用于软组织疾病诊断和作为口腔护理干预的治疗性靶标的蛋白质生物标记

摘要

本文描述了可用于治疗口腔疾病或病况的化合物的鉴定方法。

说明书

背景

牙周病的部分特征是牙周有机基质的异常和过度降解。该基质包 括牙龈、牙周韧带、牙骨质和牙槽骨。这些事件导致牙周炎的临床表 现，包括牙龈退缩、袋形成(pocket formation)、附着丧失和最终牙丢 失。许多不同炎性介导物都由牙周病累及的牙周组织产生。这些介导 物中的某些看来似乎在牙周病病例中所观察到的破坏过程中起到重 要作用，这使得一些研究人员检查使用某些炎性介导物作为进行性损 伤的生物标记的可能性(Sorsa，T.等.Arch.Oral.Biol.35：193S-196S， 1990；Page，R.C.，J.Periodont.Res.26：230-242，1991)。

概述

本发明包括在哺乳动物中诊断牙周病的方法，所述方法包括：获 取所述哺乳动物的牙龈和/或唾液样品，检测所述牙龈样品中生物标记 的存在情况，检测所述样品中所述生物标记的水平，并根据所检测的 生物标记水平来诊断出该生物体患有牙周病。

生物标记是选自以下的至少一个成员：FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、 DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、 LPO和MMP-13。

本发明也包括在哺乳动物中诊断牙周病的方法，所述方法包括： 获取所述哺乳动物的牙龈和/或唾液样品，检测所述样品中生物标记的 存在情况，检测所述样品中所述生物标记的水平，将所述样品中的生 物标记水平与将生物标记水平与牙周病相关联的预定参考值进行比 较，并且当所述样品中的生物标记水平符合其中所述参考值将生物标 记水平与牙周病相关联的生物标记水平时，诊断出所述哺乳动物患有 牙周病。

本发明也包括在哺乳动物中诊断牙周病的方法，所述方法包括： 获取所述哺乳动物的牙龈和/或唾液样品，检测所述样品中生物标记的 存在情况，检测所述样品中所述生物标记的水平，将所述样品中的生 物标记水平与对照样品中同一生物标记的水平进行比较，其中当相对 于所述对照样品而言，在所述样品中检测到所述生物标记的水平改变 时，就诊断出所述哺乳动物患有牙周病。

一方面，样品中的生物标记水平高于对照样品中的水平。

本发明包括用于在哺乳动物中检测牙周病的生物标记组，其包含 选自FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、 BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO和MMP-13的两种以上生物 标记，其中所述生物标记得自经诊断患有牙周病的哺乳动物的牙龈和 /或唾液样品。

本发明还包括在哺乳动物中监测牙周病的方法，所述方法包括： 在第一时间点获取所述哺乳动物的第一牙龈和/或唾液样品，在第二时 间点获取所述哺乳动物的第二牙龈和/或唾液样品，在第一和第二样品 中检测至少一种生物标记的存在情况，在第一和第二样品中检测至少 一种生物标记的水平，并比较第一和第二样品中的生物标记水平，其 中与第一样品相比，第二样品中生物标记水平下降表明在所述哺乳动 物中牙周病减少。

本发明包括在哺乳动物中治疗牙周病的方法，所述方法包括：使 细胞与减量调节选自以下的至少一种生物标记的物质接触：FAS、 IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、 BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO和MMP-13，其中所述生物标记的 减量调节与牙周病相关的至少一种症状的减少相关。

本发明也包括可用于在哺乳动物中治疗牙周病的化合物的鉴定 方法，所述方法包括：使细胞与试验化合物接触并检测所述试验化合 物是否减量调节选自以下的至少一种生物标记：FAS、IL-1B、IL-8、 MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、 IL-6、LCN8、LPO和MMP-13，其中生物标记的减量调节表明所述试 验化合物可用于治疗牙周病。

本发明还包括在哺乳动物中诊断龈炎的方法，所述方法包括：获 取所述哺乳动物的牙龈和/或唾液样品，检测所述样品中生物标记的存 在情况，检测所述样品中所述生物标记的水平，根据所检测的生物标 记水平而诊断出所述生物体患有龈炎。

本发明也包括在哺乳动物中诊断龈炎的方法，所述方法包括：获 取所述哺乳动物的牙龈和/或唾液样品，检测所述样品中生物标记的存 在情况，检测所述样品中所述生物标记的水平，将所述样品中的生物 标记水平与将生物标记水平与龈炎相关联的预定参考值进行比较，并 且当所述样品中的生物标记水平符合其中所述参考值将生物标记水 平与龈炎相关联的生物标记水平时，诊断出所述哺乳动物患有龈炎。

本发明也包括在哺乳动物中诊断龈炎的方法，所述方法包括：获 取所述哺乳动物的牙龈和/或唾液样品，检测所述样品中生物标记的存 在情况，检测所述样品中所述生物标记的水平，并将所述样品中的生 物标记水平与对照样品中同一生物标记的水平进行比较，其中当相对 于所述对照样品而言，在所述牙龈和/或唾液样品中检测到所述生物标 记水平上升时，诊断出所述哺乳动物患有龈炎。

本发明包括在哺乳动物中监测龈炎的方法，所述方法包括：在第 一时间点获取所述哺乳动物的第一牙龈和/或唾液样品，在第二时间点 获取所述哺乳动物的第二牙龈和/或唾液样品，在第一和第二样品中检 测至少一种生物标记的存在情况，在第一和第二样品中检测所述至少 一种生物标记的水平，并比较第一和第二样品中的生物标记水平，其 中与第一样品相比，第二样品中生物标记水平下降表明在所述哺乳动 物中的龈炎减少。

本发明也包括在哺乳动物中治疗龈炎的方法，所述方法包括：使 细胞与减量调节选自以下的至少一种生物标记的物质接触：FAS、 IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、 BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO和MMP-13，其中所述至少一种生 物标记的减量调节与龈炎相关的至少一种症状的减少相关。一方面， 所述生物标记水平恢复到视为正常的水平。另一方面，所述生物标记 水平恢复到基线水平。

本发明还包括可用于在哺乳动物中治疗龈炎的化合物的鉴定方 法，所述方法包括：使细胞与试验化合物接触并检测所述试验化合物 是否减量调节选自以下的至少一种生物标记：FAS、IL-1B、IL-8、 MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、 IL-6、LCN8、LPO和MMP-13，其中所述至少一种生物标记的减量调 节表明所述试验化合物可用于治疗龈炎。

附图简述

图1表明2，4，4’-三氯-2’-羟基二苯醚对单核细胞的TNFα诱导性 MMP-9生成的影响。

发明详述

本领域所需要的是生物标记水平的诊断性和/或预后测试，所述生 物标记包括在牙周病状态中升高的生物标记。这样的生物标记包括 FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、 BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO和MMP-13。本领域还需要 的是牙周病的诊断性和/或预后测试，其评价牙龈样品例如龈沟液 (gingival crevicular fluid，GCF)或唾液样品中的炎性介导物水平。此外， 也需要在有需要的患者中治疗牙周病，包括抑制FAS、IL-1B、IL-8、 MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、 IL-6、LCN8、LPO和MMP-13中的一种或多种水平上升。

