具有血管紧张素转化酶C-端选择性抑制活性的三肽及其应用和组合物

摘要

本发明提供了一种具有血管紧张素转化酶C-端选择性抑制活性的三肽，其氨基酸序列为LKP，LAR，MAA，LSK，TQY，TKI，IAA或IKH。本发明还提供了含有至少一种本发明所述的三肽作为活性成分的组合物和本发明所述的三肽在制备用于降低血管紧张素转化酶活性的药物或功能食品中的应用。本发明提供的三肽在体外对ACE活性的抑制率很高，IC50在2-200μmmol/L之间，最佳IC50值为2.13μmmol/L。

说明书

技术领域

本发明涉及三肽及其应用，更具体涉及具有血管紧张素转化酶抑制活性 的三肽及其应用，功能食品和药物组合物。

背景技术

高血压是威胁人类健康的重大疾病，成年人群发病率为10％。近年来， 随着我国人民生活水平的提高，高血压的发病率也呈现出上升趋势。但是， 由于化学药物的副作用，病人服药依从性较差，高血压控制达标率很低。医 疗条件较好的美国大概仅有30％，而我国则小于5％(Clinical Cardio 2007 30：183-7)。天然来源的降压肽具有安全性高，毒副作用小等特点，适合高血 压患者长期服用。ACE是肾素-血管紧张素系统中的一个重要调节因子，在 血压的调节方面起着重要的调节作用(M.Azizi，G.Chatellier，T.T.Guyene，D. Murieta-Geoffroy and J.Menard，Additive effects of combined  angiotensin-converting enzyme inhibition and angiotensin II antagonism on  blood pressure and renin release in sodium-depleted normotensives，Circulation  92(1995)，pp.825-834.D.Chauveau，T.T.Guyenne，F.Cumin，G.Chatellier， P.Corvol and J.Menard，Investigation of the biochemical effects of renin  inhibition in normal volunteers treated by an ACE inhibitor，BrJ Clin Pharmacol 33(1992)，pp.253-260)。ACE抑制剂通过抑制ACE活性来实现降压的目的。 近期的研究发现，ACE分子中含有两个独立的活性位点，分别称为N-或C- 端位点，生物功能也有所不同(V.Dive，J.Cotton，A.Yiotakis，A.Michaud，S. Vassiliou，J.Jiracek，G.Vazeux，M.-T.Chauvet，P.Cuniasse and P.Corvol，RXP 407，a phosphinic peptide，is a potent inhibitor of angiotensin I converting  enzyme able to differentiate between its two active sites.Proc.Natl.Acad.Sci. USA 96(1999)，pp.4330-4335；J.Cotton，M.A.F.Hayashi，P.Cuniasse，G. Vazeux，D.Ianzer，A.C.M.De Camargo and V.Dive，Selective inhibition of the  C-domain of angiotensin I converting enzyme by bradykinin potentiating  peptides.Biochemistry 41(2002)，pp.6065-6071)。目前报道的ACE抑制肽大 都没有区分C-端与N-端选择性。

