玉米须总皂苷提取工艺比较及改善糖尿病并发症的实验研究

摘要

目的:以半仿生法、水提法与乙醇浸提法三种不同的方法对玉米须总皂苷的提取工艺进行研究，比较三种提取法的优缺点，为玉米须总皂苷工艺研究、工业化发展提供依据。用纯化后的玉米须总皂苷处理糖尿病小鼠，探讨预防糖尿病并发症的效果。
　　 方法:
　　 1.玉米须总皂苷的提取工艺的研究:首先确立紫外可见分光光度法对玉米须总皂苷的含量进行定量测定。通过单因素探讨酸提取时间、碱提取时间、超声功率、料液比等因素对玉米须总皂苷提取率的影响，采用正交试验设计优选出半仿生法、水提法、醇提法提取玉米须总皂苷的最佳工艺参数，然后比较三种提取法在最佳提取工艺中的提取率。
　　 2.玉米须总皂苷纯化工艺的研究:选用D101大孔吸附树脂纯化乙醇浸提法得到的玉米须总皂苷，分别从提取液浓度、流速、不同浓度的乙醇洗脱剂等方面探讨其纯化工艺。
　　 3.玉米须总皂苷预防糖尿病并发症的研究:SPF级昆明种小鼠（合格证号:SCXK（鄂）2008-0003），雄性，体重18-22g，由武汉生物制品研究所提供，动物饲养环境符合清洁标准，小鼠正常饲养一周后供试。取健康昆明种小鼠50只，雄性。腹腔注射链脲佐菌素200mg/kg，给药前禁食禁水12h，给药后禁食12h，但不禁水，三天后测血糖，测血糖前禁食一夜，次日早测血糖，取血糖值在14-20mmol/L的小鼠为链脲佐菌素型糖尿病模型小鼠。链脲佐菌素造模成功的糖尿病小鼠随机分成3组，每组10只，但每组预备3只以免小鼠死亡。分别为模型组:链脲佐菌素模型成功的小鼠按等体积的生理盐水灌胃;阳性组:给予罗格列酮按1mg/kg体重灌胃;实验组:玉米须总皂苷提取物一次给与400mg/kg体重灌胃，模型小鼠都喂养高脂饲料;正常组:取正常小鼠给予等体积的生理盐水灌胃，正常组喂养普通饲料外，四组连续给灌喂4周，第5周对各组小鼠进行眼球采血，检测相关指标。
　　 结果:
　　 1.三种不同提取工艺比较:半仿生法的最佳提取工艺是A2B2C2D3，即酸(P=2.5)提取时间为90min，碱(P=7.5)提取时间为90min，超声功率为70W，料液比为1∶40，各因素影响作用主次顺序为A酸提取时间＞D料液比＞C超声功率＞B碱提取时间，玉米须总皂苷提取率为0.676％。
　　 水提法最佳的提取条件为A3C2B2，即提取时间为120min，超声功率为70W，料液比为1∶30，各因素影响作用主次顺序为A提取时间＞C料液比＞B超声功率，玉米须总皂苷提取率为0.329％。
　　 乙醇提取法的最佳提取条件为A1C3B3D3，即乙醇浓度为60％，提取时间为120min，超声功率为90W，料液比为1∶40，各因素影响作用主次顺序为D料液比＞C超声时间＞A乙醇浓度＞B提取时间，玉米须总皂苷提取率0.564％。
　　 三种提取法的玉米须总皂苷提取率比较结果:半仿生法提取率为0.683％，水溶剂提取率为0.341％，乙醇提取率为0.535％。其中半仿生法在三种提取工艺中提取率最高，可能原因是通过酸碱的作用使玉米须细胞壁破裂，使有效成分大量溶出，因此使玉米须总皂苷提取率提高。
　　 2.D101大孔吸附树脂纯化的最佳条件:上样体积为20ml，流速确定为2ml/min，样品浓度为44.96mg/ml，最佳洗脱液浓度为70％的乙醇。在D101树脂纯化的最佳工艺条件验证实验下，洗脱液中玉米须总皂苷的含量为36.91mg/ml，且工艺稳定。
　　 3.糖尿病小鼠模型的建立:用链脲佐菌素处理小鼠后，所测小鼠的血糖平均值为16.2 mmol/L，模型组与正常组比较有显著性差异(P＜0.01)，表明造模成功。
　　 血糖指标:实验组（玉米须总皂苷）、阳性组（罗格列酮）与模型组比较，都能显著地降低了血糖(P＜0.01);表明实验组玉米须总皂苷有降低糖尿病血糖的作用。
　　 TC（总胆固醇）、TG（甘油三酯）指标:模型组与正常组相比有显著性差异(P＜0.01)，表明链脲佐菌素型糖尿病小鼠可引发脂类代谢异常。实验组与模型组相比较差异有显著性(P＜0.05)，表明实验组玉米须总皂苷对糖尿病小鼠脂代谢异常有改善的作用。
　　 CR（肌酐）、BUN（尿素氮）指标:实验组与模型组比较小鼠血中的肌酐有显著性差异(P＜0.01)，血中的尿素氮有差异性(P＜0.05)，表明实验组玉米须总皂苷对糖尿病小鼠肾功能的改善有一定作用。
　　 小鼠体重、肾重、肾重/体重指标:实验组（玉米须总皂苷）与模型组肾重/体重的比较中实验组与模型组相比均有显著性差异(P＜0.01)，表明实验组玉米须总皂苷对糖尿病小鼠肾肿大有减少，对肾脏有一定保护作用。
　　 肾脏形态学观察:正常组小鼠肾脏肾小球体积正常，球囊腔清晰可见，肾小管上皮细胞胞浆淡染。模型组小鼠肾小球肿胀，囊腔变窄，近端小管、远端小管形状部分被破坏，结构紊乱，肾小管也有肿胀现象，模型组(X100)肾小球包裹的囊腔基本变形。实验组出现部分肾小管肿胀的现象，但肾小球形态、囊腔基本正常，表明实验组玉米须总皂苷对糖尿病小鼠肾小球病变有预防作用。
　　 结论:首次用半仿生法探讨玉米须总皂苷的提取工艺，并与水提法、乙醇浸提法对玉米须总皂苷的提取工艺进行比较，结果表明半仿生法提取率高于水提法与乙醇浸提法，为玉米须总皂苷的工业化生产提供参考。纯化的玉米须总皂苷对糖尿病小鼠脂质异常和糖尿病肾病有一定预防作用。

