一种鸭新致病型呼肠孤病毒及其弱毒疫苗

摘要

本发明公开了鸭新致病型呼肠孤病毒（Novel-pathotypeDuckReovirus,NDRV），其微生物保藏号：CGMCCNO.5198。将该病毒致弱后制备的弱毒疫苗株遗传性稳定、安全性好，对雏番鸭安全、无致病力。以本发明弱毒疫苗免疫的雏番鸭能有效抵抗鸭新致病型呼肠孤病毒强毒株的攻击。

说明书

技术领域

本发明涉及一种病毒的致弱及弱毒疫苗株，尤其涉及一种鸭新致病型呼肠孤病毒及其弱毒疫苗的研制，属于兽医生物制品技术领域。

背景技术

自2005 年冬季以来，福建、浙江等省4-25日龄雏番鸭、雏半番鸭、麻鸭发生一种以肝脏不规则坏死、出血和心肌、腔上囊出血为主要特征的新疫病，俗称“鸭新肝病”、“鸭坏死性肝炎”等，发病率5 %-32.5 %，病死率差异较大，为4 %-20 %，但鸭日龄愈小，发病率、病死率愈高。我们通过病原学研究，经病毒分离与鉴定，确定其病原为不同于国内外报道的鸭新致病型呼肠孤病毒（Novel-pathotype Duck Reovirus, NDRV）（黄瑜等.新致病型鸭呼肠孤病毒的分离鉴定.中国兽医杂志，2009，45（12）：29-31.）。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鸭新致病型呼肠孤病毒及其弱毒疫苗，该弱毒疫苗遗传稳定、安全性好，对鸭新致病型呼肠孤病毒具有良好的免疫保护作用。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现：

本发明提供的病毒为鸭新致病型呼肠孤病毒（Novel-pathotype Duck Reovirus, NDRV），毒株为LH13，于2011年9月6日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号：CGMCC NO. 5198。

将上述病毒在鸡胚成纤维细胞系上连续传代28-30次获得致弱毒株，病毒滴度为1×10^6-6.25 TCID₅₀/0.1ml，加入冻干保护剂冻干后制成弱毒疫苗，病毒效价应在5×10^5.5 TCID50/0.1ml以上。

所述的弱毒疫苗在防制雏番鸭新致病型呼肠孤病毒病中的应用。

鸭新致病型呼肠孤病毒弱毒疫苗的制备方法具体如下：

（1）鸭新致病型呼肠孤病毒的致弱：分离病毒经鸡胚成纤维细胞系进行连续传代致弱。观察病毒对细胞的致病性，并取不同代次的传代毒测定其TCID₅₀。将病毒滴度为1×10^6-6.25 TCID₅₀/0.1ml的弱毒株作为疫苗用种毒。

（2）鸭新致病型呼肠孤病毒疫苗的制备：将疫苗用种毒接种鸡胚成纤维细胞进行大量繁殖，测定毒价后将明胶等冻干保护剂与病毒培养物混匀并分装，制备成疫苗。

毒力测定试验结果表明本发明弱毒疫苗对雏番鸭安全、无致病力。

本发明的显著优点：

本发明所涉及的新致病型呼肠孤病毒弱毒株，是有强毒型的新致病型呼肠孤病毒（Novel-pathotype Duck Reovirus, NDRV）通过鸡胚成纤维细胞连续传代后获得的弱毒株，该弱毒株特有的重要生物活性是已丧失对其原宿主动物雏番鸭的致病性，以该致弱的病毒株研制的弱毒疫苗免疫雏番鸭后能有效抵抗当前流行的鸭新致病型呼肠孤病毒强毒的攻击，且遗传稳定性良好。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列应用实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

1、病毒的分离培养与致弱

无菌采集送检的临床病死11日龄雏番鸭的肝脏，用含双抗（其中青、链霉素各100u/ml）的无菌PBS，按肝脏与无菌PBS=1:3-5的比例（W/V）进行匀浆后，离心取0.5ml上清液接种已培养成单层的非洲绿猴肾细胞（Vero细胞，ATCC：CCL-81），37℃吸附60min后，用含双抗的无菌PBS清洗3次，加入含10%胎血清（Gibco公司）的高糖DMEM培养液（Gibco公司），置37℃、5% CO₂温箱培养观察48-72h。初代培养未引起明显细胞病变，72h后将细胞反复冻融3次，回收含毒细胞液，按照上述方法继续接种Vero细胞并连续传代培养4代后，病毒培养物可引起明显细胞病变，细胞可见堆集、融合，并出现明显拉网、脱落，收集培养48-72h的病毒液得到鸭新致病型呼肠孤病毒LH13株，保藏号为CGMCC NO. 5198。

