决生命 科学中的问题的一种边缘方法，这主要是由于其差的横向分辨率(1-0.5μm)和 不足的质量分离能力。

技术和观念上的改进导致横向分辨能力和质量分辨率的显著进步，特别 是由于采用精细聚焦的初级离子束。因此SIMS显微术变成很强大的成像工 具。例如，Lechene等能够采用SIMS技术来使单个静纤毛(即耳蜗内细胞的 机械感觉细胞器)成像(Lechene等，Journal of Biology，2006，5：20)。在另一个 实验中，他们能够研究在¹⁵N气氛中培养的细菌的固氮作用。采用SIMS技术 也使得Lechene等定位、定量并比较单细胞中和亚细胞结构中的固氮作用 (Lechene等，Science 2007，317：1563)。因此，目前SIMS技术已广泛用于 使细胞或组织成像，且是强有力的诊断工具。

SIMS技术也用于检测未标记DNA与肽核酸(PNA)微阵列的杂交(Brandt 等，2003，Nucleic Acids Research，31：19)。在这些实验中，通过SIMS检测 作为核酸的构成部分但在PNA中完全缺失的磷酸酯从而使PNA/DNA或 PNA/RNA双链体显现可视化。

本发明的目的在于提供采用SIMS技术来检测和定量样品中多种生 物分子存在或不存在的方法。Brandt等描述的方法存在以下缺点：(i)它 只能应用于PNA探针或不包含磷酸酯的探针和(ii)它不允许定量探针/靶 标的相互作用。在之前的专利申请中，申请人的目的在于提供可用于大 量样品而采用SIMS技术检测和定量各样品中大量探针/靶标的相互作用 的通用方法，所述相互作用的检测和定量通过计算探针/靶标的同位素比 (参见图1)来确定。在本专利申请中，申请人的目的在于提供更精确的方 法。事实上，发明人发现用不包含对应于用于标记探针的稀有同位素的 常见次级离子的亲水聚合物涂覆阵列赋予该方法额外的优点，因为其阻 止任何疏水性分子(例如存在于待测试样品中的核酸、肽或蛋白质)的非特 异性吸附，并因此使背景最小化。

发明简述

本发明涉及包含具有导电表面和多个离散区域的基本上平面的基底 的阵列，所述离散区域包含用至少一种稳定或不稳定的稀有同位素或外 源同位素标记的探针，其中所述阵列或离散区域用一种亲水聚合物涂覆， 所述亲水聚合物不包含对应于用于标记探针的稀有或外源同位素的常见 次级离子。

根据一种实施方式，所述具有导电表面的基本上平面的基底是硅晶 片。

根据一个实施方式，所述不包含氮的亲水聚合物选自下组：单糖、 二糖、多糖和不包含氮的合成亲水聚合物。

根据一个实施方式，所述合成亲水聚合物是聚乙二醇。

根据一个实施方式，所述探针用至少一种选自²H、¹³C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、 ³³S、³⁴S和³⁶S的稳定的重同位素标记，或用至少一种选自³H和¹⁴C的不 稳定同位素标记，或用至少一种选自⁷⁹Br和⁸¹Br的外源同位素标记。

根据一个实施方式，所述阵列是微阵列，其中各离散区域的长度、宽度 或直径尺寸之一为1μm到1000μm。

根据一个实施方式，各离散区域是微孔，其包含用至少一种稳定或不稳 定的稀有同位素或外源同位素标记的探针。

根据一个实施方式，所述阵列是纳米阵列，其中各离散区域的长度、宽 度或直径尺寸之一为1nm到1000nm。

根据一个实施方式，各离散区域是纳米孔，其包含用至少一种稳定或不 稳定的稀有同位素或外源同位素标记的探针。

根据一个实施方式，各微孔包含多个纳米孔，且所述纳米孔包含用至少 一种稳定或不稳定的稀有同位素或外源同位素标记的探针。

本发明涉及用于检测和定量至少一个样品中至少一种生物分子的存在或 不存在的方法，包括：

(a)使所述至少一个样品与如上所述的阵列接触，

(b)洗涤并干燥所述阵列，

(c)通过SIMS检测和计数常见次级离子以及相应的稀有次级离子。

根据一个实施方式，待测试的各样品与阵列的一个或多个离散区域接触。

根据一个实施方式，所述待测试样品是单细胞。

根据一个实施方式，所述方法用于测定待测试样品的分子图谱，其中所 述分子图谱是所述样品的转录组、蛋白质组、脂质组、代谢组、糖组和/或相 互作用组的确定。

根据一个实施方式，所述方法用于预测疾病倾向，或用于诊断需要的受 试者的疾病。

根据一个实施方式，所述方法用于监测施用于受试者以治疗疾病的治疗 剂的效力。

根据一个实施方式，所述方法用于筛选治疗剂。

附图说明

图1：探针与其靶蛋白结合的SIMS检测的原理示意图。生物分子(探针 和靶标)破碎成原子水平(动态SIMS条件)。因此，各单对的探针/靶标产生数 百个¹⁵N和¹⁴N原子(在真实实验中为CN^-分子次级离子的形式)，其在SIMS 分析仪中容易地计数(扩增)。¹⁴N/¹⁵N同位素比增加的测量使得能够定量与抗 体结合的那些靶蛋白。

图2：取决于探针或靶标是否被标记的DIR的增加或减少。

图3：¹⁵N的同位素分数。

图4：¹³C的同位素分数。

图5：抗体-靶标相互作用的SIMS分析。Wtap，仅具有抗体(抗-CD34) 的晶片；Wtap，具有抗体加上靶蛋白(CD34)的晶片；Wbsa，具有抗体加 上对照蛋白(牛血清白蛋白)的晶片。利用在NanoSIMS 50中连续扫描(即在 不同深度)获得检测同位素比(¹²C¹⁵N/(¹²C¹⁵N+¹²C¹⁴N))。

图6：抗体-靶标相互作用的平均值。Wtap，仅具有抗体(抗-CD34)的晶 片；Wtap，具有抗体加上靶蛋白(CD34)的晶片；Wbsa，含有抗体加上对 照蛋白(牛血清白蛋白)的晶片。用NanoSIMS 50在各晶片上的抗体点中的 四或五个不同位置扫描2-12次获得检测同位素比 (¹²C¹⁵N/(¹²C¹⁵N+¹²C¹⁴N))。显示了平均值加上平均值的标准误。

图7：与根据以下实验4开发的与SIMS相容的蛋白质芯片技术的原 型。

图8：如实验4中所进行的同位素分数随靶分子量变化的曲线。

发明详述

定义

如本发明所使用，术语“核酸”是指由核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核 糖核苷酸)组成的聚合物，或合成制备的化合物，例如PNA，其可以类似 于两个天然存在的核酸的序列特异性方式与天然存在的核酸杂交，例如， 其可参与Watson-Crick碱基配对相互作用。

