一种免疫层析试条用封闭剂组合物以及一种免疫层析试条

摘要

本发明提供了一种免疫层析试条用封闭剂组合物，包括：蛋白、蛋白保护剂、表面活性剂和第一缓冲溶液；其中，所述蛋白为酪蛋白、酪蛋白处理液、甲基化牛血清白蛋白、人血清白蛋白；所述蛋白保护剂为糖类。本发明提供的封闭剂组合物能够有效降低免疫层析试条的背景、使用寿命长，检测灵敏度高。本发明还提供了一种免疫层析试条。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫层析技术，具体涉及一种免疫层析试条用封闭剂 组合物以及一种免疫层析试条。

背景技术

随着免疫诊断技术的发展，各种原材料以及各种检测手段的综合 应用，技术越来越向小型、操作简单、快速、准确度高的方向发展。 免疫层析技术是这发展当中非常重要的一个部分，它从空间、时间上 改变了这一技术的发展方向，在空间上，它从以前的实验室搬到家庭， 在时间上，它把几天才能够出检测结果缩短到几分钟出检测结果。因 而大大推动了免疫诊断技术的快速发展。

免疫层析技术是利用抗原抗体高特异性、高灵敏性的反应原理， 通过高效信号标记物标记抗体(或抗原)来检测抗原(或抗原)。在技 术当中一个非常重要的技术难点就是抗原(或抗体)的固定材料，从 目前解决的情况来看，一般选择以下几种固定材料：硝酸纤维素膜(NC 膜)、尼纶膜、聚偏氟乙烯膜(PVDF)，因为这些膜都能够牢固的结 合蛋白质，并且结合能力非常高。其中最常见的是NC膜，因为它结 合蛋白质能力强，价格相对比较便宜。

NC膜虽然能够强有力的吸附抗原或者抗体，但是在检测生物样 本过程中，由于生物样本中存在大量的其他生物大分子，这些生物大 分子也能够非特异性吸附到NC膜上，因而严重干扰抗原抗体的识别 能力，减低检测灵敏度。因此，需要找到一种技术解决抗原(或抗体) 固定后，其他的生物大分子不会干扰抗原抗体反应的试剂

目前，有很多大量专利文献与学术文献报告过减低NC膜的背景 干扰的问题，但是他们绝大部分是采用以下两种方法处理：

采用先在NC膜固定生物大分子，然后用有机高分子物质(如 PVP、PEG、PVP)与表面活性剂结合进行封闭处理。采用先在NC膜 固定生物大分子，然后用BSA、脱脂奶粉、酪蛋白或者各种血清蛋白 (如羊血清等)单独处理或者与表面活性剂相结合处理。

NC膜经过上述几种方法处理后，使原本疏水的膜变得亲水，同 时生物大分子在NC膜上的吸附能力大大降低，但是NC膜经过以上 一系列处理后，也带来了很多问题：如因为表面活性剂的加入使原先 固定在NC膜的蛋白质位置产生改变，蛋白质线出现弥散，原先固定 在NC膜上的蛋白质量降低。其次由于NC膜在浸泡、干燥过程中发 生一定的变化也使试条整个性能发生改变，再次对于试条生产工艺来 说，这几种处理工艺非常麻烦，不利于生产工艺的放大。

因此，目前一般试条生产厂家大都选择购买经封闭处理后的NC 膜，在生产试条时不需要进行额外的NC膜封闭处理。但是这种处理 一般只解决了NC膜的亲水性能，NC膜吸附蛋白质的性能几乎没有发 生改变，NC膜吸附蛋白质的能力还很强，膜上还存在大量蛋白质结 合位点，因此很多试条生产厂家就在层析流动组分中加入BSA、表面 活性剂进行再次封闭处理，以达到降低NC膜的检测背景，但是这种 处理方法并不太理想。

