人成纤维细胞生长因子21原核细胞中可溶性表达及制备

摘要

本发明提供了一种重组制备人成纤维细胞生长因子-21(Fibroblast Growth Factor 21，FGF-21)的方法，包含编码人FGF-21的重组表达载体和宿主细胞，表达方式和制备方法。实现在大肠杆菌中直接表达具有高生物活性、无需复性的重组人FGF-21的工艺。

说明书

技术领域

本发明涉及DNA重组技术和药物领域。更具体地，本发明涉及人成纤维细胞生长因子21(Fibroblast Growth Factor 21，FGF-21)的重组制备方法，编码该蛋白的cDNA序列，含该cDNA序列的载体，含该载体的宿主细胞。本发明实现可溶性表达以及分离纯化重组人FGF-21。

背景技术

成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor，FGF)是一类由FGF基因家族成员编码的结构相关的蛋白质，对内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞等多种中胚层和神经外胚层来源的细胞有促进DNA合成和细胞分裂作用，主要由成纤维细胞、内皮细胞、骨细胞、多形细胞分泌，相对分子量一般在17～34kD。FGF家族成员的中心区域氨基酸具有30％-70％的同源性。FGF-21是最新被发现的一个FGFs成员，属于FGF-19亚科。FGF-19亚科包括FGF-15、FGF-19、FGF-21和FGF-23，与其他FGF成员不同的是，他们以内分泌的形式对代谢起调控作用，且不具有与肝素结合的功能。FGF-21主要在成熟肝脏和胸腺中表达，最早由Nishimura等(Nishimura T等，Biochim Biophys Acta，2000，1492：203-206)于2000年首次在小鼠胚胎中分离得到，其氨基酸序列与FGF-19和FGF-23的同源性分别为35％和24％。随后在胰脏、脂肪组织和肌肉组织同样发现了FGF-21的mRNA(Inagaki T等，Cell Metab，2007，5(6)：415-425)。人源FGF-21基因位于19号染色体，全长FGF-21蛋白由181个氨基酸的成熟FGF-21蛋白和位于N端的28个氨基酸的信号肽组成，其氨基酸序列与鼠源FGF-21约有75％相同。

近年来研究发现，FGF-21对血糖、血脂的代谢和体重控制起非常重要的作用。在这些作用过程中，其N末端和C末端发挥着不同的生物学功能，即N末端氨基酸参与与FGF受体的相互作用，C末端氨基酸参与与一种叫做β-Klotho的蛋白的相互作用(Micanovic R等，J CellPhys，2009，219(2)：227-234)。KharitonenkovA等在2005年首次报道了重组人FGF-21蛋白可以刺激分化的小鼠3T3-L1细胞和人前脂肪细胞的葡萄糖摄取(Kharitonenkov A等，J ClinInvest，2005，115(6)：1627-1635)。随后的研究进一步表明，FGF-21是通过增加3T3-L1细胞和人前脂肪细胞中葡萄糖载体-1(GLUT-1)的表达来增加非胰岛素依赖的葡萄糖摄取的(Arner P等，FEBS Lett，2008，582(12)：1725-1730)。与胰岛素介导的快速利用葡萄糖不同，FGF-21在葡萄糖摄取方面的效应可持续几个小时。更重要的是，FGF-21作用下的葡萄糖摄取是非胰岛素依赖性的，而且在与胰岛素共同存在时可以增加摄取葡萄糖的效应(AlexeiKharitonenkov等，Biodrugs，2008，22(1)：37-44)。FGF-21可以改善胰岛β细胞的功能。FGF-21持续处理8周的db/db小鼠餐后血糖正常，葡萄糖清除率得到明显改善，胰岛素的转录、表达和分泌增加，但胰岛细胞数量没有变化。另外，在分离的小鼠胰岛和INS-1E细胞中，FGF-21可以阻止糖脂毒性和细胞因子介导的编程性细胞死亡，保护胰岛β细胞的数量和功能，抑制葡萄糖介导的胰高血糖素的释放(Wente W等，Diabetes，2006，55：2470-2478)。在非人类灵长类糖尿病动物模型方面，注射重组人FGF-21可以降低LDL胆固醇含量，增加HDL胆固醇含量，降低患心血管方面疾病的风险(Kharitonenkov A等，Endocrinology，2007，148：774-781)。在目前进行的重组人FGF-21动物体内药效学实验中，未发现有低血糖、水肿和肥胖增多等其他糖尿病经常出现的副反应出现，显示出了良好的应用前景和安全性。