如本发明所使用，术语“核糖核酸”和“RNA”是指由核糖核苷酸组成的 聚合物。

如本发明所使用，术语“脱氧核糖核酸”和“DNA”是指由脱氧核糖核苷 酸组成的聚合物。

如本发明所使用，术语“寡核苷酸”表示长度为约10到100个核苷酸 和最多200个核苷酸的单链核苷酸多聚体。

如本发明所使用，术语“样品”涉及包含一种或多种目标组分的材料或 材料混合物，其通常(尽管不是必须)是流体形式。

术语“核苷”和“核苷酸”旨在包括不仅包含已知嘌呤和嘧啶碱基，而且 包含经过修饰的其他杂环碱基的那些部分。这种修饰包括甲基化的嘌呤或 嘧啶、酰化的嘌呤或嘧啶、烷基化的核糖或其他杂环。此外，术语“核苷” 和“核苷酸”包括不仅包含常规核糖和脱氧核糖，而且也包含其他糖的那些 部分。修饰的核苷或核苷酸也包括糖部分上的修饰，例如，其中一个或多 个羟基被卤素原子或脂族基团取代，或功能化为醚、胺等。

如本发明所使用，术语“蛋白质”是指通过肽键连接在一起的氨基酸残 基的聚合物。如本发明所使用的，该术语是指任何尺寸、结构或功能的蛋 白质、多肽和肽。然而，通常，蛋白质长度为至少六个氨基酸。优选地， 如果蛋白质是短肽，其长度至少为约10个氨基酸残基。蛋白质可以是天 然存在的、重组的或合成的，或这些的任意组合。蛋白质也可以仅是天然 存在的蛋白质或肽的片段。蛋白质可以是单个分子或可以是多分子复合 物。术语蛋白质也可以适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存 在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物。其中一个或多个氨基酸残 基是“非天然”氨基酸(非对应于任何天然存在的氨基酸)的氨基酸聚合物包 括在本发明的术语“蛋白质”内。

短语“与固体支持体的表面结合的寡核苷酸”是指固定在固体基底表 面上某点中的寡核苷酸或其模拟物(例如PNA)，其中所述基底可以具有各 种构型，例如薄片、珠或其他结构。在某些实施方式中，此处使用的寡核 苷酸特征的集合存在于相同平面支持体的表面上，例如以阵列的形式。

术语“阵列”包括术语“微阵列”和“纳米阵列”。如下文所详细描写，阵 列通常由与固体支持体表面结合的多个明显不同或不同的探针组成，也称 为基底固定探针。在一个实施方式中，本发明的阵列是同阵列(homoarray)， 其中本发明的阵列包含仅一种化学类型的探针，即仅核酸探针或者仅肽或 蛋白质探针等。在另一个实施方式中，本发明的阵列是异阵列，其中本发 明的阵列包含多种探针类型的混合物，例如核酸探针和蛋白质探针的混合 物。

术语“纳米孔”适用于其中探针结合的纳米尺度的区域。术语“微孔”适 用于其中探针结合的微米尺度的区域。

术语“纳米阵列装置”或NAD适用于微米尺度的特征(其可以单个芯片 上的多个相同副本或不同形式存在)。NAD可以包含一组纳米孔或仅包含 一组离散区域(不具有孔，但包含探针)，其本身可以在或不在微孔内。

术语“常见次级离子”是指在SIMS中产生和分析且不包含其组成元素 的稳定(或不稳定)的稀有同位素或外源同位素(⁷⁹Br、⁸¹Br)的那些离子。常 见次级离子的实例包括¹²C、¹⁴N、³²S、⁸⁰Br、¹⁶O等。

术语“稀有次级离子”是指在SIMS中产生和分析且包含用于标记探针 和/或靶分子的比例的其组成元素的至少一种稳定(或不稳定)的稀有同位 素或至少一种外源同位素的那些离子。稀有次级离子的实例包括¹³C、¹⁵N、 ¹³C¹⁴N、¹²C¹⁵N、¹³C¹⁵N。

术语“背景常见次级离子”是指在SIMS中产生和分析且以天然存在的比 例(与用于标记探针和/或靶分子的比例相反)包含其组成元素的稳定(或不稳 定)的稀有同位素的那些离子。以其天然比例的天然次级离子的实例包括比例 为0.98538：0.01096：0.00362：0.00004的¹²C¹⁴N^-、¹³C¹⁴N^-、¹²C¹⁵N^-和¹³C¹⁵N^-。

应用于离散区域或微孔或纳米孔的术语“检测同位素比”或DIR是指 由SIMS或由相关方法获得的常见次级离子数与常见离子数加上至少一种 稀有次级离子数的总和的比例(例如¹²C¹⁴N^-/(¹²C¹⁴N^-+¹²C¹⁵N^-)或 ¹²C¹⁴N^-/(¹²C¹⁴N^-+¹³C¹⁴N^-)或¹²C¹⁴N^-/(¹²C¹⁴N^-+¹²C¹⁵N^-+¹³C¹⁴N^-)或 ¹²C¹⁴N^-/(¹²C¹⁴N^-+¹²C¹⁵N^-+¹³C¹⁴N^-+¹³C¹⁵N^-)或¹²C^-/(¹²C^-+¹³C^-)等)。图2显示取决 于是否探针或靶标被标记的DIR的增加或减少。(如果探针和靶标都被例 如不同的同位素标记，对于各特定情况必须算出DIR变化的方向)。

术语“外源同位素”是指不是生物分子(探针和靶标)天然包含的、但已由用 户添加至这些分子中的那些同位素。外源同位素可以经由标准化学或生物化 学作用共价连接至生物分子。或者，外源同位素可以共价连接至本身与探针 或靶标强烈相互作用或不明显降低探针对靶标的识别的分子上。外源同位素 的实例包括⁷⁹Br和⁸¹Br。

术语“参照离散区域”是指其中探针(标记的或未标记的)未与待测试样品 接触或其中不存在探针和靶标之间的特异性相互作用(即靶标不存在于待分 析样品中)的离散区域、微孔或纳米孔。

本发明

尽管以¹⁵N标记探针来实施本发明的方法，发明人发现用不包含对应 于用于标记探针的稀有同位素(在这种情况下是氮(¹⁴N))的常见次级离子 的亲水聚合物涂覆阵列产生了本发明方法的额外优点，因为其阻止存在 于待测试样品中的任何疏水性分子(例如核酸、肽或蛋白质)的非特异性吸 附，且因此使背景最小化。事实上，为了使背景最小化，本领域技术人员已 经在常规方法中以牛血清白蛋白(BSA)或酪蛋白涂覆阵列。然而，发明人发现 以BSA或酪蛋白涂覆阵列在本发明方法中增强了背景，因为其包含氮。因此， 他们找到采用不包含对应于用于标记探针的稀有同位素的常见次级离子 的亲水聚合物(例如聚乙二醇)来使背景最小化的另一种方法。不被任何理 论束缚，发明人认为与亲水聚合物结合的大量水分子阻止疏水性分子的 非特异性结合，从而使背景最小化。

支持材料和表面的性质

本发明的一个目的是包含具有导电表面和多个离散区域的基本上平面 的基底的阵列，所述离散区域可以是或不是孔的形式，包含用至少一种 稀有的同位素(例如稳定的重或轻同位素或者不稳定同位素)或用至少一 种外源同位素(例如⁷⁹Br、⁸¹Br)标记的探针，其中所述阵列或离散区域用 不包含对应于用于标记探针的稀有或外源同位素的常见次级离子的亲水 聚合物涂覆。

