大肠杆菌外膜蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用

摘要

本发明属于兽医生物技术领域，具体涉及大肠杆菌外膜蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用。本发明的抗体是以克隆、表达、纯化的禽致病性大肠杆菌 O 78 （AvianpathogenicEscherichiacoliAPECO 78 ）外膜蛋白为抗原免疫 BALB/c 小鼠，采用杂交瘤技术制备而成。该抗体特异性高、敏感性强，为今后通过免疫学方法快速、特异性的检测大肠杆菌感染奠定了实验基础，同时通过实验还证明了本发明的单克隆抗体对同型大肠杆菌感染具有良好的中和活性和保护效率，可用于大肠杆菌病的防治。

说明书

技术领域

本发明涉及大肠杆菌外膜蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用，属于生物技术领域。

背景技术

禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌引起，为对养禽业危害最为严重的疫病之一，目前，对大肠杆菌病的预防主要采用疫苗和抗菌药物。但大肠杆菌血清亚型众多，各血清型间的交叉免疫效果不佳，给疫苗和药物的预防带来一定困难。

单克隆抗体是指由一个B细胞分化增殖的子代细胞产生的针对单一抗原决定簇的抗体，单抗具有较强的病原体特异性，不影响正常组织和细胞，相对比较安全，在细菌和病毒病的诊断和治疗方面都发挥重要作用，也是研究蛋白质结构与功能的重要工具。大肠杆菌的外膜蛋白位于大肠杆菌菌体的表面，具有良好的免疫原性，可加快巨噬细胞对抗原的提呈作用，激活淋巴细胞的增殖反应，刺激机体产生体液免疫和细胞免疫；而且更为重要的是大肠杆菌的外膜蛋白在不同血清型菌株间具有交叉保护作用，能抵抗同源和异源菌株的攻击。在目前一些大肠杆菌病的防治中都具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种大肠杆菌外膜蛋白单克隆抗体，该抗体是以克隆、表达、纯化的禽致病性大肠杆菌O₇₈(Avian pathogenic Escherichia coli APEC O₇₈)外膜蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，采用杂交瘤技术制备而成。本发明的单克隆抗体对同型大肠杆菌感染具有良好的中和活性和保护效率，可用于大肠杆菌的防治；而且该单克隆抗体特异性高、敏感性强的，为今后通过免疫学方法快速、特异性的检测大肠杆菌感染奠定了实验基础。

本发明的另一目的是提供该大肠杆菌外膜蛋白单克隆抗体的制备方法和应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供一种大肠杆菌外膜蛋白单克隆抗体，其特征在于：以原核表达、纯化的禽致病性大肠杆菌O₇₈(Avian pathogenic Escherichia coli APEC O₇₈)的外膜蛋白作为抗原，加入弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化分别制成弗氏完全佐剂免疫原和弗氏不完全佐剂免疫原，免疫BALB/c小鼠，采用杂交瘤技术制备单抗，所制备抗体免疫球蛋白类型为IgG2a，其轻链为κ链抗体。

其中，弗氏完全佐剂免疫原和弗氏不完全佐剂免疫原中禽致病性大肠杆菌O₇₈的外膜蛋白与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂体积比均为1∶1。

本发明还提供了该大肠杆菌外膜蛋白单克隆抗体的制备方法，其制备步骤如下：

(1)禽致病性大肠杆菌O₇₈外膜蛋白OMPA原核表达及纯化

根据大肠杆菌外膜蛋白基因序列设计特异性引物，PCR扩增禽致病性大肠杆菌O₇₈外膜蛋白OMPA，将OMPA先连接到pMD18T上测序，测序鉴定正确的OMPA分别以BamH I、Xhol进行双酶切后克隆到pET-28a(+)上，转化DH5α感受态细胞，通过卡那霉素抗性筛选得到的阳性质粒pET-28a(+)-OMPA再转化大肠杆菌BL21(DE3)，通过抗性筛选阳性表达菌株，以IPTG诱导目的蛋白表达，并以Ni-NTA His.Bind Resin纯化柱纯化禽致病性大肠杆菌O₇₈外膜蛋白OMPA，最后调整浓度至50μg/mL；

