食品中36种人工合成色素高通量快速筛查方法

摘要

本发明公开了一种食品中36种人工合成色素高通量快速筛查方法，是基于液相色谱/飞行时间质谱建立的食品中36种人工合成色素高通量快速筛查方法，可同时定性、定量与确证。

说明书

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种食品中36种人工合成色素高通量快速筛查方法。 

背景技术

人工合成色素广泛应用于食品工业，但这些化合物可能对人体产生的危害也逐渐为人重视。各国法规对允许添加的人工合成色素品种与添加量有不同规定。同一种人工合成色素有可能在一个国家被允许使用，而在另一国家禁用。因此，建立普适的筛查方法十分必要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种食品中36种人工合成色素高通量快速筛查方法，是基于液相色谱/飞行时间质谱建立的食品中36种人工合成色素高通量快速筛查方法，可同时定性、定量与确证。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

食品中36种人工合成色素高通量快速筛查方法是基于液相色谱/飞行时间质谱建立的食品中36种人工合成色素高通量快速筛查方法。

色素标准品：亮黑、柠檬黄、喹啉黄、胭脂红、酸性紫7、苋菜红、酸性红2G、酸性黄17、日落黄、诱惑红、坚牢黄、结晶丽春红6R、偶氮玉红、丽春红SX、萘酚蓝黑、间苯二酚黄、靛蓝、酸性红26、酸性红4、丽春红3R、酸性红52、萘酚黄色-S、荧光素钠、毛料绿色S、专利蓝五、坚牢绿FCF、亮蓝FCF、亮绿SF、酸性绿3、赤藓红、荧光桃红、孟加拉玫瑰红、新红、曙红Y、橙色Ⅰ和橙色Ⅱ；

所述的方法的具体步骤如下：

1）筛查：定性采用四通道锥孔电压扫描，调用已建立的质谱筛查数据库以分子式匹配模式自动检索，质量允许误差设置10ppm；

2）确证：对筛查发现的可疑化合物采用保留时间结合源内裂解进一步确证；

3）定量：对于确证为违禁染料的化合物定量。根据化合物不同，分别采用优化的锥孔电压，基体工作曲线外标法定量；超过线性范围的样品，需要稀释。

本发明的显著优点在于：基于液相色谱/飞行时间质谱建立的食品中36种人工合成色素高通量快速筛查方法，可同时定性、定量与确证。

附图说明

图1为36种化合物的化学结构式。

图2为筛查出样品中含有孟加拉红的流程图。图2-1为所建立的质谱筛查数据库截图；图2-2是检出孟加拉玫瑰红；图2-3是所筛查的孟加拉红质谱图；图2-4是筛查结果。

图3为糖果中检出的荧光桃红，图3-1为荧光桃红标准品碎片离子质谱图，图3-2为糖果样品中所含荧光桃红的碎片离子质谱图。

图4是可疑红菇样品总离子流色谱图与质谱确证图。图4-1为红菇样品总离子流色谱图（上）与标准品色谱图（下）；图4-2为可疑物的质谱图；图4-3为酸性红标准品质谱图。

具体实施方式

试剂和材料

色素标准品：亮黑、柠檬黄、喹啉黄、胭脂红、酸性紫7、苋菜红、酸性红2G、酸性黄17、日落黄、诱惑红、坚牢黄、结晶丽春红6R、偶氮玉红、丽春红SX、萘酚蓝黑、间苯二酚黄、靛蓝、酸性红26、酸性红4、丽春红3R、酸性红52、萘酚黄色-S、荧光素钠、毛料绿色S、专利蓝五、坚牢绿FCF、亮蓝FCF、亮绿SF、酸性绿3、赤藓红、荧光桃红、孟加拉玫瑰红、新红、曙红Y、橙色Ⅰ和橙色Ⅱ（表1）；甲醇、乙腈、氨水、聚酰铵粉；G3玻璃沙芯漏斗，配带通气支口的150mL磨口锥形瓶；Supleco SAX SPE柱，500mg/3mL；Waters OasIs MAX SPE柱，60mg/3mL。