根据本发明，用于标记探针的稀有或外源同位素是检测待测试样品 中的靶标的手段；因此，术语“不包含对应于用于标记探针的稀有或外源 同位素的常见次级离子的亲水聚合物”等同于“不包含对应于用于检测靶 标的稀有或外源同位素的常见次级离子的亲水聚合物”。

根据本发明，具有导电表面的基本上平面的基底是硅晶片或由金、 银、铝、铜、铂、钯或其他金属，或半导体(例如GaAs、InP)，或经处理 使表面导电的其他材料(例如聚合物材料、聚合物涂覆的材料、超导材料、 陶瓷、金属氧化物、二氧化硅等)制成的任何其他固体或半固体表面。

在本发明的一个实施方式中，所述具有导电表面的基本上平面的基 底与SIMS相容。

在本发明的优选实施方式中，所述SIMS相容的具有导电表面的基本 上平面的基底是硅晶片。

根据本发明，当探针以¹⁵N标记时，术语“不包含对应于用于标记探针 的稀有或外源同位素的常见次级离子的亲水聚合物”是指例如不包含氮， 尤其是¹⁴N的聚合物。在另一个实施例中，当探针以³³S、³⁴S或³⁶S标记时， 其是指不包含硫，尤其是³²S的聚合物。常见次级离子的实例包括¹H、¹²C、 ¹⁴N、³²S、⁸⁰Br、¹⁶O...

在本发明的一个实施方式中，本发明的所述亲水聚合物(即，其不包含 对应于用于标记探针的稀有或外源同位素的常见次级离子)包含用于标记 探针的至少一种所述稀有稳定同位素或外源同位素。例如，所述亲水聚合 物可以仅包含¹³C作为碳原子(且无¹²C原子，因为其对应于常见次级离子)， 和/或仅包含²H作为氢原子(且无¹H原子，因为其对应于常见次级离子)， 和/或仅包含¹⁵N作为氮原子(且无¹⁴N原子，因为其对应于常见次级离子)。

根据本发明的一个实施方式，所述不包含对应于用于标记探针的稀有 或外源同位素的常见次级离子的亲水聚合物可以选自下组：单糖、二糖、 多糖(例如葡聚糖)、化学修饰的多糖(例如羟甲基纤维素)和合成亲水聚合 物(例如直链或支链聚乙烯醇)。所述亲水聚合物也可以是蛋白质，其是天 然的或化学修饰的，象例如蛋白A。

根据本发明的一个实施方式，所述合成亲水聚合物是聚乙二醇。聚乙二 醇具有尤其是不含氮或硫的优点，因此当探针标记以¹⁵N或³³S、³⁴S和³⁶S进行 时，可优选使用聚乙二醇。

根据本发明的一个实施方式，所述亲水聚合物涂覆在基本上平面的基 底的整个表面上。根据这种实施方式，在整个表面上阻止了存在于待测试 样品中的分子的非特异性结合，从而避免待测试分子的背景和非特异性结 合。

微孔形式的离散区域

本发明的另一个目的是作为上述的微阵列的微孔阵列，其中所述离散 区域是包含用至少一种稳定或不稳定的稀有同位素标记的探针的微孔。所 述微孔可以是任何形状，例如点、线、圆、正方形或三角形，且可以任何 较大的图案排列，例如行和列、点阵、栅格等。这些微孔包含用至少一种 稳定或不稳定的稀有同位素标记的探针。

在本发明的一个实施方式中，本发明的微孔阵列包含10到100000个 微孔，在另一个实施方式中包含10到25000个微孔，在另一个实施方式 中包含100到10000个微孔且在另一个实施方式中包含1000到5000个微 孔。

在本发明的一个实施方式中，适当确定所述微孔的形状和尺寸以在各 微孔中储存单细胞。

在一个实施方式中，各微孔的长度、宽度或直径尺寸之一为1μm到 1000μm，在另一个实施方式中为1μm到500μm，在另一个实施方式中 为1μm到200μm且在另一个实施方式中为1μm到100μm。

在一个实施方式中，各微孔的深度为1μm到100μm，在另一个实施 方式中为1μm到50μm，在另一个实施方式中为5μm到20μm。

各微孔之间的距离可以为25到5000μm，在另一个实施方式中为100 到1000μm且在另一个实施方式中为50μm到150μm。

微孔可以是任何形状：例如它可以是圆筒形、非圆筒形如具有多个面 的多面体，如平行六面体、六角柱、八角柱)、倒锥形、倒金字塔形，或它 可以具有组合两种或更多种这些形状的形状。对于圆锥形和平行六面体 形，微孔的底部通常为平面，但也可以是弯曲表面(凸面或凹面)。

在本发明的一个实施方式中，带有该组微孔的基本上平面的导电表面 可以成形为矩形固体或圆盘(尽管其他形状是可能的)，长度为1cm，宽度 为1cm且厚度为约250μm。

纳米孔形式的离散区域

本发明的另一个目的是作为上述的纳米阵列的纳米孔阵列，其中所述 离散区域是包含用至少一种稳定或不稳定的稀有同位素标记的探针的纳 米孔。所述纳米孔可以是任何形状，例如点、线、圆、正方形或三角形， 且可以任何较大的图案排列，例如行和列、点阵、栅格等。这些纳米孔包 含用至少一种稳定或不稳定的稀有同位素标记的探针。

在本发明的一个实施方式中，本发明的纳米孔阵列包含10到100000 个纳米孔，在另一个实施方式中包含10到25000个纳米孔，在另一个实 施方式中包含100到10000个纳米孔且在另一个实施方式中包含1000到 5000个纳米孔。

在一个实施方式中，各纳米孔的长度、宽度或直径尺寸之一为1nm 到1000nm，在另一个实施方式中为5nm到500nm，在另一个实施方式 中为10nm到200nm且在另一个实施方式中为50nm到100nm。

在一个实施方式中，各纳米孔的深度为1nm到100nm，在另一个实 施方式中为1nm到50nm，在另一个实施方式中为5nm到20nm。

各纳米孔之间的距离可以为10到1000nm，在另一个实施方式中为 50到500nm且在另一个实施方式中为100到200nm。

所述纳米孔可以是任何形状：例如它可以是圆筒形、非圆筒形(例如具 有多个面的多面体，如平行六面体、六角柱、八角柱)、倒锥形、倒金字塔 形，或它可以具有组合两种或更多种这些形状的形状。对于圆锥形和平行 六面体形状，纳米孔的底部通常为平面，但也可以是弯曲表面(凸面或凹 面)。

在本发明的一个实施方式中，带有该组纳米孔的基本上平面的导电表 面可以成形为矩形固体或圆盘(尽管其他形状是可能的)，长度为1cm，宽 度为1cm且厚度为约250μm。

