一株草木樨中华根瘤菌及应用其发酵产锰过氧化物酶的方法

摘要

一株草木樨中华根瘤菌及其应用，属于微生物发酵技术领域。草木樨中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）J09，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2011318。应用该菌株通过液体发酵生产锰过氧化物酶，步骤为（1）斜面培养；（2）种子培养；（3）液体发酵培养：将培养好的种子接入发酵培养基中，接种量为1%~2%，在32~36℃培养96~136h，摇床转速150rpm。本发明的优点在于：CCTCC NO：M2011318具有产锰过氧化物酶的能力，还具有较高的生物固氮活性。利用该菌液体发酵产锰过氧化物酶具有生产周期短，生产成本低，易于控制生长条件等诸多优点，具有工业化生产的潜力。同时，高效的生物固氮活性也说明该菌株具有培肥土壤，促进农作物高产的能力。

说明书

技术领域

一株草木樨中华根瘤菌及应用其发酵产锰过氧化物酶的方法，具体的说是一种草木樨中华根瘤菌株，以及利用该菌株发酵生产锰过氧化物酶的方法以及在生物固氮方面的潜在应用。本发明属于微生物发酵技术领域。

背景技术

锰过氧化物酶(MnP)最早是从黄孢原毛平革菌中分离纯化出的。它能氧化木质素等各类芳香化合物，随着人们对MnP的培养与分离纯化、结构与功能、理化性质等方面研究的深入，其具有极高工业应用潜力也得到了不断的开发，如在有机污染物的降解、染料的脱色、纸浆的生物漂白、农业废弃物的处理、褐煤的生物降解方面都有着重要应用。

目前，能够产生锰过氧化物酶的基本为真菌，尤其是白腐真菌，如黄孢原毛平革菌( Phanerochaete chrysosporium)，变色栓菌（Trametes versicolor），香菇（Lentinus edodes），平菇（Pleurotus pstreatus）、虎皮香菇（Panus tigrinus）、污叉丝孔菌（Dichomitus squalens），虫拟蜡菌（Ceriporiopsis subvermispora），射脉菌（Phlebia radiata）等。

细菌来源广泛、生长快速，适应能力强，易于改造及大规模应用，同时也更容易采用固定细胞技术以利于锰过氧化物酶的应用。但是关于能够产锰过氧化物酶细菌的研究报道目前还十分的少，更没有关于草木樨中华根瘤菌在这方面的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有产锰过氧化物酶的草木樨中华根瘤菌菌株，以及利用该菌株液体发酵产锰过氧化物酶的方法和在生物固氮方面的应用。

本发明的技术方案：一株产锰过氧化物酶并具有生物固氮活性的菌株，命名为草木樨中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti） J09，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2011318。

用所述的草木樨中华根瘤菌CCTCC NO：M 2011318发酵产锰过氧化物酶的方法，通过以下步骤实现：

（1）斜面培养：将草木樨中华根瘤菌CCTCC NO：M 2011318接种于斜面培养基上，在33℃下培养24小时；

（2）种子培养：将斜面长好的菌种接入种子培养基中，在33℃培养30小时，摇床转速150转/分钟；

（3）液体发酵培养：将培养好的种子接入发酵培养基中，接种量为体积百分比1%~2%，在32~36℃培养72~96小时，摇床转速150转/分钟；

发酵培养基组成，单位为克/升：乳糖15~30，蛋白胨5~20，七水硫酸镁0.025，硫酸锰0.015，以水定容至1L，pH 7.0~8.0，121℃灭菌30 min。

草木樨中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）CCTCC NO：M 2011318筛选、分离与鉴定详见实施例1。

上述技术方案中所述的斜面培养基为（单位为g/L）：氯化钠5，酵母膏5，蛋白胨10，琼脂20，pH 7.0，115℃灭菌20分钟。

上述技术方案中所述的种子培养基为（单位为g/L）：氯化钠5，酵母膏5，蛋白胨10，pH 7.0，121℃灭菌30 min。

锰过氧化物酶活力的测定：配制50 mmol/L 的乳酸-乳酸钠缓冲液（pH4.5），1.6 mmol/L的硫酸锰溶液，1.6 mmol/L的双氧水溶液，当天使用。取50 mmol/L的乳酸-乳酸钠缓冲液（pH4.5）3.4 mL，1.6 mmol/L的硫酸锰溶液0.1 mL在37℃水浴锅中保温10min，加适量37℃保温10min酶液（发酵液8000rpm 离心10min获得之清液），混匀，加入1.6 mmol/L的双氧水溶液0.1 mL立即摇匀，开始计时，测定最初3 min内240 nm处吸光度变化。每分钟使1μmol Mn²⁺转化为Mn³⁺所需的酶量为一个活力单位（U）。