1.2 仪器

AgIlent 1240超高压液相色谱仪器，配有二极管阵列检测器（DAD）与AgIlent 6224 飞行时间质谱仪（TOF-MS）；旋转蒸发仪；漩涡振荡器；离心机；固相萃取装置。

1.3 实验条件

色谱条件：色谱柱：安捷伦 SB-C18柱，50×4.6mm，1.8μm；流动相A：5％甲醇（含5mmol/L乙酸铵），B： 95％甲醇（含5mmol/L乙酸铵）；梯度洗脱，95％A，保持2mIn，5mIn内变化至50%，3mIn变化至10 %，保持5mIn，5mIn内恢复至95％，梯度周期后维持5mIn，流速0.2 mL/mIn。采用DAD检测时，检测波长为多波长通道设置，分别为254、510、480、400、580、630 nm；进样量2μL。

质谱条件：

质谱扫描范围：100-1700 m/z；扫描模式：高分辨模式；脱溶剂气及雾化气：氮气；脱溶剂气流量：11 mL/mIn，脱溶剂气温度：360℃；雾化压力：50psI；毛细管电压：3500 V；分液电压（skImmer）：65 V。定性扫描时，同时设置四电位锥孔电压为90、120、160、180V；定量时，采用优化的锥孔电压（表1）。采集数据过程同时采用第二根雾化喷针实时加入质量参比溶液校正质量校正轴，辅助校正溶液喷雾压力5 psi。三点质量校正，质量校正物质分别为TFA anIon （C₂O₂F₃、112.985587）、PurIne (C₅H₅N₃，119.036320)和Formate adduct(C₁₉H₁₉O₈N₃P₃F₂₄, 966.000725)；样品进样2μL。

样品前处理

不凝胶的糖类等可溶样品：称取样品10.00g（或者采用溶解样品，取适当体积比例），加入约30m～50mL 70℃热水溶解，难溶的可以加热煮沸15mIn，冷却后根据溶液的色泽深浅，选择是否适当稀释体积(稀释的样品要重新折算称样量)，取全部或者部分经过稀释的溶液，加入2g 80目细度的聚酰胺粉，玻璃搅拌吸收色素，然后过G3玻璃沙芯漏斗，带通气支口的150mL磨口锥形瓶收集过层析柱液，用样品全部过滤后，用pH＝6～7的去离子水洗涤20-30mL，再以体积比为50%的甲醇50mL淋洗，抽真空1～2mIn，将聚酰胺粉内吸收水分尽可能抽干然后，最后用含体积比为10%氨水的甲醇60mL，分2～3次洗脱聚酰胺粉上吸附的色素，洗脱至沙芯漏斗上的聚酰胺粉颗粒无色，往洗脱液中加入5mL 冰醋酸中和氨水，然后55～60℃水浴旋转浓缩至溶液体积少于5mL，加去离子水定容至5mL，过水性滤膜上机。

含可溶性凝胶的糖果样品：称取样品10.00g，加热溶解后直接加入聚酰胺粉，乘热过G3沙芯漏斗，以下同上述糖类样品的前处理。如果发现样品所含凝胶遇冷凝固，导致堵塞沙芯，使得样液过漏斗速率慢甚至无法通过沙芯的情况出现，则换用以下处理方式：称取样品后，加去离子水，加热溶解，加入聚酰铵粉后，溶液转移到50mL离心管内，漩涡振荡1mIn，低速3500rpm，5mIn离心，弃去上层无色溶液，然后先后用去离子水、50％甲醇洗涤下层聚酰胺粉层，漩涡1mIn，弃去上层，最后采用含10%氨水的甲醇溶液脱色下层2次，漩涡振荡，然后离心，合并两次上层带色溶液，加入冰醋酸中和后，以下处理同上。