例如，基质金属蛋白酶13(MMP-13；也称为CLG3)在牙周炎和 牙周病中是主要的破坏性胶原酶。MMP-13可在患病的牙周组织和龈 沟液、以及唾液中发现。该酶水平与牙周炎临床指标呈正相关。也就 是说，升高或“高于正常”水平的MMP-13指示牙周病。测定可由 MMP-13酶、RNA或生物活性构成。对MMP-13的活性和/或存在的 抑制可用于治疗牙周病。

使用相应的酶、蛋白质、RNA或生物活性，也可检测如本文给 出的以下牙周病生物标记和/或测定其水平。升高或“高于正常”水平 的以下生物标记单独或与一种或多种其它生物标记彼此联合，也指示 牙周病。对于MMP-13，对MMP-13的活性和/或存在的抑制可用于治 疗牙周病。

FAS(也称为ALPS1A和APO-1)参与细胞凋亡，并在结合配体时 形成“DISC”，一种诱导死亡的信号转导复合物。

白介素1-β(IL-1B)是一种炎性细胞因子，参与对抗感染的哺乳动 物免疫应答。

白介素8(IL-8；也称为3-10C和AMCF-1)是C-X-C趋化因子家 族的一个成员，并参与目标嗜中性粒细胞趋化性的诱导，作为先天免 疫应答的组成部分。

基质金属蛋白酶9(MMP-9；也称为GELB和CLG4B)是一种明 胶酶，其也是牙周病中的一种主要的破坏性基质金属蛋白酶。

防卫素β4(DEFB4；也称为B2和DEFB-2)是一种防卫素。DEFB4 是受炎症局部调节的一种抗菌肽。

组织蛋白酶S(CTSS；也称为MGC3886)，C1肽酶家族的一个成 员，是在将抗原蛋白/肽呈递给MHC II类分子中起作用的一种半胱氨 酸蛋白酶。

白介素17B(IL-17B；也称为IL-20)是一种IL-17相关的细胞因子。 IL-17B刺激IL-1B和TNF-α从单核细胞中释放出来。

胱天蛋白酶(Casspase)募集域家族成员10(CARD10；也称为 BIMP1和CARMA3)参与细胞凋亡信号转导。CARD10也激活NF-κ-B 并且属于膜缔合的鸟苷酸激酶家族。

双糖链蛋白聚糖(BGN；也称为DSPG1和PG-S1)是含有两条连接 的糖胺聚糖链的一种基质蛋白聚糖，并且涉及饰胶蛋白聚糖。据信它 与胶原原纤维结合并转移生长因子β。

B-因子，备解素(BF；也称为CFAB和GBG)是补体激活旁路途 径的一种组分。活性亚基是参与预活化B淋巴细胞增殖的一种丝氨酸 蛋白酶。

白介素12A(IL-12A；也称为CLMF)是对T细胞和自然杀伤细胞 起作用的一种细胞因子，并且参与Th1细胞和Th2细胞的分化，以及 干扰素γ的T细胞非依赖性诱导。

白介素6(IL-6；也称为BSF2和HGF)是激活细胞表面信号传导 复合物的一种免疫调节性细胞因子。它的作用是作为促炎细胞因子和 抗炎细胞因子两者，并刺激针对创伤的免疫应答，包括响应外源病原 体。

脂质运载蛋白8(LCN8)属于参与由哺乳动物免疫系统激活而导 致的炎症和解毒过程的蛋白质家族。

乳过氧化物酶(LPO；也称为SPO)是参与针对感染的宿主防御的 一种抗氧化酶。

如全文所用，范围用作描述该范围内的每个数值和所有数值的简 写形式。范围内的任何数值都可选做该范围的终点。另外，本文所引 用的所有参考资料都通过引用以其整体结合到本文中。当本公开内容 中的定义和所引用参考资料有矛盾时，以本公开内容为准。

本文所用的术语“牙周病”包括牙周炎、龈炎和牙龈疾病。

本文所用“龈炎”意指牙龈组织的炎症，是其中炎症位于牙龈内 且骨和牙周韧带内无损伤的一种病症。

本文所用的术语“牙周炎”是指牙周有机基质的异常和过度降解， 该基质包括牙龈、牙周韧带、牙骨质和牙槽骨。牙周炎的临床表现包 括但不限于牙龈退缩、袋形成、基质附着丧失、牙和骨丢失。牙周炎 可表征为早期牙周炎、中期牙周炎或晚期牙周炎。然而，正如技术人 员所理解的，牙周炎不应仅限于本文所给出的那些症状和后遗症。除 了其它症状，早期牙周炎的临床表现是以下的一种或多种：探诊时出 血；存在袋(3至4mm)；局限性退缩区域；附着丧失(3至4mm)；骨 丢失(例如水平的)；和I级分叉侵袭面积。除了其它症状，中期牙周 炎的临床表现是以下的一种或多种：存在袋(4至6mm)；存在附着丧 失(4至6mm)；探诊时出血；I级和/或II级分叉侵袭面积；I级牙齿 松动；骨丢失(例如水平和/或垂直的)；和1/3支持性牙槽骨丢失(即冠 根比为1∶1)。晚期牙周炎的临床表现是以下的一种或多种：探诊时出 血；存在袋(超过6mm)；附着丧失(超过6mm)；II级和/或III级分叉 侵袭面积；II级和/或III级牙齿松动；骨丢失(例如水平和/或垂直的)； 和超过1/3支持性牙槽骨丢失(即冠根比为2∶1以上)。牙周炎细分为包 括但不限于：成人牙周炎(例如斑块相关的)；早发性牙周炎(例如青春 期前牙周炎、青少年牙周炎、快速进展性牙周炎等)；全身性疾病相关 性牙周炎；坏死性溃疡性牙周炎；难治性牙周炎；种植体牙周炎 (peri-implantitis)等。

本文所用的术语“治疗”是指在哺乳动物接触本发明口腔组合物 和/或依据本发明方法时，不良病况的可检测性改善和/或病况症状的 减轻。

术语“对牙周炎的治疗”应理解为包括对哺乳动物牙周炎的预防， 以及抑制哺乳动物中牙周炎相关的一种或多种已有病况的进展。本文 所用的术语“抑制”是指与无治疗病况相比，部分抑制或完全抑制牙 周炎，从而达到治疗性治疗和/或预防结果。因此，依照本发明对牙周 炎的治疗包括降低、抑制、改善、减轻、缩减、停止或消除本文所给 出的一种或多种症状和/或后遗症。

本文所用的“病理性过度”是指活性超过所接受的正常水平。例 如，基质金属蛋白酶活性的“病理性过度”是超过非疾病状态中正常 存在的水平的基质金属蛋白酶活性水平。本文所用的“基质金属蛋白 酶活性的病理性过度”是牙周炎相关的基质金属蛋白酶活性水平。