取分离获得的鸭新致病型呼肠孤病毒LH13株，按5%的接种量接种75ml²单层鸡胚成纤维细胞，感作45min，用无菌PBS清洗2次后，加入15ml含2%胎牛血清及1%双抗的高糖DMEM培养基于5%CO₂，37℃温箱培养观察。待75％的细胞出现病变时，将细胞反复冻融3次，回收含毒细胞液，将一部分传代毒冻存，另一部分作为下一代的种毒，如此反复传代。

取第15、20、24、28和30代的传代毒接种鸡胚成纤维细胞，观察不同代次的传代毒的病毒滴度及产生细胞病变的时间。测定结果表明，第15代的传代毒的病毒效价为10^-4.75，随后的传代毒病毒滴度逐步增加，第28-30代传代毒的病毒效价基本稳定在1x10^-6.25 TCID₅₀左右；不同代次的传代毒引起细胞病变的时间也随着传代次数的增加而缩短，第15代时接种病毒后120h左右出现圆缩、脱落或拉丝等细胞病变，到28代时，接种病毒后72h左右即可见明显的细胞病变，不同代次的传代毒在鸡胚成纤维细胞上的病毒滴度及致细胞病变时间见表1。

取第30代的传代毒作种毒，接种鸡胚成纤维细胞批量培养病毒，收获的病毒经无菌检验及外源病毒检测后，按1.5%的比例加入明胶混匀分装无菌冻干瓶，每瓶2.5 ml，-20℃冻存过夜后用真空冻干机冻干22h，制成弱毒疫苗，病毒效价应在5×10^5.5 TCID₅₀/0.1ml以上。

表1不同代次传代毒对DF1细胞的致病性

2、最佳免疫剂量及攻毒保护试验

雏番鸭为该病毒的易感动物，将50羽1日龄的健康雏番鸭随机分为5组，每组10羽。其中4个组分别免疫以灭菌生理盐水5、10、100和1000倍稀释的弱毒疫苗，每只雏番鸭均经颈部皮下接种0.1mL，第5组注射生理盐水作为对照组。在免疫后第14d以鸭新致病型呼肠孤强毒肌注，每羽0.1ml（10^3.5 TCID₅₀）。观察20d后，10倍稀释（5×10^4.5 TCID₅₀）的剂量免疫组鸭均健康，100倍稀释（5×10^3.5 TCID₅₀）的剂量免疫组鸭1只发病，到后期逐渐恢复健康，保护率为90%以上，即为最小免疫剂量。攻毒保护实验详细数据见表2。

表2 最佳免疫剂量及攻毒保护试验

3、疫苗安全试验

以最小免疫剂量的100倍，肌肉或颈部皮下接种10只1日龄试验雏番鸭，观察接种雏番鸭的反应，观察期15 d。结果1日龄雏番鸭免疫疫苗后无发病和死亡，剖检未见肉眼可见的大体病变。

4、保存期试验　

取保存于-20℃条件下6、12、15、18、24和28个月的弱毒疫苗，按确定的最佳免疫剂量免疫1日龄雏番鸭，同时设定不免疫对照组，14日龄攻毒。结果显示-20℃保存6、12、15个月后的疫苗均能完全保护雏番鸭抵抗同源强毒的攻击；保存18个月后的疫苗保护率仅为80%，保存24、28个月的疫苗保护率分别为60%、20%。可见，该疫苗最长有效保存期为18个月。

5、毒力返强测定　

将弱毒疫苗接种非免疫1日龄雏番鸭，3d后剖杀取肝、脾等组织在无菌条件下按组织与PBS=1:3（W/V）的比例匀浆、反复冻融3次后，4℃下离心取上清液在雏番鸭体内连续盲传5代，观察雏番鸭对疫苗活病毒的反应，结果被接种雏番鸭生长发育均良好，未见毒力返强现象，表明该弱毒株遗传性稳定。