发明内容

本发明的目的是提供具有血管紧张素转化酶C-端选择性抑制活性的三 肽，该三肽具有较高的血管紧张素转化酶C-端选择性抑制活性。

本发明的发明人通过筛选大量食源三肽，发现源自乳蛋白的某些未报道 具有ACE抑制活性的三肽能够有效地抑制ACE活性，由此完成了本发明。

本发明提供的具有血管紧张素转化酶C-端选择性抑制活性的三肽的氨 基酸序列为LKP，LAR，MAA，LSK，TQY，TKI，IAA或IKH。

本发明还提供了一种组合物，该组合物含有至少一种本发明所述的三肽 作为活性成分。

本发明还提供了本发明所述的三肽在制备用于降低血管紧张素转化酶 活性的疾病的功能食品和药物中的应用。

优选地，所述药物或功能食品用于缓解或治疗高血压。

本发明提供的三肽在体外对ACE活性的抑制率很高，IC50在 2-200μmol/L之间。实测例最佳IC₅₀为2.13μmmol/L。

具体实施方式

本发明提供的具有血管紧张素转化酶抑制活性的三肽的氨基酸序列为 LKP，LAR，MAA，LSK，TQY，TKI，IAA或IKH。

下表1给出了上述氨基酸序列中的氨基酸简写符号所代表的氨基酸的名 称。

表1

名称   单字母符号 名称   单字母符号 丙氨酸(alanine)   A 亮氨酸(leucine)   L 精氨酸(arginine)   R 赖氨酸(lysine)   K 天冬酰胺(asparagine)   N 甲硫氨酸(methionine)   M 天冬氨酸(aspartic acid)   D 苯丙氨酸(phenylalanine)   F 半胱氨酸(cysteine)   C 脯氨酸(proline)   P 谷氨酰胺(glutanine)   Q 丝胺酸(serine)   S 谷氨酸(glutamic acid)   E 苏氨酸(threonine)   T 甘氨酸(Glicine)   G 色氨酸(tryptophan)   W 组氨酸(histidine)   H 酪氨酸(tyrosine)   Y 异亮氨酸(isoleucine)   I 颉氨酸(valine)   V

本发明提供的三肽的氨基酸序列为LKP，LAR，MAA，LSK，TQY， TKI，IAA或IKH。这些三肽对ACE活性的抑制率较高。

本发明提供的三肽的制备方法包括但不限于：通过对乳源蛋白进行水 解，从水解产物中分离出所述多肽；或者，采用化学合成法。化学合成法在 小分子多肽的合成方面具有独特的优势，可以在短时间内快速合成高纯度的 单一序列，因此优选采用化学合成法。

化学合成法可以为tBoc固相合成法或Fmoc固相合成法，优选Fmoc固 相合成法。本发明可以利用Merrifield B.Solid phase synthesis[J].Science， 1986，232(4748)：341～347.中详细描述的Fmoc固相合成法的原理、步骤和操 作条件。

本发明还提供的组合物含有至少一种本发明所述的三肽作为活性成分。

所述组合物可以为药物，该药物含有作为活性成分的多肽和药学可接受 的佐剂。该药物可以为常规的各种剂型，例如普通片剂或糖包衣片剂、丸剂、 锭剂、胶囊剂、滴剂、颗粒剂、可注射制剂、软膏剂、乳膏或凝胶剂。可以 根据所要配制的剂型，选择合适的佐剂的种类。可以根据三肽的有效量来设 定其在药品中的含量。三肽的有效量根据服用者的年龄和身体状况而不同， 优选的范围为0.001-10mg/千克体重·天。本发明的三肽可以使用其中的任意 一种或多种的混合物，当使用多种的混合物时，上述有效量的范围是指多种 三肽的总量。一般地，三肽的含量可以为药物总量的0.001-1重量％，优选 为0.01-1重量％。

所述组合物可以为功能食品组合物，该功能食品组合物含有作为活性成 分的多肽和食物。加入到食品中的三肽的量可以为0.001-1重量％，优选为 0.01-1重量％。本发明的三肽可以使用其中的任意一种或多种的混合物，当 使用多种的混合物时，上述范围是指多种三肽的总量。

所述食物可以是任意类型的食物，例如果汁制品、乳制品、肉制品等。 所述功能食品组合物中还可以含有常规的添加剂，例如香料、矿物质、维生 素、稳定剂、增稠剂、防腐剂等。

由于本发明提供的三肽对ACE的活性具有良好的抑制效果，因此本发 明所述的三肽能够制备用于降低血管紧张素转化酶活性的药物或功能食品。 所述药物或功能食品可以用于缓解或治疗各种与血管紧张素转化酶活性有 关的疾病，优选为高血压。所述三肽通过抑制血管紧张素转化酶的C-端活性 中心而使血管紧张素转化酶的活性降低。