本文所用的术语“基线”是指在不良事件之前存在于受试者内的 某物质(例如生物标记)的水平或在治疗性治疗之后存在的水平。生物 标记的“基线”水平可以是例如据认为反映了“正常”或“健康”受 试者的生物标记水平。或者，生物标记的“基线”水平可反映出牙周 病发作之前存在的生物标记水平，其中在牙周病发作之前，生物标记 水平已经升高到超过“正常”或“健康”水平，由于可能与牙周病无 关的病况。在第二个实例中，治疗受试者使生物标记水平恢复到“基 线”水平，可反映出“对牙周病的治疗”，尽管有这样的事实：该实 例中的基线水平升高到超过所接受的“健康”水平。

本文所用的术语“减量调节”是指酶活性降低、酶活性水平降低、 蛋白质水平和/或编码所述蛋白质的核酸的水平的降低、或蛋白质(例 如MMP-8、MMP-9和MMP-13中的一种或多种)的存在的生化效应降 低。

本文所用的术语“牙龈样品”是指从牙龈上或附近所获取的组织、 细胞、液体。

本文所用的“龈沟液”和“GCF”是指由游离龈的毛细血管渗漏 产生的在龈沟中汇集的血浆渗出液。

本文所用的术语“诊断”是指确定或检测特定疾病、病症、医学 病况或危险的存在情况。

本文所用的术语“前龈炎状态”是指并非完全陷于龈炎的状态， 但是除“正常”之外的趋向于龈炎的任何状态，而且是如放任不管则 将会发展成龈炎的状态。

本文所用的术语“检测试剂”是指生物实体或化学实体。“检测 剂”可以是添加到组合物中的额外试剂，或者它可以是用作检测剂的 组合物的起始组分(例如可视FRET抗体技术)。

本发明的某些实施方案提供可用于治疗口腔疾病或病况的化合 物的鉴定方法，所述方法包括： 获取患有口腔疾病或病况的哺乳动物的第一牙龈样品；获取所述哺乳 动物口腔的第二牙龈样品；使所述第一样品与试验化合物接触；使所 述第二样品与阳性对照接触，其中所述阳性对照是已知减量调节一种 或多种生物标记表达的化合物；检测所述试验化合物减量调节一种或 多种所述生物标记表达的程度；检测所述阳性对照减量调节一种或多 种所述生物标记表达的程度；和将所述试验化合物减量调节一种或多 种所述生物标记表达的程度，与所述阳性对照减量调节一种或多种所 述生物标记表达的程度进行比较；其中减量调节一种或多种所述生物 标记表达的程度等于或大于所述阳性对照的试验化合物，是可用于治 疗口腔疾病或病况的化合物。

在某些实施方案中，所述一种或多种生物标记选自：FAS、IL-1B、 IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、 IL-6、LCN8、LPO和MMP-13。在又一些实施方案中，所述阳性对照 减量调节以下生物标记的表达：FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、 CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO 和MMP-13。

在某些实施方案中，所述口腔疾病或病况是龈炎或牙周炎。

在某些实施方案中，所述阳性对照是卤化二苯醚。在其它实施方 案中，所述阳性对照是三氯生。

再一些实施方案提供这样的方法：其中所述试验化合物减量调节 一种或多种所述生物标记表达的程度大于所述阳性对照。在某些实施 方案中，所述试验化合物减量调节FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、 CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO 和MMP-13表达的程度大于所述阳性对照。在又一些实施方案中，所 述阳性对照减量调节MMP-9的表达。在再一些实施方案中，所述阳 性对照减量调节MMP-13的表达。

一方面，本发明的特征在于在哺乳动物中诊断牙周病的方法，所 述方法包括：获取所述哺乳动物的牙龈样品，检测所述牙龈样品中生 物标记的存在情况，检测所述牙龈样品中所述生物标记的水平，根据 所检测生物标记水平来诊断该生物体患有牙周病。所述生物标记是选 自以下的至少一个成员：FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、 IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO和MMP-13。 在一个实施方案中，哺乳动物是人。

可通过本领域目前已知的或尚待发现的任何方法来获取牙龈样 品。也就是说，本发明并不限于获取牙龈样品的方法。作为非限制性 实例，可通过从口腔获取口腔组织样品而获取牙龈样品。通过常规牙 科步骤就可获取牙龈样品，包括牙龈活检物。口腔组织包括但不限于 从口腔中获取的成纤维细胞和上皮细胞，以及得自牙周组织 (periodontum)和牙龈的组织样品和/或细胞样品。

技术人员将会理解在牙龈样品中如何鉴定生物标记，包括与牙龈 样品相关的和/或由牙龈样品所分泌的生物标记。检测生物标记存在情 况的一种例示性方法包括获取试验受试者口腔的牙龈样品，并将所述 样品与以下化合物或物质接触使得在生物样品中检测出生物标记核 酸或由该核酸所编码的生物标记肽的存在情况，所述化合物或物质能 够检测本文所述的一种或多种生物标记(例如MMP-9或MMP-13)，例 如生物标记核酸(例如mRNA、基因组DNA等)或由生物标记核酸所 编码的生物标记肽(例如肽片段或蛋白质等)。在一个实施方案中，用 于检测生物标记mRNA或生物标记基因组DNA的物质是能够与生物 标记mRNA或基因组DNA杂交的标记的核酸探针。核酸探针可以是 例如全长生物标记核酸或其部分。本文描述了用于本发明诊断测定的 其它合适的探针。

在另一个实施方案中，用于检测生物标记肽的物质是能够与生物 标记肽结合的抗体，例如带有可检测标记的抗体。抗体可以是多克隆 或单克隆的。可使用完整抗体或其片段(例如Fab或F(ab′)₂)。对于探 针或抗体，术语“标记的”意在包括通过将可检测物与探针或抗体偶 联(即物理连接)而直接标记该探针或抗体，以及通过与直接标记的另 一试剂的反应而间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光 标记的第二抗体和用生物素末端标记的DNA探针来检测第一抗体， 使其可用荧光标记的链霉抗生物素来检测。

本文所用的术语“牙龈样品”(以及术语“生物样品”)旨在包括 分离自受试者口腔的组织、细胞和生物液体，以及受试者口腔内存在 的组织、细胞和液体。唾液样品可含有或不含与牙龈相同的某些或全 部成分。也就是说，本发明的检测方法可用于在体外生物样品中以及 体内检测生物标记mRNA、肽(例如蛋白质)或基因组DNA。作为非限 制性实例，用于检测生物标记mRNA的体外技术包括RNA杂交和原 位杂交。用于检测生物标记肽的体外技术包括酶联免疫吸附测定 (ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀和免疫荧光。用于检测生物标记基 因组DNA的体外技术包括DNA杂交。用于检测生物标记肽的体内技 术包括将标记的抗生物标记抗体引入受试者口腔。例如，抗体可用放 射性生物标记来标记，所述生物标记的存在情况和在受试者体内的位 置可通过标准成像技术来检测。