层析试条一般是由这几部分组成：样品垫、NC膜、吸水垫。当 样品垫中加入被检测物时，被检测物随着溶液的流动与免疫颗粒反应， 然后随着液体的流动，免疫颗粒与固定在NC膜的抗原或者抗体再反 应，没有反应的颗粒最后被吸水垫收集。大多数文献报道是在样品垫 中加入BSA与表面活性剂以解决降低NC膜背景高的问题，如发明人 张涛(专利号：01126931.6，专利名：“应用流动封闭技术的免疫金检 测试剂盒”)报告了一种封闭处理技术，他是在样品垫中加入封闭剂(封 闭剂配方是：脱脂奶粉、BSA、PVP、吐温20)，当加入样品时，样品 垫中的封闭剂释放出来，起到封闭效果。这种封闭处理方法确实解决 了胶体金层析试条上NC膜的封闭问题，但是这种方法对于乳胶颗粒 的层析试条来说是不能够封闭NC膜对乳胶颗粒的非特异性吸附问 题，可能是因为乳胶颗粒疏水性比胶体金颗粒疏水性更强、颗粒粒径 更大，从而导致乳胶颗粒经常在NC膜前端出现“死金”现象，因此沿 用胶体金封闭处理方法并不理想。需要找到更合适的封闭试剂组份及 方法来解决这个问题。同时目前还未报道过试条长期存储后的封闭剂 保护问题，因为封闭剂具有生物活性，容易失活；因此需要添加一些 蛋白质保护剂，从而达到试条性能的长期保存。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种能够降低试条背景的免 疫层析试条用封闭剂组合物以及一种背景较低的免疫层析试条。

为了解决现有技术问题，本发明提供了一种免疫层析试条用封闭 剂组合物，包括：

蛋白、蛋白保护剂、表面活性剂和第一缓冲溶液；

其中，所述蛋白为酪蛋白、酪蛋白处理液、甲基化牛血清白蛋白、 人血清白蛋白；所述蛋白保护剂为糖类。

优选的，所述表面活性剂为聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、聚 氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯辛基苯基醚或聚氧乙烯月桂酸 醚。

优选的，所述第一缓冲溶液为磷酸缓冲溶液、氨基丁三醇-盐酸缓 冲液、硼酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、巴比妥钠缓 冲液、丙二酸-氢氧化钠缓冲液、顺丁烯酸-氢氧化钠缓冲液，丁二酸- 氢氧化钠缓冲液，4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，3-(N-吗啉基)丙磺酸 缓冲液，2-吗啉乙磺酸缓冲液。

优选的，所述酪蛋白处理液包括：酪蛋白和第二缓冲溶液混合后 的溶液经高压灭菌后得到的处理液。

优选的，所述第二缓冲溶液为有机酸缓冲液。

优选的，所述糖类为：蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、甘油、 麦芽糖。

优选的，所述蛋白、蛋白保护剂、表面活性剂在所述缓冲溶液中 的质量浓度比为：(0.01～5)∶(0.1～20)∶(0.05～5)。

优选的，所述缓冲溶液的离子浓度为0.01-1mol/L、pH值为4～9。

本发明还提供了一种免疫层析试条，包括：塑料板；设置在所述 塑料板上的吸水垫；设置在所述吸水垫上的硝酸纤维素膜；设置在所 述硝酸纤维素膜上的样品垫；

其中，所述样品垫包括：蛋白、蛋白保护剂、表面活性剂和缓冲 溶液；其中，所述蛋白为酪蛋白处理液、甲基化牛血清白蛋白、人血 清白蛋白，所述蛋白保护剂为糖类。

优选的，所述酪蛋白处理液包括：酪蛋白和缓冲溶液混合后的溶 液经高压灭菌后得到的处理液。

本发明提供了一种免疫层析试条用封闭剂组合物，包括：蛋白、 蛋白保护剂、表面活性剂和第一缓冲溶液；其中，所述蛋白为酪蛋白、 酪蛋白处理液、甲基化牛血清白蛋白、人血清白蛋白；所述蛋白保护 剂为糖类。本发明提供的封闭剂组合物中使用了酪蛋白、酪蛋白处理 液、甲基化牛血清白蛋白、人血清白蛋白，这些蛋白具有很好的憎水 性，相对于现有技术，能够在溶胶中更好的使用，在乳液中不会随溶 液的流动而使蛋白溶于水中，牢固的固定在NC膜上，降低了由于使 用环境而造成的背景升高。另外，本发明提供的组合物中，还包括蛋 白保护剂，使组合物中的蛋白能够保持更长久的使用，提高了组合物 的使用寿命。