(2)免疫性抗原的制备

纯化后的禽致病性大肠杆菌O₇₈外膜蛋白OMPA分别加入弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化制成弗氏完全佐剂免疫原和弗氏不完全佐剂免疫原；

(3)BALB/c小鼠免疫

8周龄BALB/c小鼠腹腔注射制备的禽致病性大肠杆菌O₇₈外膜蛋白弗氏完全佐剂免疫原0.5mL/只；免疫后7天和14天后分别以弗氏不完全佐剂免疫原以相同的方法和剂量进行加强免疫；

(4)单抗制备

利用PEG法，进行细胞融合，融合7～10天后，对有生长的杂交瘤细胞进行阳性筛选，以全菌包被，应用间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞，获得稳定表达禽致病性大肠杆菌O₇₈外膜蛋白的杂交瘤细胞株，并对此株单抗进行效价测定、亚类鉴定、稳定性测定及特异性与中和活性测定。

其中，禽致病性大肠杆菌O₇₈外膜蛋白的引物序列如下：

上游引物：ATTGGATCCGCTCCGAAAGATAACA

下游引物：TTCTCGAGTTAAGCCTGCGGCTGAGTTA

本发明的大肠杆菌外膜蛋白单克隆抗体可用于检测大肠杆菌。

本发明的大肠杆菌外膜蛋白单克隆抗体还可用于制备防治大肠杆菌病的制剂。

本发明中的禽致病性大肠杆菌O₇₈购自中国兽医药品监察所，其外膜蛋白有一个开放阅读框(ORF)，长1041bp，编码346个氨基酸，前21个为信号肽，成熟的OmpA由325个氨基酸残基组成，相对分子质量为37KD。本发明中扩增到的禽致病性大肠杆菌O₇₈外膜蛋白大小975bp，原核表达的禽致病性大肠杆菌O₇₈外膜蛋白分子量为37KD。其中，禽致病性大肠杆菌O₇₈也可以使用任何一株当前中国国内公开的大肠杆菌菌株，不影响本发明的实施。

本发明首次利用杂交瘤技术制备出特异性高、敏感度强的新型抗大肠杆菌外膜蛋白OMPA单克隆抗体，具有广泛的研究和商业使用价值，可以直接鉴定大肠杆菌的血清型，筛选大肠杆菌制苗菌株，用于禽大肠杆菌致病机理的研究，本发明的抗体同时具有良好的中和活性和保护效率，可用于大肠杆菌病的治疗，而且单抗可以用体内或体外方法无限量生产，易于纯化和标准化。

附图说明

图1扩增的禽致病性大肠杆菌O₇₈外膜蛋白OMPA片段电泳图

图2原核表达质粒pET-28a(+)-OMPA

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1禽致病性大肠杆菌O₇₈外膜蛋白免疫性抗原的制备

(1)外膜蛋白的克隆

根据Genebank中大肠杆菌K12W3110株(登录号AP009048)的OMPA基因序列设计特异性引物，上游引物引入BamH I酶切位点，下游引物引入XholI酶切位点。上游引物为：ATTGGATCCGCTCCGAAAGATAACA，下游引物：TTCTCGAGTTAAGCCTGCGGCTGAGTTA。以禽致病性大肠杆菌O₇₈的基因组为模板PCR扩增外膜蛋白OMPA。将OMPA先连接到pMD18T上测序，测序鉴定正确的OMPA分别以BamH I、Xhol进行双酶切后克隆到pET-28a(+)上，转化DH5α感受态细胞，通过卡那霉素抗性筛选得到的阳性质粒pET-28a(+)-OMPA再转化大肠杆菌BL21(DE3)，通过抗性筛选阳性表达菌株。

(2)禽致病性大肠杆菌O₇₈外膜蛋白原核表达菌株的诱导表达及纯化

将筛选出的禽致病性大肠杆菌O₇₈外膜蛋白原核表达阳性菌液按1∶1000的比例接种加有Kan抗性的LB培养基中，每个菌接种两管，一管用于诱导，另一管用于非诱导对照，同时要接种一管空质粒菌作为对照。37℃过夜培养至OD_600nm值约为0.4～0.5时，诱导管和空质粒对照管加入IPTG至终浓度为1mmol/L，非诱导对照不加，最终挑选表达能力高的两个菌，用于大量的蛋白的表达。并按照常规的SDS-Page方法对表达产物进行鉴定。然后以Ni-NTAHis.Bind Resin纯化柱纯化蛋白，经测定纯化后的蛋白浓度为396mg/L。