使用本领域现已知的或尚待发现的任何方法可定量测定生物标 记水平。也就是说，本发明并不限于定量测定生物标记的方法。定量 测定生物标记的方法可包括本文在别处给出的用于检测生物标记的 那些方法，或所述方法的合适的改良方法，正如技术人员将会理解的 那样。在一个实施方案中，基于ELISA的测定用于定量测定生物标记 (例如使用PGE₂来定量测定IL-1B)。在另一个实施方案中，基于流式 细胞术的方法用于定量测定生物标记(例如LUMINEX技术，包括基于 流式细胞术和激光的检测)。

一方面，当选自FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、 IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO和MMP-13 的生物标记升高到超过本领域认为“正常”的水平时，就诊断哺乳动 物患有牙周病。理解的是，任何给定生物标记的“正常”水平可以是 奇异值，或实际上可以是生物标记的浓度范围。生物标记的“正常” 水平就是健康状态相关水平，或者是没有或基本没有牙周病的健康状 态相关水平。这样的数值和范围可以是本领域已知的，或者可由技术 人员使用本领域已知方法而确定，包括但不限于对得自已知无牙周病 或牙周病症状的哺乳动物受试者群体的牙龈样品进行生物标记检测 测定。在另一个实施方案中，对特定哺乳动物受试者而言，在所述哺 乳动物受试者已知无牙周病或牙周病症状的时候，可测定该特定哺乳 动物受试者生物标记的“正常”水平/范围。

生物标记的“正常”水平、数值或范围可用作哺乳动物没有或基 本没有牙周病的预定参考值。另一方面，超过生物标记正常值或范围 的数值可用作哺乳动物患有牙周病的预定参考值。

在一个实施方案中，在哺乳动物中诊断牙周病的方法包括获取所 述哺乳动物的牙龈和/或唾液样品，检测所述样品中生物标记的存在情 况，检测所述样品中所述生物标记的水平，并将所述样品中的生物标 记水平与将生物标记水平与牙周病相关联的预定参考值进行比较；并 且当所述样品中的所述生物标记水平符合其中所述参考值将生物标 记水平与牙周病相关联的生物标记水平时，诊断出所述哺乳动物患有 牙周病，其中所述生物标记是选自以下的至少一个成员：FAS、IL-1B、 IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、 IL-6、LCN8、LPO和MMP-13。在一个实施方案中，所述牙周病是牙 周炎。在另一个实施方案中，所述牙周病是龈炎。

在另一个实施方案中，在哺乳动物中诊断牙周病的方法包括获取 所述哺乳动物的牙龈和/或唾液样品，检测所述样品中生物标记的存在 情况，检测所述样品中所述生物标记的水平，将所述牙龈和/或唾液样 品中的生物标记水平与对照样品中同一生物标记的水平进行比较，其 中当相对于所述对照样品而言，在所述牙龈和/或唾液样品中检测到所 述生物标记的水平改变时，诊断出所述哺乳动物患有牙周病，其中所 述生物标记是选自以下的至少一个成员：FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、 DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、 LPO和MMP-13。一方面，牙龈和/或唾液样品中的生物标记水平高于 对照样品中的水平。在一个实施方案中，所述牙周病是牙周炎。在另 一个实施方案中，所述牙周病是龈炎。

本发明也提供用于在哺乳动物中检测牙周病的生物标记组，其包 含选自FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、 BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO和MMP-13的两种以上生物 标记，其中所述生物标记得自经诊断患有牙周病的哺乳动物的牙龈和 /或唾液样品。在一个实施方案中，所述牙周病是牙周炎。在另一个实 施方案中，所述牙周病是龈炎。

本发明也包括在哺乳动物中监测牙周病的方法，所述方法包括： 在第一时间点获取所述哺乳动物的第一牙龈和/或唾液样品，在第二时 间点获取所述哺乳动物的第二牙龈和/或唾液样品，在第一和第二样品 中检测至少一种生物标记的存在情况，在第一和第二样品中检测所述 至少一种生物标记的水平，并比较第一和第二样品中的生物标记水 平，其中与第一样品相比，第二样品中的生物标记水平下降表明在所 述哺乳动物中牙周病减少，并且其中所述至少一种生物标记选自FAS、 IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、 BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO和MMP-13。在一个实施方案中， 所述牙周病是牙周炎。在另一个实施方案中，所述牙周病是龈炎。

一方面，本发明的特征在于在哺乳动物中治疗牙周病的方法，其 中所述哺乳动物具有升高水平的选自以下的至少一种生物标记：FAS、 IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、 BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO和MMP-13。正如本文在别处所述， 可使用本文所公开的或本领域已知的任何方法来检测一种或多种所 述生物标记超出正常的水平，并在恰当时使其与牙周病相关联。因此， 本发明的特征在于在患有牙周病的哺乳动物中治疗牙周病的方法，所 述方法包括：使细胞与减量调节选自以下的至少一种生物标记的物质 接触：FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、 BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO和MMP-13，其中所述生物 标记的减量调节与牙周病相关的至少一种症状的减轻相关。

在一个实施方案中，生物标记减量调节物质包含在口腔组合物 中，并将所述口腔组合物给予哺乳动物以治疗牙周病。

在通过将口腔组合物给予至哺乳动物口腔而治疗牙周炎的方法 中，可如本文别处所述地降低一种或多种生物标记的活性。可如本文 别处所述地降低一种或多种生物标记，例如，如针对降低哺乳动物口 腔中MMP-9的量对降低哺乳动物口腔中MMP-9的量所提出的。也就 是说，可在核酸和蛋白质水平之一或两方面上降低MMP，从而降低 口腔中MMP-9的活性。类似地，正如本文别处详细描述的，可通过 对核酸和蛋白质水平任一种或两者的作用来实现MMP-9的减量调节 或MMP-9水平下降。

另一方面，本发明提供可用于在有需要的哺乳动物中治疗牙周病 的化合物的鉴定方法，所述方法包括：使细胞与试验化合物接触并测 定所述试验化合物是否减量调节一种或多种以下生物标记：FAS、 IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、 BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO和MMP-13。至少一种生物标记的 减量调节表明该试验化合物可用于在患有牙周病的哺乳动物中治疗 牙周病，其中所述生物标记水平增加与牙周病相关和/或是牙周病的症 态。在一个实施方案中，所述牙周病是牙周炎。在另一个实施方案中， 所述牙周病是龈炎。

在一个实施方案中，治疗牙周病的方法包括给予经本文所述的筛 选测定鉴定的物质，或者抑制牙周病的一种或多种生物标记的物质的 组合，其中至少一种所述物质是经本文所述的筛选测定鉴定的物质。