到目前为止，以大肠杆菌作为宿主细胞的重组技术工业大规模生产蛋白质方法应用最为成熟和广泛。大肠杆菌的主要优点在于易于培养，可降低生产成本；能够经过大量培养从而获得高产量的重组蛋白。但大肠杆菌的表达产物容易形成无生物学活性的包涵体，纯化后还需进行复性处理，影响了产物的回收率和活性。而国外的研究表明，人FGF-21在大肠杆菌中的表达主要以包涵体的形式存在(Wolfgang Glaesner，US2007/0265200A1)，再经复性工艺处理，获得的人FGF-21的生物活性偏低，存在异构体杂质。为了避免人FGF-21在大肠杆菌中以包涵体形式表达，国内的一些研究采用融合表达技术，将人FGF-21与分子伴侣共表达(肖业臣，人成纤维细胞生长因子-21的重组表达。CN101250547)。融合表达的另一难题在于，融合表达产物在纯化后，需要对融合蛋白进行酶切处理，获得的人FGF-21蛋白具有N末端不均一性。

为了克服以上缺点，本发明公开了一种无需引入融合蛋白，并能以可溶性形式表达高活性结构均一的人FGF-21的方法。该方法能通过高效表达人FGF-21，提高了重组人FGF-21蛋白的回收率，较高的保留了FGF-21的生物学活性。

发明内容

本发明的目的是实现人FGF-21的可溶性重组表达，提供一种成本低廉和/或步骤简便的制备所述含人FGF-21蛋白的方法。

本发明的另一目的是提供一种经过优化了的编码人FGF-21蛋白的cDNA、含该cDNA序列的载体以及含该载体的宿主细胞。该cDNA序列(SEQ ID NO：2)编码的人FGF-21氨基酸序列SEQ ID NO：1为野生型的，氨基末端含有添加的甲硫氨酸残基，表述为Met-FGF-21。

为实现上述目的，本发明首先按照大肠杆菌对密码子的偏爱性，并考虑消除发夹结构等不利于表达的二级结构，在不改变所述蛋白氨基酸序列的前提下，设计并合成了所述蛋白的cDNA序列。

其次，本发明提供一种表达载体，这种表达载体含有所述的重组序列，优选的表达载体是原核细胞表达载体，特别是适合在大肠杆菌中诱导表达的表达载体，如pET-3c、pET-5a、pET-9a和pET-12a，特别优选的是pET-3c。

接着，本发明提供一种宿主细胞，其中包含上述的表达载体。优选的宿主细胞是大肠杆菌，优选的是大肠杆菌BL(21)(DE3)PlysS。

进而，本发明提供一种重组制备人FGF-21的方法，其中通过培养上述宿主细胞，可溶性的诱导表达人FGF-21，通过纯化得到人FGF-21。具体包括如下步骤：

(a)工程菌发酵：菌体培养温度为35～37℃，更佳的37℃；菌体诱导温度20～30℃，更佳的23～25℃；pH6.5～7.5之间，更佳的在6.8～7.3之间；葡萄糖或甘油浓度为0.1～3.0％，更佳的0.5～2.0％；诱导剂IPTG 0.1～1.0mM，更佳的0.2～0.5mM；诱导前OD₆₀₀在5.0～12.0之间，更佳的在6.0～10.0之间；诱导时间4～15hr，更佳的8～12hr。

(b)分离纯化人FGF-21，所述方法包括步骤：

(i)采用高压匀浆或超声破碎发酵菌体，低温高速离心收集上清弃沉淀；

(ii)再通过盐析初步纯化人FGF-21；

(iii)采用疏水层析、阴离子交换层析、反向层析等方法纯化人FGF-21；

本发明的优点在于：通过选择合适的表达载体和宿主细胞，进行大量培养，高效可溶性表达人FGF-21，使接下来的纯化工艺变得简便可行，提高了蛋白回收率，同时保留了较高的生物学活性，使大规模制备人FGF-21成为可能。

附图说明

附图1：人Met-FGF-21的氨基酸序列和cDNA核苷酸序列对应图

附图2：重组表达载体pET-3c-FGF-21质粒构建示意图

附图3：人Met-FGF-21cDNA的全基因合成测序结果(从99位至644位碱基为Met-FGF-21cDNA的反向序列)

附图4：重组人Met-FGF-21蛋白表达SDS-PAGE电泳图谱(从左起，条带1：诱导12小时；条带2：导前对照；条带3：marker)

附图5：纯化后反相HPLC图谱(A)和人Met-FGF-21蛋白SDS-PAGE电泳图谱(B)(从左起，条带1：marker，条带2：纯化后人Met-FGF-21蛋白)

附图6：重组人Met-FGF-21对3T3-L1细胞葡萄糖摄取率的作用(纵坐标为葡萄糖摄取率CPM，横坐标为蛋白终浓度nM，其中为6×His-FGF-21活性对照品，为Met-FGF-21样品)