(3)免疫性抗原的乳化

将外膜蛋白稀释至50μg/mL，分别加入等体积的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂混合，震荡乳化半小时，分别制成弗氏完全佐剂免疫原和弗氏不完全佐剂免疫原，4℃保存备用。

实施例2禽致病性大肠杆菌O₇₈外膜蛋白单克隆抗体的制备

(1)BALB/c小鼠免疫

8周龄BALB/c小鼠腹腔注射制备的禽致病性大肠杆菌O₇₈外膜蛋白弗氏完全佐剂免疫原0.5mL/只；免疫后7d和14d后分别以弗氏不完全佐剂免疫原同法同剂量进行加强免疫。

(2)杂交瘤细胞融合

最后一次加强免疫后的第三天取免疫小鼠的脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按细胞数量4∶1混合，利用经典的PEG法，进行细胞融合。

(3)杂交瘤细胞的筛选

融合后用HAT作为选择性培养基，同时加入饲养细胞，分装在96孔细胞培养板，置于37℃，5％CO₂培养箱内培养，7～10天进行观察，对有生长的杂交瘤细胞进行阳性筛选，以全菌包被，应用间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞，同时用SP2/0细胞培养上清液作阴性对照。对于初步筛选的阳性菌株采用稀释法进行克隆化和再克隆，反复筛选最终获得了一株稳定表达禽致病性大肠杆菌O₇₈外膜蛋白的杂交瘤细胞株8A4。

(4)单抗腹水的制备

分别将经降植烷处理的BALB/c小鼠，腹腔内注射鉴定后再克隆的杂交瘤细胞，注射量为5×10⁵个细胞，约经过一周，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，离心后取上清以亲核层析法纯化单抗。

(5)单抗腹水效价的测定

以禽致病性大肠杆菌O₇₈全菌包被，采用间接ELISA测定单抗腹水效价为16000。

(6)免疫球蛋白亚型鉴定

采用Southern biotech公司单克隆抗体亚型鉴定试剂盒进行抗体亚型鉴定，最终确定禽致病性大肠杆菌O₇₈外膜蛋白特异性单克隆抗体8A4免疫球蛋白类型为IgG2a，其轻链均为κ链抗体。

(7)单抗稳定性鉴定

将所制备的单抗菌株8A4连续培养3个月或液氮冻存复苏后，仍能稳定分泌McAb。

实施例38A4株单抗特异性试验

以禽致病性大肠杆菌O₇₈、O₁、O₂和沙门氏菌标准毒株分别与筛选到的单克隆抗体8A4株做玻板凝集试验，用接种环沾取少量平板上的选择禽致病性大肠杆菌O₇₈、O₁、O₂和沙门氏菌菌落，于生理盐水中混匀，然后分别滴加到事先的标记好的洁净载玻片上，并同时滴加单克隆抗体8A4株，设置禽致病性大肠杆菌O₇₈、O₁、O₂和沙门氏菌与生理盐水及单抗与生理盐的对照组。结果见表1，结果表明本单克隆抗体具有良好的特异性，只与禽致病性大肠杆菌O₇₈反应呈阳性，与禽致病性大肠杆菌O₁、O₂型均呈阴性，与沙门氏菌也不存在交叉反应。

表1单抗8A4株特异性鉴定

实施例48A4株单抗的中和活性试验

特异性单克隆抗体8A4株腹水与禽致病性大肠杆菌O₇₈种毒混合，颈部皮下注射5-10日龄的雏鸡20只。另取20只雏鸡单独注射禽致病性大肠杆菌O₇₈种毒，结果见表2。结果表明：单独注射禽致病性大肠杆菌O₇₈的鸡发病率100％，而单抗与禽致病性大肠杆菌O₇₈同时注射组的鸡仅有个别死亡，对雏鸡的保护率达80％。说明此单抗对于同型大肠杆菌感染具有良好的中和活性和保护效率。

表2单抗8A4株特异性鉴定

  免疫组  雏鸭数量  发病数  死亡数  保护率(％)  8A4+O₇₈  20  4  2  80  O₇₈  20  20  20  0