在一个实施方案中，本发明提供治疗牙周病的方法，所述方法包 括将治疗有效量的抑制牙周病的物质给予需要所述治疗的受试者的 步骤。如本文所定义，物质的治疗有效量(即有效剂量)范围为0.001 至30mg/kg体重，优选0.01至25mg/kg体重，更优选0.1至20mg/kg 体重，和甚至更优选1至10mg/kg、2至9mg/kg、3至8mg/kg、4 至7mg/kg、或5至6mg/kg体重。技术人员理解的是，某些因素可能 影响有效治疗受试者所需的剂量，所述因素包括但不限于疾病或病症 的严重程度、前期的治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄以及所患 有的其它疾病。此外，用治疗有效量的抑制剂对受试者进行治疗可包 括单次治疗，或者优选可包括一系列治疗。也理解的是，用于治疗的 有效剂量可随具体治疗过程而增加或降低。可因本文所述的诊断性测 定结果而导致剂量的改变。作为实例，可将物质单独给予，作为药物 组合物的组成部分而给予，或作为口腔组合物等其它组合物的组成部 分来给予。

作为非限制性实例，可通过使细胞与TNFα接触而在体外确定 MMP-9水平。在一个实施方案中，细胞是单核细胞。在细胞与TNFα 接触之后，在蛋白质水平或者核酸水平上测定MMP-9水平。一方面， 也在抗菌剂存在的情况下，通过使细胞与TNFα接触而在体外确定 MMP-9水平。在一个实施方案中，所述抗菌剂是2，4，4’-三氯-2’-羟基 二苯醚。在本发明的一方面，2，4，4’-三氯-2’-羟基二苯醚是可用于减量 调节本文所提出的生物标记的物质。可用于测定生物标记水平的测定 包括可用于结合和/或功能活性测定等的任何测定。这类测定的实例包 括但不限于基于LUMINEX的测定、抗体-抗原测定、肽裂解测定、比 色测定。

在本发明的一个实施方案中，如下在体外确定经由检测MMP-9 水平对MMP-9的减量调节的测定：通过在抗菌剂存在的情况下，使 细胞与TNFα接触，并与通过在抗菌剂(例如2，4，4’-三氯-2’-羟基二苯 醚)不存在的情况下，细胞与TNFα接触而在体外确定的MMP-9水平 进行比较，其中实验条件在其它方面都是相同的。与抗菌剂不存在时 相比，在抗菌剂存在时，MMP-9蛋白质、核酸或酶活性水平较低，表 明该抗细菌化合物减量调节MMP-9。理解的是，可以类似方式测定本 发明的其它生物标记。另外，可使用可用于该目的的任何物质来测定 MMP-9或任何其它生物标记的减量调节，所述物质包括但不限于本文 在别处提出的经鉴定可用于治疗牙周炎的物质。

理解的是，可将生物标记减量调节的体外测定与体内效应、观察 或结果关联起来。作为非限制性实例，理解的是，可将MMP-9减量 调节的体外测定与体内效应、观察或结果关联起来。一方面，体外所 测的MMP-9减量调节证实了体内观察，包括但不限于对牙周病的治 疗，在体内降低生物标记和/或生物标记活性的病理性过度的方法，以 及可用于治疗牙周病和/或在体内降低生物标记和/或生物标记活性的 病理性过度的化合物的鉴定方法。参见例如Modeer等(1996)J.Clin. Periodont.，23：927-933。另一方面，体外所测的生物标记减量调节预测 了体内结果，包括但不限于对牙周病的治疗，在体内降低生物标记和 /或生物标记活性的病理性过度的方法，以及可用于治疗牙周病和/或 在体内降低生物标记和/或生物标记活性的病理性过度的化合物的鉴 定方法。

一方面，本发明提供在有需要的哺乳动物口腔中降低至少一种生 物标记的病理性过度的方法，所述方法包括以这样的量将包含减量调 节选自以下的至少一种生物标记的物质的口腔组合物给予所述哺乳 动物口腔：FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、 CARD10、BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO和MMP-13，所 述量有效降低所述哺乳动物口腔中的所述生物标记水平，其中对所述 生物标记水平的抑制导致对牙周病的治疗。在一个实施方案中，本发 明提供在有需要的哺乳动物口腔中减少至少一种生物标记例如 MMP-9或MMP-13的病理性过度的方法，所述方法包括以以下量将 包含2，4，4’-三氯-2’-羟基二苯醚的口腔组合物给予所述哺乳动物口腔， 所述量有效降低所述哺乳动物口腔中的MMP-9或MMP-13水平，其 中对MMP-9或MMP-13水平的抑制导致对结缔组织基质蛋白组分过 度降解的抑制。

可按照本文所提出的多种方式之一来降低口腔中的生物标记。在 一个实施方案中，正如本文在别处提出的，可通过在核酸水平减量调 节生物标记而降低口腔中的所述生物标记。这样的降低可导致一种或 多种编码生物标记的核酸(例如mRNA)及表达到口腔中的生物标记蛋 白/酶的减少。正如技术人员所理解的，当备有本文所给出的公开内容 时，可通过众多技术中的一种或多种实现例如减少编码生物标记的 mRNA。实例包括降低编码生物标记的mRNA的转录和降解/消除编 码生物标记的mRNA。

在另一个实施方案中，可通过直接降低生物标记蛋白的量而降低 口腔中的生物标记。正如技术人员所理解的，当备有本文所给出的公 开内容时，可通过众多技术中的一种或多种可实现减少生物标记蛋 白。实例包括通过小分子抑制剂的生物标记的结合/配合，通过天然或 生物来源分子的抑制，生物标记的蛋白水解降解以及基于亲和力的生 物标记从口腔中的清除等。减少生物标记的物质可以是本文所述的物 质，例如2，4，4’-三氯-2’-羟基二苯醚(三氯生)，或它可以是另一种抗菌 剂。因此，本发明提供治疗患有牙周病个体的方法。

另一方面，本发明提供在有需要的哺乳动物中治疗牙周病的方 法，所述方法包括使哺乳动物口腔中的细胞与减量调节本文所给出的 生物标记的物质接触。依照本发明，生物标记的减量调节与牙周病相 关的至少一种症状的减少相关。

一方面，通过将2，4，4’-三氯-2’-羟基二苯醚对生物标记减量调节 的效果与本文所给出的口腔组合物对生物标记减量调节的效果进行 比较，确定该口腔组合物治疗牙周病的能力。另一方面，通过在体外 或体内将任何口腔组合物的效果与本文所给出的口腔组合物的效果 进行比较，确定该口腔组合物治疗牙周炎的能力。

一方面，体外所测的生物标记(例如金属蛋白酶)减量调节证实了 体内观察，包括但不限于对牙周炎的治疗，在体内降低生物标记(例如 金属蛋白酶和/或金属蛋白酶活性)的病理性过度的方法，以及可用于 治疗牙周炎和/或在体内降低生物标记或生物标记活性的病理性过度 的化合物的鉴定方法。参见例如Golub等，Inflamm.Res.(1997) 46：310-9，Preshaw等，J.Clin.Periodontol.(2004)31：697-707；Mantyla 等，J.Periodontal.Res.(2003)38：436-439；Lorencini等，Histol. Histopathol.(2009)24：157-166；和Pozo等，J.Periodontal Res.(2005) 40：199-207。

