一种黑色玉米须多糖的提取工艺

摘要

本发明公开了一种黑玉米须多糖的提取工艺，包括粗提过程，脱蛋白过程，脱色过程，分级及纯化过程，粗提采用蛋白酶K水浸提与超声提取相结合的方法，脱蛋白工序为Sevage法与三氯醋酸法交替脱蛋白，脱色工序采用乙醇脱色与过氧化氢脱色相结合的方法，分级与纯化工序采用DEAE-纤维素(氯型)柱层析方法。本发明与现有技术相比，具有回收率高，脱色效果好，多糖纯度高等特点。所制备的黑玉米须多糖，具有较好的抗癌、降血脂作用。

说明书

技术领域：

本发明属于天然植物的提取工艺这一技术领域，特别属于黑玉米须多糖的工艺这一技术领域。

背景技术：

玉米须是禾本科作物玉米的干燥花柱和柱头，具有消肿、利尿、平肝和利胆之功效，用于治疗高血压、糖尿病、肾炎性水肿、湿热黄疸、胆结石等病症。玉米须中多糖含量高达4～5％，是玉米须主要活性成分之一。据大量文献报道，玉米须多糖具有调节血糖、抑制肿瘤生长、调节机体免疫及抗氧化等多种功能特性。我国素有逢黑必补的养生理念，目前黑色玉米在市场倍受青睐，研究表明黑玉米营养含量明显高于其他谷类作物，其中黑玉米秆含糖量就达到11.95％，比普通玉米秆高1～3倍。但到目前为止，黑玉米须多糖的提取工艺和功能研究未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种纯度好，回收率高的黑玉米须多糖的提取工艺。

本发明解决技术问题的技术方案为：一种黑玉米须多糖的提取工艺，包括粗提过程，脱蛋白过程，脱色过程，分级及纯化过程。

所述的粗提过程包括粉碎过筛工序，脱脂、水浸提工序，超声波提取工序：

所述的脱脂工序为：将粉碎好的黑玉米须中加入石油醚，在60-65℃回流1h，冷却至室温，挥干溶媒，得到粉渣；黑玉米须与石油醚的重量体积比为(g/ml)＝1∶3。

所述的水浸提工序为，将脱脂工序得到的粉渣加入蒸馏水与蛋白酶K于40-55℃，浸提1.0小时，得到浸提液；黑色玉米须粉末与蒸馏水的重量比为1∶20。蛋白酶K与黑玉米须原料的重量比为0.5-1.5∶200；

所述的超声波提取工序：将浸提液于55-60℃以25-35kHz的超声波提取45分钟，离心，收集上清液；上清液经减压浓缩后，依次用95％乙醇、无水乙醇、乙醚洗2-3次、将沉淀在-65℃真空冷冻干燥至恒重，得黑色玉米须粗多糖。

加入蛋白酶K的目的是为了破坏细胞膜结构，有利于多糖的溶出，也有利于下一步色素和蛋白质的除去。

所述的脱蛋白工序为Sevage法与三氯醋酸法交替脱蛋白，再将脱蛋白后的多糖装入直径22mm，截留相对分子质量为3500的透析袋中，蒸馏水流水透析48小时，得到脱蛋白后的黑色玉米须粗多糖；若单独使用Sevage法或与三氯醋酸法，将会导致脱蛋白次数多，且脱不完全的不利后果。

所述的脱色工艺为：在脱蛋白的黑色玉米须粗多糖中加入体积浓度为90％乙醇或10％过氧化氢，于55-75℃，振摇1小时，再静置2小时，得到脱色的黑色玉米须混合多糖；脱蛋白的黑色玉米须粗多糖与体积浓度为90％乙醇或10％过氧化氢的重量体积比(g/ml)为1∶10。

脱色的基本思路是黑玉米须中的色素等物质多为花色苷类，可溶于乙醇，但多糖不溶于乙醇，因此经振摇后静置可将色素除去，少量未去除的色素进一步经过氧化氢氧化脱色。

分级与纯化工序采用DEAE-纤维素(氯型)柱层析方法。具体为：以DEAE-纤维素为填料，离子交换树脂与已脱色和脱蛋白后的黑色玉米须混合多糖的质量比为20∶1，以离子强度为0-2mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，收集单一峰，于压力0.08-0.1MPa，温度40-60℃减压浓缩0.5-2小时，再将浓缩的多糖装入直径22mm，截留相对分子质量为3500的透析袋中，蒸馏水流水透析48小时，依次用95％乙醇、无水乙醇、乙醚洗2-3次，在-65℃真空冷冻干燥至恒重，得到黑色玉米须纯多糖。

本发明与现有技术相比，黑色玉米须多糖的分离纯化属于首次研究，主要涉及到多糖的提取以及脱色方式不同，采用该方法得到的多糖回收率高、纯度高，色泽好。并且该混合多糖具有预防某些癌细胞生长、降血脂作用。