本发明提供了一种免疫层析试条，包括：塑料板；设置在所述塑 料板上的吸水垫；设置在所述吸水垫上的硝酸纤维素膜；设置在所述 硝酸纤维素膜上的样品垫；其中，所述样品垫包括：蛋白、蛋白保护 剂、表面活性剂和缓冲溶液；其中，所述蛋白为酪蛋白处理液、甲基 化牛血清白蛋白、人血清白蛋白，所述蛋白保护剂为糖类。相比较现 有技术，本发明提供的免疫层析试条样品垫中含有封闭剂，所述封闭 剂包括蛋白、蛋白保护剂、表面活性剂和缓冲溶液；所述蛋白为酪蛋 白处理液、甲基化牛血清白蛋白、人血清白蛋白，所述蛋白保护剂为 糖类，使试条中反应位点不变化，封闭效果好，背景低，使用寿命长。

附图说明

图1、本发明提供的免疫层析试条结构示意图。

具体实施方式

为了进一步了解本发明，下面结合实施例对本发明的优选实施方 案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特 征和优点而不是对本发明专利要求的限制。

本发明提供了一种免疫层析试条用封闭剂组合物，包括：包括： 蛋白、蛋白保护剂、表面活性剂和第一缓冲溶液；其中，所述蛋白为 酪蛋白、酪蛋白处理液、甲基化牛血清白蛋白、人血清白蛋白；所述 蛋白保护剂为糖类。

相比较现有技术，本发明提供的蛋白为疏水性较好的蛋白，在乳 液中能够牢固的在试条位点上起到封闭作用，不会随着水的流动而发 生位点位置变化或位点增多，所述蛋白选用酪蛋白、酪蛋白处理液、 甲基化牛血清白蛋白，人血清白蛋白，优选为酪蛋白或酪蛋白处理液， 最优选为酪蛋白处理液。所述酪蛋白处理液的制备方法为，将酪蛋白 与pH为6～7的0.1mol/L的第二缓冲溶液混合，溶解，然后经高压灭 菌处理得到酪蛋白处理液。按照本发明，所述蛋白在第一缓冲溶液中 的质量浓度优选为0.01％-5％，更优选为0.04％-1％，最优选为0.2％。 所述第二缓冲溶液优选为甘氨酸-盐酸缓冲溶液，pH值优选为6.5。

按照本发明，为了使蛋白具有更长的使用寿命，使所述组合物在 长时间放置后依然具有很好的封闭效果，以及较低背景，本发明提供 的组合物中增加了蛋白保护剂，所述蛋白保护剂为糖类，优选为蔗糖、 海藻糖、甘露醇、山梨醇、甘油、麦芽糖。更优选为蔗糖、海藻糖、 山梨醇。最优选为蔗糖。按照本发明，所述蛋白保护剂在第一缓冲溶 液中的质量浓度优选为0.1％-20％，更优选为0.5％-10％，最优选为5％。 糖类都是多羟基化合物，高浓度糖可以与蛋白质、酶类等物质在高温 干燥过程形成玻璃态，从而使蛋白质活性得以保护。

按照本发明，所述组合物中还包括增加蛋白与乳液混合的表面活 性剂和调节封闭剂组合物pH值的第一缓冲溶液。按照本发明，所述 表面活性剂优选为非离子型表面活性剂，优选为聚氧乙烯失水山梨醇 单月桂酸酯(Tween20)、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(Tween80)、 聚氧乙烯辛基苯基醚(Triton x 100)或聚氧乙烯月桂酸醚(Brij 35)。 更优选为聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯或聚氧乙烯辛基苯基醚，最 优选为聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯。在第一缓冲溶液中的质量浓 度优选为0.05％-5％，更优选为0.1％-2％，最优选为0.5％

所述第一缓冲溶液优选为磷酸缓冲溶液、氨基丁三醇-盐酸缓冲 液、硼酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、巴比妥钠缓冲 液、丙二酸-氢氧化钠缓冲液、顺丁烯酸-氢氧化钠缓冲液，丁二酸-氢 氧化钠缓冲液，4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，3-(N-吗啉基)丙磺酸缓 冲液，2-吗啉乙磺酸缓冲液。更优选为磷酸缓冲液，巴比妥钠缓冲液， 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，最优选择磷酸缓冲液。所述第一缓冲溶 液的pH值在4-9之间，优选为5-8之间，最优选为6.5，离子强度为 0.005-1mol/L，优选为0.05-0.5mol/L，最优为0.1mol/L，