含有不可溶固相物的样品：如蜜饯，酱菜等，称取样品10.00g，加热溶解色素后，过滤，取滤液加入聚酰胺粉，以下处理同上。

液体样品：称取10.00g样品，含气饮料、酒类样品先加热除去气泡，而后加入聚酰胺粉，以下处理同上。

试验方法

筛查：采用四通道锥孔电压扫描，调用已建立的质谱筛查数据库以分子式匹配模式自动检索，质量允许误差设置10ppm；

确证：对筛查发现的可疑化合物采用保留时间结合源内裂解进一步确证；

定量：基体工作曲线外标法定量。超过线性范围的样品，需稀释。

结果

2.1 化合物的分子结构信息

化合物的分子结构信息见表1。

表1  36种化合物的信息

2.2 筛查

以筛查食品中是否含有孟加拉红为例说明筛查过程。

1）首先建立质谱筛查信息数据库，数据库包括质量信息、分子式组成以及碎片信息，该数据库可不断扩充。

2）按本节2.3对样品进行前处理。经液相色谱/飞行时间质谱检测获得总离子流色谱图，以安捷伦Masshunter质谱工作站软件根据在1）中所建立的质谱筛查信息数据库中进行检索。根据检索结果，结合同位素峰的丰度比和质量差匹配理论分子式组成以及其它特征离子信息（如含有加氢离子，失单电子离子，对应多价态离子、二聚体、脱水峰以及各种中性脱失离子）与化合物在液相色谱上的保留时间实际判断。图2为检索流程。

确证

作为高分辨质谱，TOF-MS确证的评分标准是一个母离子2分，一个子离子2.5分，4分即可作为化合物确证的要求（2002/657/EC），在本试验条件下所有化合物的结果均可达到这个要求。另结合色谱保留时间，可以确证可疑化合物。

图3为糖果中检出的荧光桃红，图3-1为荧光桃红标准品碎片离子质谱图，图3-2为糖果样品中所含荧光桃红的碎片离子质谱图。

图4为红菇样品中检出疑似酸性红4，虽然质谱图（图4-2）与酸性红4标准品的质谱图（图4-3）一致，但保留时间与酸性红标准品不一致（图4-1（下）），不能判定为酸性红4。

定量

在各类液相色谱与质谱联用的分析中，基质效应客观存在，并随样品的不同影响作用不同。对常见的几种食品饮料、蜜饯、葡萄酒、火腿肠、糖果的基质效应进行了研究。本节采用提取后添加法建立数学模型评定基质效应，比较了纯的标准品溶液（set 1）、不同来源的生物样品基质提取后添加（set 2）以及不同来源的样品基质提取前添加（set 3）等3个条件下的信号峰面积平均值，基质效应(ME)=Set2／Setl，提取回收率(RE)=Set3／Set2，方法过程效率(PE)=Set3／Setl。选取不同来源的空白基质，在低、高2个浓度点重复测定5个样品（表2）。由表2可知，不同食品所产生的基质效应不同，可能造成外标法定量的偏差，极性越强的化合物受到的基体抑制效应越强。采用基质加标曲线或采用内标法定量是一种较理想选择。

方法的适应性研究

本节所涉及的36种化合物在 0.05～5μg/mL浓度范围内线性良好，相关系数均大于0.99。以信噪比S/N=10计算分析溶液的最低定量浓度，以称样量10g，最终样液体积5mL中的基质背景与信号的信噪比S/N=10计算方法的定量限。线性范围、相关系数、最低定量浓度以及定量限见表2。

为验证方法的适用性，本节以糖果、葡萄酒、果汁饮料、蜜饯、火腿肠进行添加回收实验，添加浓度分别为1、2、5mg/kg，每个样品、每个浓度重复测定6次，基质加标曲线定量。各样品在添加前均采用液相－可见光检测方法计算实际含有色素种类及含量，计算过程均扣除样品本底值。以添加回收率计算方法准确度、相对标准偏差，结果见表3。

表2   各基体曲线及线性

*样品基体依次为果汁饮料、蜜饯、葡萄酒、火腿肠、糖果

表3   36种化合物的回收率及相对标准偏差（n=6）

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。