附图说明

图1为黑玉米须多糖在二乙胺基乙基纤维素柱上的洗脱图谱，表明黑玉米须多糖为两种多糖的混合多糖。

图2为黑玉米须多糖的红外吸收曲线，表明所提取的物质为多糖类。

图3为黑玉米须多糖的紫外可见吸收曲线，表明脱蛋白后的多糖已基本不含蛋白质。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作详细的说明。

实施例1：

黑玉米须多糖纯度的计算方法为：y＝0.0113x-0.0417，R²＝0.9991，式中x多糖的百分含量，y为多糖液的苯酚-硫酸反应在490nm处的光吸收值。

粗提过程：黑玉米须原料500g，于50℃烘干36小时，粉碎，过60目筛，加入1.5L石油醚，在60-65℃回流1h，冷却至室温，挥干溶媒，粉渣加入蒸馏水以及蛋白酶K浸提1.0小时(40-55℃左右，pH 6-8)，最后于55-60℃以25-35kHz的超声波提取45分钟，离心，收集上清液；上清液经减压浓缩后，依次用95％乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚洗数次、真空干燥得黑玉米须粗多糖。黑色玉米须与蒸馏水的重量比为1∶20，蛋白酶K与黑玉米须原料的重量比为0.5∶200。

脱蛋白过程：采用体积分数5％三氯乙酸和Sevag(氯仿与正丁醇体积比为4∶1)相结合的方法脱蛋白，至多糖相与下层氯仿-正丁醇相中间无变性蛋白为止，共脱6次。将脱蛋白后的多糖装入直径22mm，截留相对分子质量为3500的透析袋中，以除去多糖溶液中的小分子物质。

脱色工序采用95％的乙醇脱色，pH为中性，温度为75℃，脱色过程中不断振摇，时间为1h，之后静置2，经2次脱色后的多糖仍显棕色。

分级与纯化过程：以二乙胺基乙基纤维素为填料，二乙胺基乙基纤维素与混合多糖的质量比为20∶1，流速1.5ml/min，先以蒸馏水平衡，再以离子强度为0-2mol/l的氯化钠溶液进行梯度洗脱，洗脱液每8ml收集1管，每10管用苯酚-硫酸法跟踪检测，依吸光度对洗脱液体积作图，收集单一峰，减压浓缩后，蒸馏水透析48h，依次用95％乙醇、无水乙醇、乙醚洗2次、在-65℃真空冷冻干燥至恒重，得两种黑色玉米须纯多糖。

实施例1所得黑玉米须粗多糖为23.64g，纯多糖有两种，为灰白色，其纯度为90.4％和90.1％，两种多糖总量为20.34g，按黑玉米须多糖总含量为4.46％计算，纯多糖得率为82.3％。

实施例2：

粗提过程：黑玉米须原料500g，于50℃烘干36小时，粉碎，过60目筛，加入1.5L石油醚，在60-65℃回流1h，冷却至室温，挥干溶媒，粉渣加入蒸馏水以及蛋白酶K浸提1.0小时(40-55℃左右，pH 6-8)，最后于55-60℃以25-35kHz的超声波提取45分钟，离心，收集上清液；上清液经减压浓缩后，依次用95％乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚洗数次、真空干燥得黑玉米须粗多糖。黑色玉米须与蒸馏水的重量比为1∶20，蛋白酶K与黑玉米须原料的重量比为1.0∶200。

脱蛋白过程：同实施例1。

脱色工序采用10％过氧化氢脱色，脱色时间为2h，pH为6.5-7.5，温度为55-60℃，经2次脱色后的多糖显浅棕色，但较实施例1浅。

分级与纯化过程：同实施例1。

实施例2所得黑玉米须粗多糖为24.66g，纯多糖两种，为灰白色，其纯度均大于90.4％(91.7％和91.5％)，多糖总量为18.86g，按黑玉米须多糖总含量为4.46％计算，纯多糖得率为77.8％。

实施例3：

粗提过程：黑玉米须原料500g，于50℃烘干36小时，粉碎，过60目筛，加入1.5L石油醚，在60-65℃回流1h，冷却至室温，挥干溶媒，粉渣加入蒸馏水以及蛋白酶K浸提1.0小时(40-55℃左右，pH 6-8)，最后于55-60℃以25-35kHz的超声波提取45分钟，离心，收集上清液；上清液经减压浓缩后，依次用95％乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚洗数次、真空干燥得黑玉米须粗多糖。黑色玉米须与蒸馏水的重量比为1∶20，蛋白酶K与黑玉米须原料的重量比为1.5∶200。