目录

声明

摘要

实验内容流程图

一．玉米须总皂苷提取工艺研究

1．玉米须总皂苷含量测定方法的建立

1．1 仪器与试剂

1．2 实验方法

1．3 结果与分析

1．4 讨论

2．半仿生法提取玉米须总皂苷的工艺研究

2．1 仪器与试剂

2．2 方法

2．3 结果与分析

2．4 讨论

3．乙醇提取法，水提取法对玉米须总皂苷提取工艺的研究

3．1 仪器与试验

3．2 方法

3．3 结果与分析

3．4 半仿生法、乙醇、水提取法对玉米须总皂苷提取工艺的比较

3．5 讨论

二．D101大孔吸附树脂纯化玉米须总皂苷的工艺研究

1 材料与仪器

2．实验方法

3．结果与分析

4．讨论

三．玉米须总皂苷改善糖尿病并发症的实验研究

1．实验材料

1．1 药物与试剂

1．2 动物

1．3 仪器

2．实验方法

2．1 受试药物、试剂的制备

2．2 高脂饲料的配方

2．3 链脲佐菌素型糖尿病小鼠模型的建立

2．4 实验动物分组及处理因素设计

2．5 玉米须总皂苷对糖尿病小鼠血糖的影响

2．6 玉米须总皂苷对糖尿病小鼠TG、TC的影响

2．7 玉米须总皂苷对糖尿病小鼠CR、BUN的影响

2．8 玉米须总皂苷对糖尿病小鼠肾重／体重的影响

2．9 病理切片制作

2．10 统计方法

3 结果与分析

3．1 玉米须总皂苷对糖尿病小鼠血糖的影响

3．2 玉米须总皂苷对链脲佐菌素型糖尿病小鼠TG、TC的影响

3．3 玉米须总皂苷对链脲佐菌素型糖尿病小鼠肌酐、尿素氮的影响

3．4 玉米须总皂苷对链脲佐菌素型糖尿病小鼠肾重、体重的影响

3．5 相关肾脏病理学检查结果

4．讨论

结论

综述

参考文献

附录

缩略词表

致谢