按照本发明，将所述蛋白与蛋白保护剂混合，将表面活性剂混合 在第一缓冲溶液中，然后将蛋白与蛋白保护剂均匀混合在第一缓冲溶 液中，得到封闭剂组合物。

本发明提供的封闭剂组合物能够在试条样品垫中使用，也可以与 乳胶颗粒混合使用，用于降低免疫层析的背景。

按照本发明，将封闭剂加入样品垫中，然后将NC膜贴到塑料板 上，然后到喷膜机上划线，喷膜后NC膜过夜干燥，第二天组装试条， 试条按照样品垫、NC膜、吸水纸的顺序黏贴到塑料板上，最后到斩 切机上把试条切成试条。

本发明还提供了一种免疫层析试条，包括：塑料板；设置在所述 塑料板上的吸水垫；设置在所述吸水垫上的硝酸纤维素膜；设置在所 述硝酸纤维素膜上的样品垫；其中，所述样品垫包括：蛋白、蛋白保 护剂、表面活性剂和缓冲溶液；其中，所述蛋白为酪蛋白处理液、甲 基化牛血清白蛋白、人血清白蛋白，所述蛋白保护剂为糖类。

按照本发明，如图1所示，所述免疫层析试条包括：样品垫2、 硝酸纤维素膜3、吸水垫4、塑料板5，将样品溶液1加入试条上，5～10 分钟后得到结果，T和C线均显色为阴性、C显色而T不显色呈阳性。

以下为具体实施例：

1、蛋白质封闭效果的比较

颗粒标记：实验首先对荧光乳胶颗粒经过EDC与NHS活性，然 后颗粒与抗人血清白蛋白的单克隆抗体反应，经离心、洗脱后，把标 记有抗体的颗粒悬浮在以下5种不同的蛋白质封闭液中：1、空白组， 2、0.5％明胶的封闭液；3、0.5％B SA的封闭液；4、0.5％酪蛋白的封 闭液；5、0.5％脱脂奶粉的封闭液；6、酪蛋白处理液；7、1％甲基化 牛血清白蛋白。

酪蛋白处理液的配制方法：首先配制pH值＝6.5的0.1mol/l的甘 氨酸-盐酸缓冲液，然后把酪蛋白溶解在该缓冲液中，最后经高压灭菌 处理得到酪蛋白处理液。

试条制作：先将NC膜贴到塑料板上，然后到喷膜机上划线，喷 膜后NC膜过夜干燥，第二天组装试条，试条按照样品垫、NC膜、吸 水纸的顺序黏贴到塑料板上，最后到斩切机上把试条切成4mm宽的 试条。

试条检测：试条分为7组，每组又分成2份，一份是阴性样本(本 检测项目是尿微量白蛋白，cutoff值是20mg/l，阴性样本的白蛋白浓 度是5mg/l.)；另一份是阳性样本(即白蛋白浓度为25mg/l).每组40 根试条，阳性样本20根，阴性样本20根。试条检测时，先将储存在 不同蛋白质封闭液中的颗粒溶液与阳性或者阴性样本按照10∶1的比 例混合，即最终颗粒固含浓度为0.05％。然后加入到样品垫中，每根 试条溶液加入量为80ul。实验测试结果如下：

  蛋白质封闭剂类型   阳性   阴性   阳性符合率(％)   阴性符合率(％)   空白   0   7   0   35   明胶   0   6   0   30   BSA   8   9   40   45   酪蛋白   16   16   80   80   脱脂奶粉   16   15   80   75   酪蛋白处理液   17   17   85   85   甲基化牛血清白蛋白   17   16   85   80