 

                                                               其中MnSO₄的ε₂₄₀=8100 L/mol/cm

同时在本发明的过程中，研究发现该菌株具有较高的生物固氮活性，其固氮活性可以达到667nmol h^-1 mL^-1。这说明该菌株在培肥土壤，促进农作物高产方面同样具有潜在的应用价值。

本发明的有益效果：本发明所提供的草木樨中华根瘤菌CCTCC NO：M 2011318不仅具有产锰过氧化物酶的能力，而且还具有较高的生物固氮活性。利用该菌液体发酵产锰过氧化物酶具有生产周期短，生产成本低，易于控制生长条件等诸多优点，完全具有工业化生产的潜力。同时，高效的生物固氮活性也说明该菌株完全具有培肥土壤，促进农作物高产的能力。

生物材料样品保藏：一株产锰过氧化物酶并具有生物固氮活性的菌株，命名为草木樨中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti） J09，已在中国典型培养物保藏中心保藏，简称CCTCC，保藏日期2011年9月18日，保藏编号为CCTCC NO：M 2011318。

具体实施方式

在下面所述的所有具体实施例中，如无特殊说明，均为本领域常用方法。

实施例1

草木樨中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）CCTCC NO：M 2011318筛选分离与鉴定

一、草木樨中华根瘤菌J09（Sinorhizobium meliloti J09）筛选分离

草木樨中华根瘤菌J09菌株是从从南通市通州区三余镇合兴村木材加工个体经营户取得的木屑中分离得到的。取1克木屑到250毫升灭菌三角瓶中，加入100毫升无菌的含无机盐的pH值为7.0的水溶液中（所含的无机盐及其浓度分别为：K₂HPO₄ 1 g/L；NaH₂PO₄ 1 g/L；(NH₄)₂SO₄ 0.5 g/L；MgSO₄ 0.2 g/L；MnSO₄ 0.02 g/L），在33℃、150转/分钟的条件下培养12小时；取上述培养液，将其稀释成10^-5、10^-6、10^-7倍稀释液，各浓度稀释液取100微升涂布在苯胺蓝平板（酵母膏5 g/L ，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，苯胺蓝(Azure B ) 0.1g/L）上，每个浓度三次重复，33℃培养24-36小时。

产锰过氧化物酶菌株可水解培养基形成透明圈。挑选透明圈较大的单个菌落多次纯化，将纯化后的菌株接种到斜面培养基（酵母膏5 g/L ，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，琼脂20g/L）上，33℃培养24-36小时后放于4℃冰箱保存待用。将4℃冰箱保存待用的菌株接种到发酵培养基中（葡萄糖20g/L，蛋白胨10 g/L，七水硫酸镁0.025 g/L，硫酸锰0.015 g/L，pH 7.0），在33℃，150转/分钟的条件下培养120小时，并检测培养过程中锰过氧化物酶活力的变化，从结果中筛选出一株产锰过氧化物酶活力最高的菌株，定名为J09。

二、草木樨中华根瘤菌J09（Sinorhizobium meliloti J09）鉴定

（1）形态特征

在LB培养基平板上培养菌体成杆状，不产生芽孢，革兰氏阴性，椭圆形，好氧。35℃培养36小时，菌落表面干燥，直径1～2毫米，可扩散生长，微黄色。

（2）16S rDNA测定

利用PCR技术扩增该菌的16S rDNA序列，其寡核苷酸引物为：

5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(上游引物)和

5’-CGGTTACC TTGTTACGACTT-3’(下游引物)。

通过DNA自动测序仪（美国Applied Biosystems 公司，型号ABI 3130）测定扩增的16S rDNA序列，其序列如SEQ ID NO: 1。

将测序结果与GeneBank中已知的16S rDNA序列进行同源性比较，发现与Sinorhizobium meliloti strain KYA71（登入号为EU603721）的同源性最高，为99%。

（3）生理生化特征

根据《Bergey’s manual of systematic bacteriology》(第二版，第二卷)（George M. Garrity, Don J. Brenner, Noel R. Krieg, James T. Staley，springer，2004）和参考文献(Polyphasic taxonomy of rhizobia:emendation of the genus sinorhizobium and description of sinorhizobium meliloti comb.nov., sinorhizobium saheli sp.nov., and sinorhizobium teranga sp.nov.. International journal of systematic bacteriology, 1994, 44: 715-733)对菌株J09进行生理生化鉴定（如下表），其生理生化特征与草木樨中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）相吻合。