不是孔形式的离散区域

本发明的另一个目的是作为一组离散区域或图案单元的排列的阵列， 其在基底上形成较大的图案。所述离散区域或图案单元可以是任何形状， 例如点、线、圆、正方形或三角形，且可以任何较大的图案排列，例如行 和列、点阵、栅格等。这些离散区域包含用至少一种稳定(或不稳定)的稀 有同位素标记的探针。

在本发明的一个实施方式中，本发明的阵列包含10到100000个离散 区域，在另一个实施方式中包含10到25000个离散区域，在另一个实施 方式中包含100到10000个离散区域且在另一个实施方式中包含1000到 5000个离散区域。

在一个实施方式中，本发明的阵列是微阵列。在该实施方式中，各离 散区域的长度、宽度或直径尺寸之一为1μm到1000μm，在另一个实施 方式中为1μm到500μm，在另一个实施方式中为10μm到200μm且在 另一个实施方式中为50μm到100μm。各离散区域之间的距离可以为10 到1000μm，在另一个实施方式中为50到500μm且在另一个实施方式中 为100μm到200μm。

在本发明的一个实施方式中，本发明的阵列是纳米阵列。在该实施方 式中，各离散区域的长度、宽度或直径尺寸之一为1nm到1000nm，在另 一个实施方式中为5nm到500nm，在另一个实施方式中为10nm到200nm 且在另一个实施方式中为50nm到100nm。各离散区域之间的距离可以为 10到1000nm，在另一个实施方式中为50nm到500nm且在另一个实施 方式中为100μm到200nm。

在本发明的一个实施方式中，带有该组离散区域的膜或硅晶片可以成 形为矩形固体或圆盘(尽管其他形状是可能的)，长度为1cm，宽度为1cm 且厚度为约250μm。

探针

探针的化学性质和同位素组成

在该实施方式中，与靶标(通常为构成细胞的生物分子，但甚至是病毒、 细胞器或细胞本身)结合的探针可以由任何分子(生物的或非生物的)构成，例 如核酸(寡核苷酸、DNA、RNA、PNA、适体)、肽或蛋白质(抗体、酶)、配体 (抗原、酶底物、受体或受体的配体)、聚糖、脂质、聚胺、分子印记的聚合物、 噬菌体、病毒或这些分子的组合。

优选地，探针是能够与其靶标分子特异性结合(例如经由非共价键)的分 子，或与其靶标分子特异性相互作用(例如经由杂交，核酸就是这种情况)的分 子。

根据本发明，探针包含至少一种稳定或不稳定的稀有同位素：

在一个实施方式中，探针包含至少一种稳定的重同位素，例如²H、¹³C、 ¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、³³S、³⁴S和³⁶S。

在另一个实施方式中，探针包含至少一种不稳定同位素，例如³H和 ¹⁴C，

在另一个实施方式中，探针包含至少一种外源同位素，例如⁷⁹Br和 ⁸¹Br。

探针的连接或接枝

探针连接或接枝到阵列上由本领域公知的技术实现。探针可吸附、物理 吸附、化学吸附或共价连接至阵列上。平版印刷打印也可以用于使探针以图 案化方式直接或间接地转移和吸收到表面上。

例如，探针的连接可通过将官能团引入到表面上以形成所述表面和待接 枝探针之间的化学反应而实现。

羧基(COOH)是最为人所知的用于接枝的官能团。化学键在来自蛋白质的 氨基和羧基官能团之间生成。丙烯酸或共聚化的乙烯基硅烷和马来酸酐也可 用于采用例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐产生作为间隔基 以将蛋白质接枝到表面上的硅-COOH底物。

在本发明的一个实施方式中，探针连接或接枝到阵列上经由涂覆到阵列 上的亲水聚合物的功能化而实现。

例如，在本发明的一个实施方式中，阵列涂覆有用N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)功能化的聚乙二醇以允许探针接枝。这一接枝具有实施非常简单的优 点。

探针的识别

在其中多种不同探针连接至阵列的一个实施方式中，探针经由包含所述 探针的离散区域的位置或坐标来识别。

样品的性质和来源

根据本发明的方法，待测试样品可从细胞、组织、器官、体液(例如血清、 血浆、精液、滑液、脑脊液、血液或尿液)、细胞培养物、水(例如污水、淡水、 近岸海水、地下水).....分离。

根据本发明的方法，待测试样品可以包含核酸(寡核苷酸、DNA、RNA、 PNA)、肽或蛋白质(抗体、酶)、配体(抗原、酶底物、受体或受体的配体)、聚 糖、脂质、聚胺、噬菌体、病毒或其组合。因此待测试生物分子可以是核酸(寡 核苷酸、DNA、RNA、PNA)、肽或蛋白质(抗体、酶、朊病毒)、配体(抗原、 酶底物、受体或受体的配体)、聚糖、脂质、聚胺、噬菌体、病毒或其组合。

探针的标记

根据本发明的方法，探针或靶标(即存在于待测试样品中的生物分子)用稳 定或不稳定的稀有同位素或外源同位素标记。

在一个实施方式中，探针或靶标可以用至少一种稳定的稀有同位素例如 ²H、¹³C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、³³S、³⁴S和³⁶S标记。

在另一个实施方式中，探针或靶标可以用至少一种不稳定同位素，例 如³H和¹⁴C标记。

在另一个实施方式中，探针或靶标可以用至少一种外源同位素，例如 ⁷⁹Br和⁸¹Br标记。

标记的探针可以通过体内和体外两种技术获得：

在体外标记的情况中，1)聚合酶链反应用于产生标记的寡核苷酸， 2)肽合成用于产生标记的肽，3)体外转录/翻译用于产生标记的RNA和 标记的蛋白质，4)反转录用于产生标记的cDNA，5)化学合成用于产生 标记的PNA。

在体内标记的情况中，原核或真核细胞生长在包含营养物(例如NH₄Cl、 葡萄糖和氨基酸)的培养基中，所述营养物用²H、¹³C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、³³S、 ³⁴S和³⁶S的组合标记或用³H、¹⁴C或其他具有长的半衰期的不稳定同位素 的组合标记。因此这些细胞产生标记的探针(例如抗体或噬菌体或核酸或蛋 白质或糖或其他细胞成分)。

当将要标记靶标(即存在于待测试样品中的生物分子)时，通常细胞生 长在包含营养物(例如NH₄Cl、葡萄糖和氨基酸)的培养基中，所述营养物用 ²H、¹³C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、³³S、³⁴S和³⁶S的组合或用³H和¹⁴C的组合标记。 因此这些细胞产生标记的生物分子。

样品与阵列之间的接触

在本发明方法的一个实施方式中，使待测试样品与包含多种不同探针 的阵列(微阵列或纳米阵列)接触。

在另一个实施方式中，当将要测试多个样品时，各样品与微孔阵列的一 个或多个微孔接触。

在另一个实施方式中，当待测试样品的数目和多样性对应于单细胞的数 目和多样性时，使经由适当的方法获得的各单细胞的内容物与微孔阵列的一 个微孔接触。

探针和靶标之间的相互作用的条件

然后样品在允许探针存在于阵列上以与靶生物分子相互作用的条件下与 阵列接触。

然后在通常不存在常见¹²C和¹⁴N同位素的多种缓冲液(例如磷酸盐缓冲 盐水)中进行探针与其靶标的结合。在以纯水小心洗涤(优选在低温下以限制探 针从其靶标解离)以去除盐(其可能在干燥步骤形成结晶)、未结合分子和大的 细胞碎片后，阵列在无灰尘的气氛中在真空烘箱中或通过冻干干燥。