本发明还包括用于本发明方法的口腔组合物，例如洁齿剂。一方 面，口腔组合物包含可用于治疗牙周病的物质。在一个示例性的实施 方案中，所述物质为非阳离子型抗菌剂。参见例如美国专利号 5,288,480，其通过引用以其整体结合到本文中。非阳离子型抗菌剂在 口腔组合物中存在的有效防牙斑量为0.25-0.35％重量，优选0.3％。抗 菌剂基本上是水不溶性的，意味着其在25℃时在水中的溶解度小于 1％重量并且甚至可能小于0.1％。在一个实施方案中，所述抗菌剂是 2，4，4’-三氯-2’-羟基二苯醚。在一个实施方案中，所述抗菌剂是强力霉 素。在另一个实施方案中，所述口腔组合物包含两种或更多种抗菌剂。 在另一个实施方案中，所述口腔组合物包含并非抗菌剂的物质，并且 可包含或不含作为抗菌剂的一种或多种额外物质。

在一个实施方案中，抗细菌增强剂(AEA)增强了抗菌剂向口腔表 面的递送和滞留。一方面，AEA包含粘合材料。参见美国专利号 5,288,480关于对可用于本发明AEA材料材料和组合物的描述以及关 于可用于本发明的口腔组合物例如洁齿剂组合物的一般性描述。作为 非限制性实例，组合物中的粘合材料是数均分子量介于100,000与 2,500,000之间(包括端值)的聚合物。一方面，粘合材料选自以下聚合 物：聚乙烯膦酸、聚(1-膦酰丙烯)磺酸、聚(β苯乙烯膦酸)、α苯乙烯膦 酸、合成阴离子型聚合聚羧酸盐、马来酸酐、马来酸和甲基乙烯醚。 另一方面，粘合分子是甲基乙烯醚和马来酸酐的聚合物。

本文所用的“递送增强基团”是指这样的基团：其将AEA (携带 抗菌剂)附着于或者实质上粘附地、胶着地或以其它方式结合到口腔 (例如牙齿和牙龈)表面，由此将抗菌剂“递送”到这样的表面。在另 一个实施方案中，“递送增强基团”是指这样的基团：其任选将并非 抗菌剂的物质附着或者实质上、粘附地、胶着地或以其它方式结合到 口腔表面，由此将抗菌剂“递送”到这样的表面。在又一个实施方案 中，“递送增强基团”将至少一种抗菌剂和至少一种非抗菌剂递送到 牙齿。有机滞留增强基团(通常是疏水性的)将物质和/或抗菌剂附着或 以其它方式结合到AEA上，从而促进抗菌剂滞留在AEA和间接滞留 在口腔表面。在某些情况下，抗菌剂的附着通过其被AEA物理捕获 而发生，尤其是当AEA是交联聚合物时，其结构固有地提供了用于 这类捕获的更多位点。在交联聚合物中的更高分子量、更高疏水性交 联部分的存在也进一步促进将抗菌剂物理捕获到交联AEA聚合物上 或促进交联AEA聚合物对抗菌剂的物理捕获。

在示例性的洁齿剂中，含有口腔可接受的溶媒，包括具有保湿剂 的水相。水的含量一般为至少3％重量，通常为3-35％，而保湿剂(优 选甘油和/或山梨醇)一般总量占洁齿剂重量的6.5-75％或80％，更一般 为10-75％。尽管并非本发明所必需，其中0-25-0.35％水不溶性非阳离 子型抗菌剂任选存在，可将有助于抗菌剂在唾液中溶解的额外成分掺 入水湿润性溶媒中。这样的任选增溶剂包括湿润性多元醇，例如丙二 醇、二丙二醇和己二醇；溶纤剂，例如甲基溶纤剂和乙基溶纤剂；在 直链中含有至少12个碳的植物油和蜡，例如橄榄油、蓖麻油和凡士 林；以及酯类，例如乙酸戊酯、乙酸乙酯和苯甲酸苄酯。本文所用的 “丙二醇”包括1，2-丙二醇和1，3-丙二醇。应避免大量聚乙二醇，尤 其是分子量在600以上的聚乙二醇，因为聚乙二醇有效抑制非阳离子 型抗菌剂的抗菌活性。例如，当聚乙二醇(PEG)600与三氯生的重量 比为25份三氯生∶1份PEG 600时，聚乙二醇(PEG)600降低三氯生的 抗菌活性至主要不含聚乙二醇的三氯生抗菌活性的1/10-20。

口腔组合物的pH范围通常为4.5-10，而另一方面，6.5-7.5。值 得注意的是，本发明组合物可在pH小于5时口腔施用，而基本不会 使牙釉质脱钙或以其它方式遭到破坏。pH可用酸(例如柠檬酸或苯甲 酸)或碱(例如氢氧化钠)来控制或者缓冲(例如用柠檬酸钠、苯甲酸钠、 碳酸钠或碳酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等)。

任何摩擦微粒都可使用并可选自碳酸氢钠、磷酸钙(例如磷酸钙 二水合物)、硫酸钙、沉淀的碳酸钙、二氧化硅(例如水合二氧化硅)、 氧化铁、氧化铝、珍珠岩、塑料颗粒例如聚乙烯、及其组合。具体地 讲，摩擦剂可选自磷酸钙(例如磷酸氢钙二水合物)、硫酸钙、沉淀的 碳酸钙、二氧化硅(例如水合二氧化硅)、焦磷酸钙和组合。任何类型 的二氧化硅都可使用，例如沉淀的二氧化硅或硅胶。优选的是市售二 氧化硅，例如INEOS AC43，可得自Ineos Silicas，Warrington，United  Kingdom。其它摩擦剂也可依据本发明使用。正如美国专利号4,358,437 所述，呈摩擦剂形式的碳酸钙的粉末形式构成这些摩擦剂中的重要一 类。这些摩擦剂是实例的磨碎的石灰石或大理石、白垩例如文石、方 解石或其混合物、以及合成的沉淀的白垩例如供水系统白垩 (waterworks chalk)。通常，碳酸钙的重量中位粒径应小于40微米，优 选小于15微米。第二类摩擦剂是粉状二氧化硅，尤其是美国专利号 3,538,230中定义的二氧化硅干凝胶(silica xerogel)。硅基成分可包括平 均粒度为1-100μm的二氧化硅颗粒，包括该范围内的任何具体粒度。

在一个实施方案中，口腔组合物任选包含硅质抛光剂。抛光剂可 以是硅质材料(例如水合硅胶、二氧化硅干凝胶)或复杂无定形碱金属 硅铝酸盐或硅锆酸盐或沉淀的二氧化硅。胶态二氧化硅材料包括以商 标SYLOID出售的材料，例如以商标SYLOID 72和SYLOID 74出售 的材料。沉淀的二氧化硅包括以商标ZEODENT例如ZEODENT 113 和ZEODENT 115和ZEODENT 119出售的那些。口腔组合物可以 0-36％的量包含硅质抛光剂。在另一个实施方案中，口腔组合物可以 0.01-36％的量包含硅质抛光剂。