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，用优选的载体pET-3c和宿主细胞BL21(DE3)PlysS进行表达，能够高效可溶性地表达人Met-FGF-21。所述实例仅为说明目的，不应理解为对本发明的限制。

实例1重组人FGF-21蛋白表达T程菌的构建

在本实施例中，所涉及的人FGF-21蛋白具有Met-FGF-21结构(以下简称为FGF-21)。根据人FGF-21的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，并按照大肠杆菌偏爱的密码子，优化设计编码人FGF-21的cDNA(SEQ ID NO：2)。委托宝生物(大连)有限公司进行全基因合成，其中人FGF-21cDNA5’端引入Nde I酶切位点，3’端引入终止密码子和BamH I酶切位点，插入pMD-19-T simple vector后，转入宿主菌DH5α，阳性克隆经cDNA测序验证与设计序列完全一致(附图3)，命名为pMD-FGF21。

人Met-FGF-21的cDNA序列(SEQ ID NO：2)

ATG CAC CCA ATC CCA GAT TCT AGT CCA CTG TTA CAA TTC GGA GGT CAG

GTT CGT CAA CGT TAT CTG TAT ACC GAT GAC GCA CAG CAG ACC GAA GCC CAT

TTG GAA ATT CGT GAA GAT GGA ACC GTT GGT GGT GCT GCC GAT CAA TCT CCT

GAA TCA CTG TTA CAG CTG AAA GCA TTG AAA CCA GGA GTT ATT CAG ATT CTG

GGT GTC AAA ACC TCT CGT TTT TTA TGT CAA CGT CCT GAC GGT GCC CTG TAT

GGA AGT TTG CAT TTT GAT CCA GAA GCC TGT TCT TTT CGT GAA CTG TTA CTG

GAA GAT GGT TAT AAT GTT TAT CAG TCA GAA GCC CAC GGT TTG CCT CTG CAT

TTA CCA GGA AAT AAA TCT CCT CAT CGT GAC CCA GCA CCT CGT GGT CCA GCC

CGT TTT CTG CCA TTG CCA GGT CTG CCT CCA GCT CTG CCT GAA CCA CCT GGT

ATT CTG GCC CCA CAG CCT CCA GAT GTT GGT AGT TCT GAT CCT CTG TCA ATG

GTC GGT CCA TCT CAA GGT CGT AGT CCT TCT TAT GCA TCA

提取pMD-FGF21重组质粒，用Nde I和BamH I双酶切后，回收目的片段，用T4DNA连接酶与同样经Nde I和BamH I酶切回收的质粒pET-3c(Novagen)连接。转化大肠杆菌克隆宿主菌DH5α，用酶切和PCR验证的方法筛选重组质粒pET-FGF21(附图2)。经DNA测序(TAKARA，大连)后表明，重组表达质粒中人FGF-21基因序列与设计完全一致。将上述测序正确的质粒转化大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)PlysS(Novagen)，经表达筛选，成功构建pET-FGF21/BL21(DE3)PlysS重组工程菌。

实施例2重组人FGF-21的发酵

将表达最佳工程菌株划线接种于LA(LB培养基中加入100μg/ml Amp)琼脂平板，37℃培养过夜。从过夜培养的LA平板上挑取菌苔接种于含LB液体培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加水定溶至1000mL，121℃，高压灭菌30min即可)试管中，37℃活化12小时，然后按1％的比例转接到含200mL LB培养液的1000mL三角瓶中，37℃培养过夜即成为上罐种子液。将上罐种子液按5％的比例接种于含20L M9+YT培养液的30L发酵罐中，37℃培养，整过发酵过程中，通过调节转速、通空气量、通纯氧量来保持溶氧＞30％，用28％的氨水调节pH并保持在7.0。培养菌液OD600＝4.0～6.0时，将培养温度降至23℃，至菌液OD₆₀₀＝8.0～10.0时，加入终浓度为0.5mM IPTG，继续培养12小时后停止发酵，收集菌液，8000rpm离心10分钟，弃上清，收集菌体放入-20℃冰箱保存备用。

实施例3重组人FGF-21的纯化

发酵液用冷冻高速离心机在4℃下8000rpm离心10min，收集菌体，置-20℃冻存24小时。每1g菌体加入10ml破菌缓冲液(50mMTris，5mM EDTA，pH10.3)，30℃水浴搅拌1小时后，用ATS公司的压力匀浆机(型号：AH-BASIC)500Pa匀浆两次，用显微镜观察，菌体完全破碎，呈絮状。然后4℃下10000rpm离心10min，收集上清。