脱蛋白过程：同实施例1。

脱色工序采用90％的乙醇脱色(振摇1h，pH为中性，温度为75℃，之后静置2h)与10％过氧化氢脱色(脱色时间为2h，pH为6.5-7.5，温度为55-60℃)联合，各脱一次，所得混合多糖为浅黄色。

分级与纯化过程：同实施例1。

实施例3所得黑玉米须粗多糖为25.01g，纯多糖也是两种，基本上为白色，其纯度均大于92.5％(94.4％和94.8％)，多糖总量为20.72g，按黑玉米须多糖总含量为4.46％计算，纯多糖得率为88.1％。

总结实施例1-3，不难发现(1)加蛋白酶K 1.0-1.5g所得粗多糖要比加0.5g多(通过其百分含糖量也证明了这一点)，说明蛋白酶K在此过程中不仅能使细胞膜破坏，多糖易溶出，而且也有可能通过降解蛋白质，使多糖游离。(2)90％的乙醇脱色与10％过氧化氢脱色联合，可使色素除去更完全，单纯乙醇脱色效果较单纯过氧化氢脱色差，但多糖得率相对较高，单纯过氧化氢脱色可能使多糖有部分降解或损耗，所以得率降低。(3)加蛋白酶1.5g以及联合脱色多糖纯度最高，原因是与蛋白结合或者与色素结合的多糖均得到有效地解离。

实施例4：

黑玉米须混合多糖的降血脂作用

a小鼠饲喂与给药：小鼠经实验室适应性喂养1周后，按体重随机分为5组：正常对照组、高血脂模型对照组、多糖低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组8只，雌雄各半。分组后正常对照组喂以基础饲料，其余各组喂以高脂饲料，自由饮水。每天下午2点给多糖组按低、中、高剂量ig不同浓度药物，对照组和模型对照组ig等体积蒸馏水，连续10周。

b血脂测定：测定前均禁食不禁水12h，断头取血，离心分离血清，用全自动生化分析仪测定总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)，低密度脂蛋白(LDL-C)，由Friedwald WT公式LDL-C＝TC-(1/5TG+HDL-C)计算，动脉硬化指数(AI)由公式AI＝(TC-HDL-C)/HDL-C计算。由表1可看出，黑玉米须多糖具有显著的降血脂活性，尤其是降胆固醇作用，多糖浓度越高，作用越明显。

表1黑玉米须多糖的降血脂作用

与高血脂模型对照组比较：*P＜0.05

实施例5：

黑玉米须多糖体外抗癌作用

人肝癌细胞BEL-7402和人胃癌细胞SGC-7901分别用含10％小牛血清的DMEM培养基(内含100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素)，在37℃，5％CO2且湿度饱和的孵箱中培养；传代时用0.1％胰酶消化。

取对数生长期肝癌BEL-7402和胃癌SGC-7901细胞，胰酶消化后用含10％小牛血清DMEM培养基(含100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素)配制成单细胞悬液。

取96孔培养板，各组加入100μL已配制肝癌BEL-7402单细胞悬液，每孔约0.5×10⁴个细胞，每组均设4个复孔。24h贴壁后，加入各组药物；对照组加入100μL PBS溶液，多糖五个剂量组分别加入100μL不同浓度多糖溶液，使其终浓度分别为1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL。37℃，5％CO₂培养箱中培养。胃癌SGC-7901细胞处理方法同上。

培养24h后弃上清，每孔加5.0mg/mL MTT 10μL。37℃继续培养4h，小心倒出孔内上清液，用PBS缓冲液缓慢震荡清洗两遍，每孔加DMSO 100μL，振荡10min，使结晶物充分溶解；在酶标仪上于490nm波长处测吸光度值(OD值)，取各组细胞的均值进行计算。肿瘤细胞抑制率(IR)＝(1-实验组OD值/对照组OD值)×100％。

以多糖浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，在EXCEL表格中绘制标准曲线，得到两种瘤细胞回归方程，计算抑制率为50％时的多糖浓度。

MTT法检测

本实验设立多糖浓度为1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL，与贴壁后的肝癌BEL-7402、胃癌SGC-7901分别作用24h，结果见表1、表2。由表1可知，黑玉米须多糖在1mg/mL～5mg/mL范围内对BEL-7402有浓度依赖性抑制作用，线性关系为：Y＝11.423X+3.976(相关系数r＝0.9756)，IC₅₀为3.77mg/mL。同样由表2可知，多糖在1mg/mL～5mg/mL范围内对SGC-7901也具有浓度依赖性抑制作用，线性关系为：Y＝11.857X+1.341(相关系数r＝0.9947)，IC₅₀为3.16mg/mL。

表2不同浓度多糖对肝癌BEL-7402作用24h增殖的影响

*P＜0.05，与对照组比较

表3不同浓度多糖对胃癌SGC-7901作用24h增殖的影响

*P＜0.05，与对照组比较。