在不受藉此达到本发明优势的理论所束缚的情况下，据信甚至在 抗菌剂(例如2，4，4’-三氯-2’-羟基二苯醚)的特定增溶材料不存在时，当 物质的量为0.25％-0.35％重量且存在聚羧酸盐时，存在足够的物质以 通过减量调节MMP-8、MMP-9或MMP-13中的至少一种实现对牙周 炎的治疗。这同样适用于本文所述的其它水不溶性非阳离子型抗菌 剂。

口腔组合物(例如洁齿剂)也可含有以下量的氟化物离子源或提供 氟的成分作为防龋剂，所述量足以提供25ppm至5,000ppm氟化物离 子。这些化合物可微溶于水或者可以完全溶于水。它们的特征在于其 在水中释放氟化物离子的能力和基本上不与口腔制剂中的其它化合 物发生不需要的反应。在这些材料中的是无机氟化物盐类，例如可溶 性碱金属盐、碱土金属盐或者例如氟化钠、氟化钾、氟化铵、氟化钙、 氟化铜例如氟化亚铜、氟化锌、氟化钡、氟硅酸钠、氟硅酸铵、氟锆 酸钠、氟锆酸铵、单氟磷酸钠、单氟磷酸铝、二氟磷酸铝和氟化焦磷 酸钠钙。碱金属和锡的氟化物，例如氟化钠、氟化亚锡、单氟磷酸钠 (MFP)及其混合物是优选的。通常，就碱金属氟化物而言，该成分以 至多2％重量(基于制剂重量)，优选0.05％-1％的量存在。就单氟磷酸 钠而言，该化合物可以0.1-3％的量存在，而在一个实施方案中，以 0.7-0.8％的量存在。

一方面，组合物还包含选自以下的物质：亚锡离子作用剂；含氟 化合物；氟化钠；氯己定；阿来西定；海克替啶；血根碱；苯扎氯铵； 水杨苯胺；度米芬；氯化十六烷基吡啶(CPC)；氯化十四烷基吡啶 (TPC)；氯化N-十四烷基-4-乙基吡啶(TDEPC)；奥替尼啶；地莫 匹醇；辛哌醇；乳链菌肽；锌离子作用剂；铜离子作用剂；精油；呋 喃酮类；细菌素、月桂酰精氨酸乙酯、木兰提取物、金属离子源、精 氨酸碳酸氢盐、和厚朴酚(honokiol)、厚朴酚(magonol)、熊果酸、松萝 酸、桑色素、沙棘提取物、过氧化物、酶、山茶提取物、黄酮类、黄 烷、卤化二苯醚、肌酸和蜂胶。

实施例

以下实施例进一步描述了本发明。所述实施例仅仅是说明性的并 且不得以任何方式限制所述的和要求保护的本发明范围。

实施例1：MMP-9的制备和表征

U937细胞和RPMI 1640培养基得自ATCC。人MMP-9ELISA Kit (QUANTIKINE)得自R&D Systems。胎牛血清(FBS)得自VWR，青霉 素-链霉素溶液和肿瘤坏死因子α(TNFα)得自Sigma。

将人白血病U937单核细胞淋巴瘤细胞培养在补充有10％FBS和 1％青霉素-链霉素溶液的RPMI 1640培养基中。将细胞在37℃在加湿 并含有5％CO2和95％空气的气氛中孵育。处理之前，将细胞移至含 1％ FBS的RPMI中过夜。将细胞接种到48孔板中。细胞培养基包含 TNFα(250ng/mL)、三氯生(1ppm)、或者同时包含这两种物质或两种 物质都不含(对照)。处理之后，将细胞孵育24小时。收集条件培养基 并贮存于-80℃直到进行分析。按照市售ELISA方案(图1)，对条件培 养基样品进行针对MMP-9的酶联免疫吸附测定(ELISA)。

用TNFα刺激的U937细胞产生增加水平的MMP-9。1ppm的三 氯生在TNFα刺激的U937细胞中显著降低MMP-9水平。

表1：图1的数据，表明三氯生对MMP-9生成的影响。

  平均(ng/ml)   标准差(ng/ml)   对照   0.114   0.024333   TNFα   0.275   0.048665   TNFα+三氯生1ppm   0.155   0.004867

实施例2：MMP-13的制备和表征

甲状旁腺激素(大鼠PTH 1-34)购自Sigma。将UMR 106-01细胞 培养在补充有以下成分的Eagle氏最低必需培养基(EMEM)中：25mM Hepes pH 7.4、1％非必需氨基酸、100单位/ml青霉素、100μg/ml链 霉素、5％胎牛血清。按照以下方法进行实时定量RT-PCR：将UMR  106-01细胞接种在12孔板中并在细胞培养基中培养2-3天。当细胞汇 合时，用1％胎牛血清更换细胞培养基并过夜，用于细胞饥饿。将细 胞与洁齿剂一起预孵育15分钟并随后与PTH(10^-8M)一起孵育4小 时。

用TRIzol试剂，从经历或未经历PTH刺激的UMR 106-01细胞 中提取总RNA。使用Invitrogen SUPERSCRIPT试剂盒，按照制造商 的说明书，将总RNA(0.1μg)逆转录为cDNA。使用引物，对cDNA 进行PCR，所述引物的序列见下表2。通过将2.5μl cDNA加入到含 各引物(0.2μM)和12.5μl Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG (Invitrogen)的PCR混合物(22.5μl)中，对所有cDNA进行扩增。将反 应物在50℃预孵育2分钟以通过UDG净化含dU的DNA，然后在 95℃孵育2分钟以灭活UDG并激活Taq。进行以下PCR程序49轮： 在95℃变性15秒钟，在60℃退火和延伸引物30秒。通过使用2-δδ CT方法测定基因表达的相对定量，其中基因表达的倍数改变与对照 样品成比例。所有样品都归一化到β-肌动蛋白。

所有结果都表示为一式三份测定的平均值±标准差(S.E)，所有实 验都重复至少3次。用学生t检验进行统计学分析。

用PTH刺激的UMR细胞的MMP-13表达增加。10ppm、4ppm 和1ppm的三氯生明显降低了经PTH刺激的UMR细胞中的MMP-13 表达。含10ppm三氯生的洁齿剂浆液明显降低了经PTH刺激的UMR 细胞的MMP-13表达。

表2：引物序列

  大鼠MMP-13基因   5’-GCCCTATCCCTTGATGCCATT-3’(正义)   5’-ACAGTTCAGGCTCAACCTGCTG-3’(反义)   大鼠-肌动蛋白基因   5’-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3’(正义)   5’-ACCCTCATAGATGGGCACAG-3’(反义)

实施例3：抗炎活性物的测定

通过测定抑制IL-1B、IL-6、IL-8、GM-CSF和/或TNF-α的能力， 针对潜在抗炎活性测定化合物。评估了生物样品(例如唾液)或体外样 品(例如细胞培养上清液)中存在的细胞因子和/或其它炎性标记。例如， 产生在特定的标记浓度下的抑制百分数并用于与以同样方式评价的 其它标记进行比较。