以下通过实施例来更详细地描述本发明。

实施例中所用到的材料和仪器：

马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL，分析纯)，美国Sigma公司；血管紧张 素转化酶(ACE，生物级)，美国Sigma公司；试验用带保护基的氨基酸药 品(纯度＞99％)、缩合试剂HOBT和DIC购自吉尔生化(上海)有限公司； 乙腈(色谱纯)和甲醇(色谱纯)购自Fisher Scientific公司；其他试剂无特 殊说明均为国产分析纯。

岛津CBM-20Alite液相色谱仪，Agilent 1100series LC/MSD Trap液相色 谱-质谱联用仪；TGL-16C台式离心机，上海安亭科学仪器厂；

实施例1

该实施例用于说明本发明的三肽的制备过程。

(1)Fmoc固相合成过程

参照Merrifield B.Solid phase synthesis [J].Science，1986， 232(4748)：341～347.中详细描述的Fmoc固相合成法的原理、步骤和操作条件， 依次合成LKP，LAR，MAA，LSK，TQY，TKI，IAA，IKH。

(2)三肽的纯化

采用半制备型反相高效液相色谱(Reversed phase High performance  Liquid Chromatography，RP-HPLC)在以下条件下纯化步骤(1)中合成的 三肽。用岛津(LC-10A)液相色谱仪，采用BECKMAN C18制备柱，流动 相A：0.1％三氟乙酸(TFA)/超纯水；流动相B：0.1％TFA/乙腈。梯度程序： 5％-50％B 30min，流速5mL/min，上样量3mL，采用230nm波长检测流出 峰并收集，真空冷冻干燥得到纯品。

(3)三肽的鉴定

采用Agilent 1100series LC/MSD Trap液相色谱-质谱联用仪对纯化后的 三肽进行鉴定，确认步骤(2)得到的纯品为目标产物。

对比例1

该对比例用于制备源自α-S₁酪蛋白和β-乳球蛋白的其它一些三肽。

按照与实施例1相同的方法制备源自α-S₁酪蛋白和β-乳球蛋白的其它一 些三肽RVY，IKQ，IHA，GLP，ISS，YKV，FKI，FYQ，YLG，RTP，RYL，VFG。

实施例2

该实施例用于测定实施例1制得的三肽的ACE抑制活性(IC₅₀)。

参照Patriacia等在2004年建立的C-端选择性ACE抑制活性的测定方法 (Patracia A.，Maria C.C.，Dulce E.，et al.Positional-Scanning Combinatorial  Libraries of Fluorescence Resonance Energy Transfer Peptides for Defining  Substrate  Specificity of the Angiotensin I-Converting Enzyme and  Development of Selective C-Domain Subtrates.Biochemistry，2004， 43：15729～15736)。取50μL C-端选择性底物Abz-LFK溶液，加入20μL 20mmol/L的三肽混合均匀，在37℃恒温水浴中保温10min。然后加入10μL ACE酶液，在37℃恒温水浴中反应30min，再加入150μL 1mol/L的HCl终 止反应，得到反应液。采用HPLC系统对结果进行分析。同时用20μL 0.1mol/L 的磷酸盐缓冲液代替三肽作为对照组。C-Domain抑制活性计算公式如下：

式中，M为对照组中FK的峰面积(mAU·s)，N为添加的三肽抑制剂组 中FK的峰面积(mAU·s)。

每个三肽序列，分别测定8个的不同浓度下(0.0001，0.001，0.01，0.1， 1，10，100，1000uM)的抑制活性，作出三肽浓度与C-Domain ACE抑制 活性之间的曲线图，计算IC₅₀值。

测定结果如表2所示。

对比例2

该对比例用于测定对比例1制得的三肽的C-Domain ACE抑制活性。

按照与实施例2相同的方法进行测定，结果如表2所示。

表2

从表2所示的结果可以看出，本发明提供的三肽对ACE的C-domain选 择性抑制活性很高，IC₅₀为2-200μmmol/L，最佳IC₅₀为2.13μmmol/L。