2、蛋白质保护剂的比较

蛋白质保护剂一般采用糖类、甘油等多元醇类进行保护，所以实 验设计如下：首先将乳胶颗粒活化，然后对颗粒标记单克隆抗体，将 标记单克隆抗体的颗粒悬浮到以下几种溶液中：1、空白组；2、加入 1％蔗糖组；3、加入1％海藻糖组；4、加入甘油组；5、加入1％甘露 醇组；6、加入1％麦芽糖组；以上溶液中都加入了酪蛋白封闭剂，然 后在37℃的烘箱内老化20天，老化20天后与标记有单克隆抗体的乳 胶颗粒混合。

试条检测：试条分为6组，每组又分成2份，一份是阴性样本(本 检测项目是尿微量白蛋白，cutoff值是20mg/l，阴性样本的白蛋白浓 度是5mg/l.)；一份是阳性样本(即白蛋白浓度为25mg/l).每组40根 试条，阳性样本20根，阴性样本20根。试条检测时，先将储存在不 同蛋白质封闭液中的颗粒溶液与阳性或者阴性样本按照10∶1的比例 混合，即最终颗粒固含浓度为0.05％。然后加入到样品垫中，每根试 条溶液加入量为80ul。实验测试结果如下：

  蛋白质保护剂类型   阳性   阴性   阳性符合率(％)   阴性符合率(％)   空白组   0   3   0   15   蔗糖组   14   15   70   75   海藻糖组   15   16   75   80   甘油组   10   12   50   60   甘露醇组   13   14   65   70   麦芽糖组   9   13   45   65

3、表面活性剂的比较

在上述酪蛋白、海藻糖封闭液中加入不同的表面活性剂进行对 比，加入表面活性主要是使样品垫润湿均匀，同时也保证乳胶颗粒在 NC膜上流动的一致性。实验设计如下：首先也是将乳胶颗粒活化， 然后对颗粒标记单克隆抗体，将标记单克隆抗体的颗粒悬浮到以下几 种溶液中：1、空白组；2、加入0.5％Tween 20组；3、加入0.5％Tween 80组；4、加入0.5％triton x-100组；5、加入0.5％Brij 35组；以上溶 液中都加入了酪蛋白、海藻糖封闭剂，然后与标记有单克隆抗体的乳 胶颗粒混合。

试条检测：试条分为5组，每组又分成2份，一份是阴性样本； 另份是阳性样本每组40根试条，阳性样本20根，阴性样本20根。试 条检测时，先将储存在不同蛋白质封闭液中的颗粒溶液与阳性或者阴 性样本按照10∶1的比例混合，即最终颗粒固含浓度为0.05％。然后加 入到样品垫中，每根试条溶液加入量为80ul。实验测试结果如下：

  表面活性剂类型   阳性   阴性   阳性符合率(％)   阴性符合率(％)   空白组   16   16   80   80   Tween 20组   18   19   90   95   Tween 80组   15   14   75   70   Triton x-100组   17   18   85   90   Brij 35组   17   17   85   85

4、缓冲体系的比较

通过对蛋白质封闭剂、糖类以及表面活性的比较，封闭液的组份 中需要加入酪蛋白，海藻糖以及Tween 20，但是这些封闭液也需要在 一定的缓冲液中才能够更加稳定。因此针对检测人体尿微量白蛋白项 目，实验选择了如下几种缓冲溶液进行了对比研究，缓冲液如下：1、 空白组(水)；2、加入磷酸缓冲液组；3、加入柠檬酸缓冲液组；4、 加入甘氨酸-盐酸缓冲液组；5、加入tris-盐酸缓冲液组；以上溶液中 都加入了0.5％酪蛋白、1％海藻糖、0.5％Tween 20封闭液组份，然后 与标记有单克隆抗体的乳胶颗粒混合。试条检测方法与上面测试方法 一致，实验测试结果如下：

  缓冲液类型   阳性   阴性   阳性符合率(％)   阴性符合率(％)   空白组   18   19   90   95   磷酸缓冲液组   20   20   100   100   柠檬酸缓冲液组   18   19   90   95   甘氨酸-盐酸缓冲液组   19   18   95   90   tris-盐酸缓冲液组   17   19   85   95

以上对本发明提供的一种免疫层析试条用封闭剂组合物以及一 种免疫层析试条进行了详细的介绍，本文中应用了具体个例对本发明 的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解 本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本技术领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干 改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。