从接触牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)的细胞培养物 中制备细胞培养上清液。可按本领域已知的任何方法制备细胞培养 物。例如，将牙龈细胞在装有含胎牛血清(FBS)的0.5％血清的96孔板 上培养过夜。第二天去除培养基并加入新鲜的无FBS培养基，将平板 在37℃孵育，直到以后使用。通过将100μl HKPG(10¹⁰/ml储液)加 入到10ml培养基中，用热灭活牙龈卟啉单胞菌(HKPG)制备另一份培 养基储液。

通过将2μl试验物加入到198μl含10⁸/ml HKPG的培养基中， 自1％储液预稀释试验物(例如标记)。再用含HKPG的培养基(镜板 (mirror plate))将试验物稀释至终浓度1ppm和0.5ppm。阴性对照是不 含HKPG或试验物的培养基。阳性对照是含HKPG的培养基。

将含有试验物稀释液的微量培养板用培养基洗涤一次。将来自镜 板的条件培养基加入到细胞板上的同一样品位置并孵育过夜。第二 天，从各孔取出50μl培养基用于基于流式细胞术的测定(例如 LUMINEX)。

制备用于LUMINEX 5-PLEX测定的试剂。通过将285ml去离子 水加入到15ml储备洗涤液中制备洗涤液。通过将2.25ml洗涤液加入 到0.25ml 10x珠粒储液中，在稀释液中制备测定珠粒。通过将9ml 去离子水加入到1ml 10x生物素化检测物中，制备1x生物素化抗体。 通过将9ml去离子水加入到1ml 10x链霉抗生物素-RPE储液中，制 备1x链霉抗生物素-RPE。

对于5-PLEX测定，通过按照产品说明书并重配测定稀释剂(例如 唾液)或通过使用50％测定稀释剂/50％培养基，来制备标准品。让标 准蛋白在室温下再水化10分钟(必须在1小时内使用)。通过进行系列 稀释制备1∶729的稀释样品，将重配的标准品在测定稀释剂(唾液)或 50％测定稀释剂/50％培养基中系列稀释，来制作标准曲线。

对于5-PLEX测定，通过将0.2ml洗涤液移液到平板各孔中，等 待15-30秒，然后用真空歧管吸出溶液，来预湿润各孔。将稀释的珠 粒溶液涡旋振荡30秒，然后超声处理至少30秒，然后立即用于测定。 将稀释的珠粒溶液(25μl)放入各孔并避光。将洗涤液(0.2ml)加入各 孔，15-30秒之后用真空歧管吸出洗涤液。重复洗涤步骤，然后将残 余液体从板底吸去。将孵育缓冲液(50μl)加入到各孔，再将100μl合 适的标准品稀释液加入各指定孔，接着依次将50μl测定稀释剂、50μ 样品加入到指定的样品孔中。在定轨摇床上以500-600RPM的摇动速 率，将平板在室温下孵育2小时。

用真空歧管从板孔中吸出液体，再将0.2ml洗涤液加入到孔中， 孵育15-30秒，再重复洗涤步骤，接着从板底吸干。将生物素化检测 物抗体(1x，100μl)加入到孔中并在定轨摇床上以500-600RPM的摇动 速率将平板在室温下孵育1小时。用真空歧管从孔中吸出液体，然后 如上所述地洗涤。将链霉抗生物素-RPE(1x，100μl)加入到各孔。在定 轨摇床上以500-600RPM的摇动速率，将平板在室温下孵育30分钟。

在孵育平板的同时，准备用于测定的LUMINEX100仪器。用真 空歧管从板孔中吸出液体，再将0.2ml洗涤液加入到孔中，孵育10 秒，再重复洗涤步骤2次。将洗涤液(100μl)加入到各孔，在定轨摇床 上以500-600RPM的摇动速率，将平板在室温下孵育2-3分钟。然后 将平板揭开并插入到LUMINEX仪器中，进行读取和分析。

用合适的曲线拟合软件，根据标准曲线测定样品浓度。通过首先 从阳性对照中的细胞因子水平中减去具有试验物的细胞因子水平，求 出各浓度的试验物对细胞因子的抑制。然后将该值除以阳性对照中的 细胞因子水平，再乘以100，得出用各具体试验物的百分比抑制。

也可通过绘制已知浓度的标记的不同样品的吸光度曲线，来产生 任何标记的标准曲线。然后可将标准曲线用于促进确定后续测定和分 析中的标记浓度。

实施例4：标记和疾病状态的免疫化学分析

针对以下标记产生抗体：FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、 CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、IL-12A、IL-6、LCN8、B-因子和 LPO。针对包括特异性、免疫原性、疏水性和cDNA可用性在内的标 准进行抗体产生的结构域选择。每个靶序列均PCR扩增自cDNA模 板并插入到2个原核表达载体中，一个用于产生抗原，一个用于产生 亲和配体。

也用市售抗体进行了试验。市售抗体的蛋白质印迹分析表明，IL-6 和MMP-9是用于额外分析和测试的良好候选者。

给产蛋鸡(来亨鸡(Leghorn)和罗得岛州红鸡(Rhode Island Red))注 射抗原。在第一次强化后10天和第二次强化后5天采集试验样品。 采用蛋白质印迹或ELISA测定，用重组蛋白/肽来测试样品。用亲和 纯化来纯化抗体。来自Jurkat、A549、HELA和HEK293细胞的细胞 提取物用于测试抗体。

针对IL-6、MMP-9和BFa(B-因子)的抗体用于免疫组织化学(IHC) 研究，以鉴定与各种健康和患病状态相关的组织中生物标记的存在情 况和/水平。牙龈组织标本得自3名龈炎受试者(两名轻度病例，一名 中度病例)。牙龈组织也得自5名具有健康牙龈的受试者。制备石蜡包 埋和福尔马林固定的组织切片，用于分析。自具有炎症、出血、肿胀 和表面质地改变的临床证据的龈炎组织来源采集多个拭子(swipe)。健 康牙龈来源来自牙齿拔除(tooth removal)或冠修复(crown restoration)。 标本信息包括探诊深度、牙齿数目、所收获的牙龈面积和数量。对于 IL-6和Bfa，对照组织是正常骨髓，而对于MMP-9，则是乳腺癌组织。

MMP-9在健康组织和龈炎组织中都显示出强烈染色。可将 MMP-9的结果与例如本文所给出的其它生物标记的数据(例如得自其 它MMP的数据)结合起来，以得到患者牙周病的详细诊断。IL-6仅在 单核细胞中染色，这与蛋白质印迹结果(即与Jurkat细胞反应)一致。 使用抗IL-6抗体和抗BFa抗体以及石蜡包埋的组织，在健康和患病组 织之间的比较中也观察到相关趋势，但不如对MMP-9所得到的明显。

已参考某些优选实施方案描述了本发明。然而，由于其中的明显 改变对本领域技术人员是显而易见的，所以并不认为本发明限于此。 本文任何地方所引用的所有专利、专利申请和参考文献都通过引用以 其整体结合到本文中。