通过SIMS及其他相关技术检测

根据本发明的方法，计数稀有和常见次级离子的数目以获得检测同位素 比允许检测探针/靶标二重体。

在一个实施方式中，探针/靶标二重体通过动态次级离子质谱法(D-SIMS) 检测。在另一个实施方式中，探针/靶标二重体通过飞行时间次级离子质谱法 (TOF-SIMS)检测。

次级离子质谱法(SIMS)允许基于在初级离子能量束的撞击下从固体样品 的表面(1nm-1μm深度)提取的次级离子的质谱分析来分析无机和有机材料 的表面组成。分子在D-SIMS中被初级离子束通过动态D-SIMS完全破碎成 其组成原子或通过ToF-SIMS部分破碎成分子片段(例如氨基酸)。SIMS相关 技术例如激光SNMS也可以用于检测探针/靶标相互作用。

在本发明方法的一个实施方式中，连接至阵列的探针用稳定或不稳定的 稀有同位素或外源同位素标记。在这一实施方式中，待测试样品具有仅以其 天然比例(或甚至低于这些比例)包含这些稀有同位素的生物分子。

探针/靶标相互作用的存在通过比较由各离散区域、微孔或纳米孔获得的 检测同位素比与由参照离散区域、微孔或纳米孔或者其中不存在标记的探针 和靶标之间的特异性相互作用(即待分析样品中不存在靶标)或其中存在未标 记探针和未标记靶标之间的特异性相互作用的离散区域获得的背景检测同位 素比来确定。

因此，在探针标记而靶标未标记的情况下，如果由一个离散区域、微孔 或纳米孔获得的检测同位素比明显优于由参照离散区域、微孔或纳米孔获得 的检测同位素比，则揭示探针/靶标相互作用的存在。例如，在探针用¹³C标 记的情况下，如果对于相同的仪器设置由一个离散区域、微孔或纳米孔获得 的探测同位素比¹²C/(¹²C+¹³C)(或者可选择地，¹²C¹⁴N/(¹²C¹⁴N+¹²C¹⁵N))优于 由参照离散区域、微孔或纳米孔获得的检测同位素比，则揭示探针/靶标相 互作用的存在。

因此，在探针未标记而靶标标记的情况下，如果由一个离散区域、微孔 或纳米孔获得的检测同位素比明显次于由参照离散区域、微孔或纳米孔获得 的检测同位素比，则揭示探针/靶标相互作用的存在。例如，在探针用¹³C标 记的情况下，如果对于相同的仪器设置由一个离散区域、微孔或纳米孔获得 的¹²C/(¹²C+¹³C)次级离子比(或者可选择地，¹²C¹⁴N/(¹²C¹⁴N+¹²C¹⁵N))次于 由参照离散区域、微孔或纳米孔获得的这一次级离子比，则揭示探针/靶标 相互作用的存在。

因此，在探针和靶标用相同的一种或多种同位素标记的情况中，如果 由一个离散区域、微孔或纳米孔获得的检测同位素比明显不同于由参照离 散区域、微孔或纳米孔获得的检测同位素比，则揭示探针/靶标相互作用的存 在。

根据本发明，探针或靶标也可以用其组成元素的一种以上稳定或不稳定 的稀有同位素或者外源同位素标记。例如，探针或靶标可以用¹³C和¹⁵N标记。 探针的多重标记例如¹³C¹⁵N对于使背景最小化特别有用。

根据本发明，在靶标以稳定(或不稳定)的稀有同位素标记的情况中，各种 实验条件(例如有和没有药物处理)可由各条件的不同标记方式来区分。

检测和定量方法

本发明的一个目的是用于检测和定量至少一种样品中至少一种生物分子 的存在或不存在的方法，包括：

(a)使至少一个所述样品在允许存在于阵列上的探针与靶生物分子相互 作用的条件下与阵列接触，阵列上存在的探针或样品中存在的生物分子以至 少一种稳定(或不稳定)的稀有同位素标记，

(b)洗涤并干燥阵列，

(c)通过SIMS检测并计数常见次级离子以及相应的稀有次级离子。

这允许测定DIR。

然后将由各离散区域、微孔或纳米孔获得的DIR与由参照离散区域、微 孔或纳米孔获得的DIR相比较；DIR的显著变化(参见图2)是存在(检测到)探 针/靶标相互作用的证据。此外，DIR的精确测定允许定量探针和靶标之间的 相互作用的数目。DIR的精确测定在溅射最大量的材料从而获得常见和稀有 次级离子的良好计数统计后获得。为计算每一离散区域(微孔或纳米孔或甚至 是离散区域内的样品单元区域)与探针相互作用的靶标数目，必须了解：a)离 散区域的表面上探针的密度和b)在单个探针和单个靶标中各目标同位素的原 子数目。然后这种知识允许对随每一离散区域的靶标数目变化的DIR作图。

本发明的应用

根据另一个实施方式，所述用于检测和定量至少一个样品中至少一种生 物分子的存在或不存在的方法允许测定所述样品的分子图谱，其意味着测定 所述样品的转录组、蛋白质组、脂质组、代谢组、糖组或相互作用组，或允 许测定单细胞中的生物分子及其相互作用。