a)硫酸铵沉淀

向上清中补入40％的饱和硫酸铵溶液，4℃放置30min后，4℃下8000rpm离心10min，收集沉淀。

b)沉淀溶解

每1g沉淀用20ml的10mM PB，pH8.0缓冲液溶解，室温搅拌4～5小时。

c)Phenyl Sepharose F.F.层析

缓冲液：溶液A：10mM PB，15％饱和硫酸铵溶液，pH8.0

溶液B：10mMPB，pH8.0

平衡：用4CV的溶液A冲洗层析柱。

上样：硫酸铵沉淀后重新溶解上样。

复平衡：再用4CV的A液冲洗层析柱。

洗脱：用溶液B冲洗柱子。

收集：收集溶液B的洗脱峰，为人FGF-21的粗纯化样峰。

4、透析：按照体积比1∶200的pH8.0的10mM PB缓冲对Phenyl柱洗脱样品透析12小时。

5、Q Sepharose F.F.层析

缓冲液：溶液A：10mM PB，pH8.0；

溶液B：10mM PB，0.05M NaCl，pH8.0；

溶液C：10mM PB，0.25M NaCl，pH8.0；

平衡：用4CV的溶液A冲洗层析柱；

上样：透析12小时后的人FGF-21样品上样；

复平衡：再用A液冲洗层析柱至吸收值基达基线；

洗脱1：用溶液B冲洗柱子，除去杂蛋白；

洗脱2：用溶液C冲洗柱子；

收集：收集溶液C的洗脱峰，为人FGF-21的纯化样峰。

6、反相层析

层析介质：Welch XB-C18

缓冲液：溶液A：5％乙腈，0.1％三氟乙酸，pH2.7；

溶液B：95％乙腈，0.1％三氟乙酸，pH2.7；

平衡：用4CV的溶液A冲洗层析柱；

上样：Q柱洗脱样品上样；

复平衡：再用溶液A冲洗层析柱至吸收值为基线；

洗脱：用从0％～100％B液线性洗脱层析柱10CV；

收集：收集人FGF-21样品峰。

样品经过上述步骤纯化，即盐析、疏水层析、离子交换层析、反相层析后，纯度达到95％以上。经工艺研究，每100g菌体可纯化制备重组人FGF-21蛋白100mg～150mg。

实施例4：重组人FGF-21生物学特性检测

1、免疫印迹鉴定

按照Pharmacia Biotech Mini VE Blotter电转仪标准操作方法进行。转膜完成后，经封闭，和抗人FGF-21单抗(HRP偶联，北京爱迪博生物科技有限公司)反应显色。结果显示单一条带呈阳性。

2、N末端氨基酸序列检测

重组制备的人FGF-21蛋白经N端氨基酸序列自动分析(Edman降解法)，结果证实N末端15个氨基酸序列为：Met-His-Pro-Ile-Pro-Asp-Ser-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln-Phe-Gly-Gly，证明为Met-FGF-21形式。

3、分子量和纯度

15％SDS-PAGE电泳显示以上纯化方法所得的重组人FGF-21为20kD左右的单一蛋白条带。高效液相色谱(HPLC)C18反相柱检测结果显示，本发明所得重组人FGF-21的纯度大于98％。

4、重组人FGF-21蛋白生物学活性检测

细胞培养及诱导分化：在37℃、5％CO₂的条件下，3T3-L1前脂肪细胞在含10％FBS的高糖DMEM中培养，2天后加入含0.5mMol/L IBMX、1μmol/L地塞米松、10mg/L人胰岛素的高糖DMEM培养48hr，再换含10mg/L人胰岛素的高糖DMEM培养48hr，诱导分化8～12天的3T3-L1细胞90％左右呈脂肪细胞表型，用于以下实验。

葡萄糖转运分析：24孔板中3T3-L1脂肪细胞，同时分别加入含6×His-FGF-21活性对照品(北京爱迪博生物科技有限公司)和重组人FGF-21蛋白的培养基(0.2％BSA的高糖DMEM)，使终浓度分别为0、0.03、0.15、0.8、4、20和100nM，37℃下培养24小时。

葡萄糖被摄取检测：用加热(37℃)的KRP缓冲液(NaCl 131.2mMol/L，KCl 4.7mMol/L，MgSO₄1.2mMol/L，CaCl₂2.5mMol/L，NaH₂PO₄2.5mMol/L，pH 7.4)，洗涤两次；37℃下，在含有I％BSA、0.2μci/孔2-脱氧-〔14C〕-葡萄糖(100μl)的KRP缓冲液孵育1hr，加入10umol/l细胞松弛素B终止葡萄糖的摄取。另设一组加10μmol/L细胞松弛素B(cytochalasin B)作为2-脱氧-(14C)-葡萄糖的非特异摄取率，所有数据减去此值，作为各组细胞的葡萄糖摄取率(CPM，每分钟液闪仪计数值)。结果说明重组人FGF-21具有与活性对照品相同的促进脂肪细胞摄取葡萄糖的作用(如图6所示)，且明显高于活性对照品30％以上。