 

特征J09特征J09细胞直径＞1.0μm-碳源利用： D-来苏糖+有芽孢-D-塔格糖+pH8生长+D-海藻糖+革兰氏染色-L-山梨糖+鞭毛数量1碳源利用：甲基-D-木糖苷+酵母膏-甘露醇上产酸+甲基-D-葡糖糖苷+接触酶+赤藓醇+V-P测定-卫矛醇+在豆科植物上生瘤+木糖醇+耐0.1%亮甲苯蓝-L-阿拉伯糖醇+苯丙氨酸脱氨酶+2-酮葡糖酸+明胶水解-DL-3-氨基丁酸+淀粉水解-乙酸盐-氨基酸利用： L-缬氨酸-丙酸盐-L-丝氨酸-异丁酸盐+L-苏氨酸+羟乙酸盐-L-天冬氨酸+DL-羟基丁酸盐-L-赖氨酸+乌头酸盐-L-瓜氨酸-p-羟苯酸盐-丙氨酸+胡芦巴碱+

根据菌体革兰氏染色、菌落形态观察、生理生化测试及16S rDNA序列的比对结果，该菌株与草木樨中华根瘤菌相吻合，因此将其鉴定为草木樨中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）。

实施例2草木樨中华根瘤菌CCTCC NO：M 2011318发酵产锰过氧化物酶

（1）斜面培养：将草木樨中华根瘤菌CCTCC NO：M 2011318接种于斜面培养基上，在33℃下培养24小时。所用斜面培养基为（单位为克/升）：氯化钠5，酵母膏5，蛋白胨10，琼脂20，pH 7.0，115℃灭菌20分钟。

（2）种子培养：将斜面长好的菌种用接种环取一环接入种子培养基中，在33℃培养30小时，摇床转速150转/分钟。所用种子培养基为（单位为克/升）：氯化钠5，酵母膏5，蛋白胨10，pH 7.0；每250毫升三角瓶装30毫升种子培养基，121℃灭菌30 分钟。

（3）液体发酵培养：所用发酵培养基为（单位为克/升）：乳糖 15，蛋白胨5，七水硫酸镁0.025，硫酸锰0.015，pH7.0，121℃灭菌30 min。将培养好的种子接入500毫升三角瓶中，其中发酵培养基为50毫升，接种量为0.5毫升，摇床转速150转/分钟，在32℃培养96小时。培养结束，发酵液的锰过氧化物酶酶活为503U/升。

实施例3草木樨中华根瘤菌CCTCC NO：M 2011318发酵产锰过氧化物酶

将培养好的种子接入500毫升三角瓶中，其中发酵培养基为50毫升，接种量为1毫升，在36℃培养72小时，摇床转速150转/分钟。所用发酵培养基为（单位为克/升）：乳糖 30，蛋白胨20，七水硫酸镁0.025，硫酸锰0.015，pH8.0，121℃灭菌30 min。其他条件同实施例2，培养结束，发酵液的锰过氧化物酶酶活为522U/升。

实施例4草木樨中华根瘤菌CCTCC NO：M 2011318发酵产锰过氧化物酶

将培养好的种子接入500毫升三角瓶中，其中发酵培养基为50毫升，接种量为0.75毫升，在33℃培养82小时，摇床转速150转/分钟。所用发酵培养基为（单位为克/升）：乳糖 20，蛋白胨10，七水硫酸镁0.025，硫酸锰0.015，pH7.8，121℃灭菌30 min。其他条件同实施例2，培养结束，发酵液的锰过氧化物酶酶活为582U/升。

实施例5草木樨中华根瘤菌CCTCC NO：M 2011318发酵产锰过氧化物酶

将培养好的种子接入500毫升三角瓶中，其中发酵培养基为50毫升，接种量为0.75毫升，在35℃培养80小时，摇床转速150转/分钟。所用发酵培养基为（单位为克/升）：乳糖 18，蛋白胨12，七水硫酸镁0.025，硫酸锰0.015，pH7.5，121℃灭菌30 min。其他条件同实施例2，培养结束，发酵液的锰过氧化物酶酶活为551U/升。