应用于分子图谱

根据本发明的一个实施方式，用于检测和定量样品中至少一种生物分子 的存在或不存在的方法旨在提供所述样品的分子图谱。

在一个实施方式中，待检测和定量的生物分子的多样性是基因组序列， 从而允许测定所述样品中的基因组变异。

在另一个实施方式中，待检测和定量的生物分子的多样性是RNA，从而 允许测定所述样品的转录组。

在另一个实施方式中，待检测和定量的生物分子的多样性是蛋白质，从 而允许测定所述样品的蛋白质组。

在另一个实施方式中，待检测和定量的生物分子的多样性是脂质，从而 允许测定所述样品的脂质组。

在另一个实施方式中，待检测和定量的生物分子的多样性是代谢物，从 而允许测定所述样品的代谢组。

在另一个实施方式中，待检测和定量的生物分子的多样性是糖基化蛋白 质，从而允许测定所述样品的糖组。

在另一个实施方式中，待检测和定量的生物分子的多样性是与至少一种 特异性探针相互作用的蛋白质，从而允许测定所述样品的相互作用组。

应用于单细胞

根据本发明的另一个实施方式，用于在单细胞水平检测和定量至少一种 生物分子的存在或不存在的方法旨在提供单细胞水平的分子图谱。

在一个实施方式中，待检测和定量的生物分子的多样性是基因组序列， 从而允许测定单细胞水平的基因组变异。

在另一个实施方式中，待检测和定量的生物分子的多样性是RNA，从而 允许测定单细胞水平的转录组。

在另一个实施方式中，待检测和定量的生物分子的多样性是蛋白质，从 而允许测定单细胞水平的蛋白质组。

在另一个实施方式中，待检测和定量的生物分子的多样性是脂质，从而 允许测定单细胞水平的脂质组。

在另一个实施方式中，待检测和定量的生物分子的多样性是代谢物，从 而允许测定单细胞水平的代谢组。

在另一个实施方式中，待检测和定量的生物分子的多样性是糖基化蛋白 质，从而允许测定单细胞水平的糖组。

在另一个实施方式中，待检测和定量的生物分子的多样性是与至少一种 特异性探针相互作用的蛋白质，从而允许测定单细胞水平的相互作用组。

应用于疾病

本发明的另一个目的是所述用于检测和定量样品中至少一种生物分子或 在单细胞水平检测和定量至少一种生物分子的方法在以下方面的用途：

-预测疾病倾向，或用于诊断受试者的疾病，

-筛选治疗剂，

-监测施用于受试者以治疗疾病的治疗剂的效力。

本发明的另一个目的是用于预测疾病倾向或用于诊断受试者的疾病的方 法。该方法包括：

(a)使至少一种从所述受试者中分离的样品在允许存在于阵列上的探针 与已知与所述疾病相关或在所述疾病中差异表达的靶生物分子相互作用的条 件下与阵列接触，阵列上存在的探针以至少一种稳定(或不稳定)的稀有同位素 标记，

(b)洗涤并干燥阵列，

(c)通过SIMS检测并计数常见次级离子及相应的稀有次级离子，其中探 针和靶标之间的相互作用的数目通过将由各离散区域、微孔或纳米孔获得的 DIR与由参照离散区域、微孔或纳米孔或者由其中不存在探针和靶标之间的 特异性相互作用(即待分析样品中不存在靶标)或其中存在未标记探针和未标 记靶标之间的特异性相互作用的离散区域获得的DIR相比较来定量，

(d)将所述表达谱与标准谱相比较，其中已知与所述疾病相关或在所述疾 病中差异表达的所述至少一种生物分子的存在/不存在或增加/减少指示发生 疾病或存在疾病的可能性。

在一个实施方式中，所述受试者是哺乳动物。在优选的实施方式中，所 述受试者是人。

根据本发明的方法，待测试样品可从受试者的细胞、组织、器官或体液(例 如血清、血浆、精液、滑液、脑脊液、血液或尿液)分离。

样品可来源于疾病细胞或组织。例如，所述细胞或组织可被病原体(例如 HIV、流感、疟疾、肝炎、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒)感染。在一个实施方 式中，所述细胞或组织被病毒性或细菌性病原体感染。在另一个实施方式中， 所述疾病是癌症。在另一个实施方式中，所述疾病是神经退行性疾病，例如 帕金森病、阿尔茨海默病或多发性硬化。

在本发明的一个实施方式中，所述方法旨在预测癌症倾向或用于诊断受 试者的癌症。

在本发明的另一个实施方式中，所述方法旨在预测细菌性疾病的倾向或 诊断细菌性疾病。

在本发明的另一个实施方式中，所述方法旨在预测病毒性疾病的倾向或 诊断病毒性疾病。

本发明的另一个目的是用于筛选治疗剂的方法，包括：

(a)以至少一种目标治疗剂培养细胞，

(b)使至少一个分离自所述培养物的样品在允许存在于阵列上的探针与 靶生物分子相互作用的条件下与阵列接触，阵列上存在的探针以至少一种重 同位素或不稳定同位素标记，

(c)洗涤并干燥阵列，

(d)通过SIMS检测并计数常见次级离子及相应的稀有次级离子，其中探 针和靶标之间的相互作用的数目通过将由各离散区域、微孔或纳米孔获得的 DIR与由参照离散区域、微孔或纳米孔或者由其中不存在探针和靶标之间的 特异性相互作用(即待分析样品中不存在靶标)或其中存在未标记探针和未标 记靶标之间的特异性相互作用的离散区域获得的DIR相比较来定量，

(e)将所述表达谱与标准谱相比较，其中特定生物分子的增加或减少指示 所述治疗剂的效力。

本发明的另一个目的是用于监测施用于受试者以治疗疾病的治疗剂的效 力的方法，所述方法包括：

(a)使至少一个分离自所述受试者的样品在允许存在于阵列上的探针与 靶生物分子相互作用的条件下与阵列接触，阵列上存在的探针以至少一种重 同位素或不稳定同位素标记，

(b)洗涤并干燥阵列，

(c)通过SIMS检测并计数常见次级离子及相应的稀有次级离子，其中探 针和靶标之间的相互作用的数目通过将由各离散区域、微孔或纳米孔获得的 DIR与由参照离散区域、微孔或纳米孔或者由其中不存在探针和靶标之间的 特异性相互作用(即待分析样品中不存在靶标)或其中存在未标记探针和未标 记靶标之间的特异性相互作用的离散区域获得的DIR相比较来定量，

(d)在治疗受试者期间的不同时间从所述样品获得至少一种生物分子的 表达谱，

(e)将所述表达谱与标准谱相比较，其中已知与所述疾病相关或在所述疾 病中差异表达的所述生物分子的增加或减少指示所述治疗剂治疗受试者的效 力。

实施例

在以下描述中，没有给出详细方案的所有实验根据标准方案进行。

包括以下实施例来说明本发明的优选实施方式。本领域技术人员应理解， 公开在以下实施例中的技术代表由发明人发现能在本发明实施中起很好作用 的技术，且因此可被认为构成其实施的优选方式。然而，根据本公开的内容， 本领域技术人员应理解在不离开本发明精神和范围的前提下，可对所公开的 具体实施方式进行许多变化并仍然获得同样或类似的结果。

实验1：

该实验显示SIMS技术允许定量地检测含有同位素标记的蛋白质和不同 量的未标记分子的混合物中¹³C同位素的比例。

同位素标记和稀释

同位素标记的分子通常以包含保护剂和防腐剂例如甘油(¹²C的源)和叠 氮化钠(¹⁴N的源)的缓冲液提供。这些试剂用于保持透析膜(如由Millipore 提供的)。以下实验的目的是测定去除它们所需要的透析条件。

蛋白质从在其中唯一可得的氮是¹⁵N的基本培养基中生长的大肠杆菌提 取。采用SIMS，发现这些蛋白质的同位素分数是97.8％+0.02％。20μg的这 些标记蛋白质在水中在未洗涤或预先洗涤的Millipore透析膜上透析6小 时。图3显示透析溶液中¹⁵N的同位素分数。

经洗涤膜的同位素分数水平类似于对照(97.9％+0.02％)，而未洗涤膜(包 含污染物氮)的同位素分数水平较低(92.1％+1.4％)。因此，预洗涤透析膜恢复 初始的同位素分数。

也从在其中唯一的可得的碳是¹³C的培养基中生长的细菌中提取蛋白质。 如SIMS测量的，这些蛋白质的同位素分数是86％+0.5％。然后将这些蛋白质 溶解在水中，且使它们的第二溶液制备成10％甘油的最终浓度。图4显示这 些溶液中¹³C的同位素分数。

加入甘油将同位素分数降低至78％+2％，但初始分数(86％+2％)通过随后 去除甘油的透析而恢复。

实验2：

该实验显示同位素标记的寡核苷酸(探针)可以采用PCR技术和不包含氮 化合物(其作为污染物可能干扰“定义”部分中所描述的DIR测量)的非常规缓 冲液来制备。

用硼砂缓冲液减少氮污染

介绍

生物学的许多方法使用Tris基缓冲剂。这种有机分子是优秀的缓冲剂， 且其不导致钙盐或镁盐的沉淀。然而，对于我们的方法，Tris具有包含¹⁴N 并且对DNA(及其他大分子)具有强亲合性的缺点。这一缺点的产生是因为这 种¹⁴N是取决于精确测量由¹⁵N探针和¹⁴N靶标杂交而产生的¹⁵N/(¹⁴N+¹⁵N)比 的我们的方法中的重要污染物。

制备不含污染物氮的DNA的两种途径是i)在缓冲液中使用Tris并在 DNA制备后将其去除，或ii)使用无Tris的缓冲液。因为第一种方法需要耗时、 浪费且昂贵的纯化方法，我们采用第二种方案来提供用于PCR(聚合酶链反应) 的适当pH和浓度条件。尽管据我们所知，没有文献描述硼砂缓冲液用于PCR 中，我们使用硼砂缓冲液，一种不含氮且保持与Tris缓冲液相同的pH值的 无机缓冲液。

材料和方法

PCR法

  化学剂   初始浓度   体积   最终浓度   硼砂缓冲液   0.08M   12.5   20mM   KCl   1M   2.5   50mM   MgCl₂  25mM   4   2mM   dNTP   10mM   2   0.8mM   Taq聚合酶   1U/μL   2.5   0.05U/μL   引物S   100μM   0.5   1μM   引物AS   100μM   0.5   1μM   DNA样品   -   1   水   -   24.5   总计   50

来自PML基因的200bp的DNA序列被扩增。模板本身仅采用一轮扩增 制备(以避免错误产生)。进行20个循环的PCR来定量测定硼砂缓冲液的效果 (和限制错误产生)或进行60个循环来消耗限制性底物并获得最大扩增。通过 在1％琼脂糖凝胶上电泳来分析扩增子。以下显示Tris缓冲液和硼砂缓冲液的 结果。

结果

在扩增20个循环的情况下，硼砂缓冲液获得Tris缓冲液的一半产量，而 且显著地，硼砂缓冲液不产生不同尺寸的扩增子。这意味着聚合酶持续复制 到模板末端。在60个循环扩增的情况下，Tris和硼砂缓冲液获得类似的结果。

结论

硼砂缓冲液非常适用于反应如PCR扩增，并因此适用于寡核苷酸探针的 合成。因此这种缓冲液可用于如在本发明提出的SIMS分析中所需的避免污 染物氮。

实验3：

制备蛋白质阵列用于通过SIMS检测。

晶片覆涂有以N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)功能化的PEG以允许富含¹⁵N的 抗-CD34抗体与硅晶片的PEG涂层连接。制备了三个相同的抗-CD34晶片。 第一晶片与靶蛋白(Wtap用于靶蛋白)、CD34一起孵育，而作为阴性对照，第 二晶片与BSA(Wbsa用于BSA)一起孵育且第三晶片在相同溶液中但不与蛋白 (Wabo用于仅抗体)一起孵育。

然后用NanoSIMS 50分析这三个晶片。

材料和方法

将抗体连接至硅晶片

富含¹⁵N(检测同位素比为58±11％)的0.22μg/μL的抗CD34抗体(由 Biosynergy，Cambridge UK提供)的1μL溶液沉积在涂覆有用NHS  (Microsurfaces Inc.，Minneapolis，USA)功能化的PEG的硅晶片上。在室温 (25℃)下1h后，表面用PBS pH 7.4 Tween-20(0.1％v/v)溶液洗涤5次，每 次5分钟，然后用PBS pH 8 Tween-20(0.1％v/v)溶液洗涤30分钟，并最后 用水(milli-Q)洗涤5分钟。

与靶蛋白(CD34)和与对照(BSA)一起孵育

为确保用靶蛋白饱和抗体，靶蛋白与抗体(以用于靶标结合的功能定向与 晶片连接)的比例选择为100∶1。我们从供应商的数据(Proteomics 2005，5， 416-419)估计，处于功能定向的抗体的表面浓度为约10¹²蛋白质cm^-2，并因 此抗体连接的晶片上的区域(点)(0.02cm^-2)中有2x 10¹⁰个功能性抗体。因此 我们选择使用提供包含约2x 10¹²个蛋白质的0.1μg的CD34(Mr为35kDa) 的溶液。

将10μL的PBS-Tween-20pH 7.4(Ab+无蛋白质)溶液或含有0.01 μg/μL的重组蛋白质CD-34(Assay Designs，Ann Arbor，USA)的 PBS-Tween-20pH 7.4溶液或含有0.01μg/μL BSA(Sigma)(Ab+BSA)的 PBS-Tween-20 pH 7.4溶液置于晶片表面上。在室温下孵育1h后，晶片表 面用PBS pH 7.4 Tween-20(0.1％v/v)溶液洗涤4次，每次5分钟，然后用水 (milli-Q)洗涤2次，每次5分钟。然后晶片在真空下干燥并采用Cressington 溅射涂布机108自动型用金覆盖60秒。

SIMS分析和同位素分数的计算

晶片表面采用NanoSEVIS 50以成像模式(场：20x 20μm²，128x 128像 素，10ms/像素光圈D_1-)进行分析。这需要在抗体连接的区域内的四到五个 不同位置取样；在这些位置中的每一个进行12次连续扫描。这些扫描在去除 快速(约1.5nm/扫描)溅射的金层后以估计获得0.3nm/扫描的溅射率的设置来 进行。采用下式用第2到第12次扫描的次级离子¹²C¹⁴N，以及 ¹²C¹⁵N，的平均计数数目的总和获得三个样品中每一个的检测同位 素比：

结果：

由仅具有抗体的晶片(Wabo)获得的检测同位素比显示从接近于¹⁵N的天 然同位素比(0.0037)的值单调增加到0.22的平台(图5，Wabo)。这表明含氮 污染物存在于金表面中。这些污染物也在扫描中发现，其解释了为什么0.22 的值显著低于抗体的¹⁵N同位素比的预期值。由具有抗体和靶蛋白CD34的 晶片获得的检测同位素比具有0.083的平台(图5，Wtap)。为改善具有和不具 有靶蛋白的晶片的检测同位素比之间的比较统计，我们合计了从第2到第12 次扫描的计数(图6)。由此获得的检测同位素比显示具有抗体+靶蛋白的晶片 (Wtap＝0.06±0.03)和两个对照晶片(Wabo＝0.20±0.04和Wbsa＝0.19±0.01)之间 的高度显著差异。因此，R_DIR，(检测同位素比Wtap)/(检测同位素比Wabo)， 等于0.30。如果我们假设各抗体与两个靶蛋白结合且抗体和靶标被完全溅射， 我们计算出在不存在含氮污染物的情况下R_DIR应该为0.66，而在具有增加量 的这类污染物时R_DIR应趋向于1。其理由是，给定溅射率的情况下，在晶片 扫描中总共仅溅射3.5-4nm。在晶片具有抗体加靶蛋白的情况下，3.5-4nm 对应于主要是¹⁴N靶蛋白而不是与晶片上的涂层连接的¹⁵N标记的抗体的溅 射。因此这些扫描中测量的检测同位素比Wtap低于如果溅射整个区域将测定 的值。换句话说，该方法允许检测探针与靶标的结合，但需要靶标-探针区域 的完全溅射以获得与探针结合的靶标比例的精确和定量测量。