实施例6草木樨中华根瘤菌CCTCC NO：M 2011318发酵产锰过氧化物酶

将培养好的种子接入500毫升三角瓶中，其中发酵培养基为50毫升，接种量为1毫升，在36℃培养96小时，摇床转速150转/分钟。所用发酵培养基为（单位为克/升）：乳糖 20，蛋白胨10，七水硫酸镁0.025，硫酸锰0.015，pH7.2，121℃灭菌30 min。其他条件同实施例2，培养结束，发酵液的锰过氧化物酶酶活为509U/毫升。

实施例7草木樨中华根瘤菌CCTCC NO：M 2011318发酵产锰过氧化物酶

将培养好的种子接入500毫升三角瓶中，其中发酵培养基为50毫升，接种量为0.5毫升，在32℃培养72小时，摇床转速150转/分钟。所用发酵培养基为（单位为克/升）：乳糖 20，蛋白胨10，七水硫酸镁0.025，硫酸锰0.015，pH7.8，121℃灭菌30 min。其他条件同实施例2，培养结束，发酵液的锰过氧化物酶酶活为567U/升。

实施例 8草木樨中华根瘤菌CCTCC NO：M 2011318 生物固氮活性的测定

将培养好的种子接入盛有10mL半固体培养基的血清小瓶中（每个培养基3个重复），接种量为1毫升，所用发酵培养基为（单位为克/升）：苹果酸5，磷酸氢二钾0.5,七水硫酸镁0.2，氯化钠0.1，二水合氯化钙0.02，二水合钼酸钠0.002，溴百里酚蓝5ml，氢氧化钾4.5，维生素0.00001，琼脂2，pH7.5，121℃灭菌30 min。30℃下培养箱中培养48h，将血清小瓶盖在无菌条件下换成橡胶塞，用无菌注射器抽出10%的气体，然后给每瓶注入10%乙炔，再置培养箱中培养48h，从瓶中抽取混合气体0.2mL注入气相色谱仪（GC-14B，Shimadzu，Japan）中，用乙炔还原法测定C₂H₄的生成量，结果表明该菌纯培养条件下的固氮活性为667nmol h^-1 mL^-1。

以上已详细描述了本发明的实施方案，对本领域技术人员来说很显然可以做很多改进和变化而不会背离本发明的基本精神。所有这些变化和改进都在本发明的保护范围之内。

序列表

 

<210>  SEQ ID NO: 1

<211>  1383

<212>  DNA

<213>  草木樨中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti） J09

 

<400>1     

tcgagcgccc cgcaagggga agcggcagac gggtgagtaa cgcgtgggaa tctacccttt    60

tctacggaat aacgcaggga aacttgtgct aataccgtat acgcccttcg ggggaaagat   120

ttatcgggaa aggatgagcc cgcgttggat tagctagttg gtggggtaaa ggcctaccaa   180

ggcgacgatc catagctggt ctgagaggat gatcagccac attgggactg agacacggcc   240

caaactccta cgggaggcag cagtggggaa tattggacaa tgggcgcaag cctgatccag   300

ccatgccgcg tgagtgatga aggccctagg gttgtaaagc tctttcaccg gtgaagataa   360

tgacggtaac cggagaagaa gccccggcta acttcgtgcc agcagccgcg gtaatacgaa   420

gggggctagc gttgttcgga attactgggc gtaaagcgca cgtaggcgga catttaagtc   480

aggggtgaaa tcccggggct caaccccgga actgcctttg atactgggtg tctagagtat   540

ggaagaggtg agtggaattc cgagtgtaga ggtgaaattc gtagatattc ggaggaacac   600

cagtggcgaa ggcggctcac tggtccatta ctgacgctga ggtgcgaaag cgtggggagc   660

aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgaatgttag ccgtcgggca   720

gtttactgtt cggtggcgca gctaacgcat taaacattcc gcctggggag tacggtcgca   780

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tcgaagcaac gcgcagaacc ttaccagccc ttgacatccc gatcgcggat tacggagacg   900

ttttccttca gttcggctgg atcggagaca ggtgctgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc   960

gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctc gcccttagtt gccagcattt  1020

agttgggcac tctaagggga ctgccggtga taagccgaga ggaaggtggg gatgacgtca  1080

agtcctcatg gcccttacgg gctgggctac acacgtgcta caatggtggt gacagtgggc  1140

agcgagaccg cgaggtcgag ctaatctcca aaagccatct cagttcggat tgcactctgc  1200

aactcgagtg catgaagttg gaatcgctag taatcgcaga tcagcatgct gcggtgaata  1260

cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg agttggttct acccgaaggt  1320

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taa                                                                                      1383