利用NanoSIMS 50的能力来获得连续扫描的可能性揭示了获得含有探针 和靶标及污染物的区域的结构的三维图像的可能性。很明显，该能力然后可用 于进一步改进该技术。

最后，具有BSA的对照具有类似于不具有蛋白质的对照的检测同位素比。 这显示我们用孵育靶蛋白和抗体以及用于随后的洗涤步骤的材料和方法不导 致蛋白质与表面的非特异性吸附。

尤其是，用聚乙二醇涂覆晶片确实阻止蛋白质与表面的非特异性吸附，而 用BSA或酪蛋白涂覆晶片导致高的背景(数据未显示)。

当与晶片连接的抗体与靶蛋白一起孵育时(Wtar)，对于¹⁵N的检测同位素 比与阴性对照(Wabo，不存在靶蛋白；Wbsa，存在牛血清白蛋白)相比有着明 显下降。这种下降是显著的，如0.0012的P值所示(即确定性为99.88％)。

实验4：

已经开发与SIMS相容的蛋白质芯片技术的原型来研究在重组系统大肠 杆菌中合成的蛋白A(金黄色葡萄球菌)和商业抗体之间的相互作用。

支持体由以N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)功能化的PEG膜覆盖的硅晶片组 成；因此¹⁵N-标记的蛋白A(探针)共价连接至PEG(参见图7)。这些探针以不 同浓度的商业抗体的溶液一起孵育。然后我们确立了取决于与标记的探针相 互作用的靶标的量的信号定量。

材料和方法

富含¹⁵N的蛋白A的生产

生产菌株大肠杆菌BL21(DE3)以表达载体pGTPc500_6His8PSA (32-327)进行转化，在LB琼脂+卡那霉素上进行选择。

然后分离的克隆用于进行生产：

-培养基在含有50mL培养基M9的250mL锥形烧瓶中生长。该培养基 的唯一氮源是¹⁵N氯化铵。搅拌速度是220rpm。

-细菌在37℃下生长后在600nm测量吸光度(A_600nm)。培养物在选择培养 基M9+卡那霉素中孵育过夜。生长曲线显示于图8中。

-通过添加IPTG(异丙基-1-硫代-βD-吡喃半乳糖苷)引发诱导。

-通过在4℃下以14000rpm离心15分钟来收获细菌沉淀。

-将细菌沉淀收集在5mL溶菌缓冲液中(PBS(50mM Na*PO₄，300mM  NaCl，pH7.4)pH 7.4和Triton X-1000.2％)。

-添加最终浓度为1mg/mL的溶菌酶，并在冰中孵育细菌悬液40-45分钟。

-悬液以30秒的四次循环(在循环之间为1分钟)进行超声处理(通过 sonotronde)，前三次循环的功率为50％，最后一次循环的功率为80％。

-在4℃下以18000rpm离心30分钟来分离所获得的溶菌产物的可溶和不 溶部分。

-所使用纯化方案如下：

●缓冲液A：50mM Na*PO₄，300mM NaCl，pH 7.4，40mM咪唑

●缓冲液B：50mM Na*PO₄，300mM NaCl，pH 7.4，500mM 咪唑

●需纯化样品：添加咪唑的上清液，适量达到最终40mM。

●柱：加载镍的“Chelating His-Trap”1ml。

  步骤  描述  体积VdC   流出(mL/min)   级分   平衡  缓冲液A  10   0.8   /   固定  样品  4ml   0.8   不保留   洗涤  缓冲液A  20   0.8   5×4ml   洗脱  缓冲液B  10   0.8   10×1ml

-SDS PAGE凝胶分析和Western印迹。

硅晶片上的蛋白A的共价连接

富含¹⁵N(同位素百分比为88±4％)的0.33μg/μL的1μL蛋白A溶液沉 积在以PEG-NHS(Microsurfaces Inc.，Minneapolis，USA)功能化的硅晶片上。 在室温(25℃)下1h后，表面用PBS pH 7.4 Tween-20(0.1％v/v)溶液清洗5 次，5分钟，然后用PBS pH 8 Tween-20(0.1％v/v)溶液清洗30分钟，并最后 用水(milli-Q)清洗5分钟。

与靶蛋白(抗体)一起孵育

为建立靶分子(抗体)的稀释范围，我们确定对于恒定量(以分子数计)的探 针(A蛋白)进行具有50％、100％、200％和1000％靶分子的溶液。

10μL的含有16.5μg/μL抗体(Sigma，Aldrich，Rockford，USA)的 PBS-Tween-20 pH 7.4溶液以PBS-Tween-20 pH 7.4稀释。各溶液沉积在蛋 白A的点上并在室温下孵育1h，晶片表面用PBS pH 7.4 Tween-20(0.1％ v/v)的溶液清洗4次，5分钟，然后用水(milli-Q)清洗2次，5分钟。然后晶 片在真空下干燥并采用Cressington溅射式涂布机108自动型用金涂覆60秒。

SIMS分析和同位素分数的计算

晶片表面采用NanoSEVIS 50以同位素比模式(场：200x 200μm²，光圈 D2)进行分析。进行切割来确定蛋白A点的位置，在各点上进行十二次分析。 扫描包括600次测量，并平行地研究¹²C¹⁴N和¹²C¹⁵N的分量。为获得同位 素分数，我们使用以下公式：

同位素分数＝(∑n¹²C¹⁵N)/(∑n¹²C¹⁵N+∑n¹²C¹⁴N)。

结果

实验数据

通过绘制随靶分子的量变化的同位素分数的曲线，存在分数12C15N迅 速降低：当蛋白A与等于50％的蛋白A量的抗体量相互作用时，它从 52.93％+6％升高至小于10％(9.17％+3.8％)。对于相当量的靶标和探针，同位 素分数明显高于天然分数：2.89％+1.6对0.366％，而对于较高浓度的靶分子， 200％和1000％，信号非常接近于天然分数，分别为0.43％+0.03％和 0.4％+0.01％。同位素分数的这种剧烈降低通过以下事实解释：靶分子(抗体) 是大小显著大于探针分子的分子，分别为150k Da和33kDa。无论何时相互 作用发生，氮量将从蛋白A的425个氮原子极大地变化到蛋白A/抗体复合物 的约2500个氮原子。这表明SIMS NAD芯片的灵敏度高度依赖于所分析的 分子，且当靶生物分子的大小较之探针生物分子基本上相当时，这种灵敏度 更高。