动物Torque Teno病毒环介导等温扩增技术快速检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明设涉及动物疫病分子生物学检测方法及检测试剂领域，具体涉及一种动物TorqueTeno病毒环介导等温扩增技术快速检测用引物、试剂盒及其检测方法。本发明根据动物TorqueTeno病毒的两种不同血清型基因序列，用ClustalW进行多重比对，分析序列的保守区，采用LAMP引物设计软件，分别设计内引物和外引物，均可特异性的实现快速对TTV1和TTV2血清型的检测与鉴别。本发明公开了一种快速、灵敏度高、特异性强、操作简便、设备要求低、省时省力并且易于观察结果的环介导等温扩增技术对TorqueTeno病毒进行检测的方法，没有复杂的后处理，适用性广。

说明书

技术领域

本发明涉及动物TTV试剂盒，属于动物疫病分子生物学检测方法及检测试剂领域，具体是一种用于动物TTV病毒的环介导等温扩增技术（LAMP）检测试剂盒。本发明还应用所述的试剂盒对动物TTV病毒进行等温扩增检测的生物学检测方法。

背景技术

TTV（ Torque Teno virus）病毒是一种无囊膜的单链环状球形DNA病毒，现归类为圆环病毒科（Circoviridae）指环病毒属（Anellovirus），包括两种不同的血清型，即TTV1和TTV2。该病毒最早是1997 年由日本学者Nishizawa等从1例输血后非甲～非庚型肝炎病人血清中分离到的新型肝炎病毒，而以该病人的姓名缩写(TT)而命名。又因TTV与输血传播病毒（transfusion transmitted virus,TTV）巧合，因此许多学者亦将其称为输血传播病毒。我国于1998年6月，由中国军事医学科学院首次分离出中国株TTV。同年，湖南医科大学附二院传染科学者克隆出TTV部分基因序列。TTV在各类人群中感染比例都非常高, 研究报道，在亚洲、非洲和南美洲的正常献血者中感染率为30 %～100 %。除了人可感染TTV以外, 现已经证实TTV感染宿主很广, 包括灵长类动物(黑猩猩、类人猿和猴)、家畜( 猪、牛、羊、犬、猫、鸡)和其它动物(老鼠、树鼩和骆驼)。目前，还没有证实TTV可以引发某种具体的疾病，但许多学者认为TTV可能与人类肝炎和猪多系统衰竭综合征（PWMS）、猪繁殖与呼吸综合征（PRRSV）等疾病病原存在协同作用。有相关的研究显示：TTV在猪繁殖和呼吸系统综合征、结核、人类肝炎等疾病中阳性检出率相当高。因此，TTV在动物群中传播对人类的生活和健康存在一定的潜在威胁。同时猪肉等肉制食品在人们的日常食用中非常普遍，携带该病毒的肉制品对人的健康存在威胁，因而对该病毒的检测在出入境和食品安全检验中起着重要的作用。

TTV在猪群中的感染呈世界性分布。全世界范围内的感染分布很广泛，但不同国家的感染率却有较大的差异，感染率分布在24%～100%之间。同时，相同国家的不同城市不同猪场TTV的感染率也有很大差异。例如：对我国广东等7省的258份猪血样的检测结果表明：TTV感染率在24.1%～100%之间。相关研究还表明：TTV的不同血清型可发生混合感染。目前的流行病学研究表明TTV在人群中主要经血液及其血液制品传播。研究发现，唾液、粪便、胆汁、精液、乳汁、活组织甚至毛发、皮肤中均能检测到该病毒。且较多文献报道，TTV除经血液途径传播外，还可经母婴途径、性交途径、粪-口途径传播，飞沫及经胃肠道传播。同时，相关的研究也表明，TTV还可通过胎盘和子宫垂直传播。TTV在猪中的传播方式可能有以下几种：①通过口粪途径传播；②注射了被TTV污染的疫苗或者是注射是的交叉感染；③垂直感染。

由于该病毒首先在人群中发现，因此，现有的研究主要针对人的TTV较多。主要的检测方法有普通PCR法、巢式PCR法、荧光定量PCR法、原位杂交、酶联免疫吸附法等。如1997年，日本学者Nishizawa等（1997）根据 N22基因序列首次建立巢式PCR（nested  PCR）用于检测TTV。何忠平等（2003）运用Mullins等在HIV基因变异分型中建立的异源双链泳动分析法（HMA）快速检测TTV基因型。Catherine等（2000）建立了检测TTV的免疫印迹法，随后国内学者（邢培清，2002）以TTV ORF2蛋白为抗原，建立了检测TTV的酶联免疫吸附试验（ELISA）。 血清PCR检测虽为主要检测手段，但其扩增受实验条件、费用高、假阳性率高等因素的限制，不宜广泛推广；而血清学试验仅能反应是否感染，并不能检测病毒含量和分型检测。因此，发明一种可以同时鉴别检测动物Torque Teno virus两种不同血清型的检测方法对研究我国猪群中动物Torque Teno virus感染情况具有重要意义。国内外在病原体的检测方法，利用LAMP方法对多种动物疫病和微生物检测已有很多报告，但在兽医临床诊断方法，尚未见有动物Torque Teno 病毒的LAMP诊断方法。

环介导等温扩增基因技术（loop-mediated isothermal amplication ,简称LAMP）（国际专利公开号 WO 00/28082）是2000年Notomi等开发出的一种核酸扩增新技术，针对待测靶基因序列的6个区域设计一套两对特异引物，利用链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在65℃左右等温条件下能够特异性、高效、快速的进行核酸扩增，扩增结果可直接对扩增副产物焦磷酸镁沉淀通过肉眼进行判断或检测其浊度，也可用结合双链的荧光染料优选SYBR Green I染色，即可通过肉眼判定。由于LAMP技术扩增的两对引物是针对靶基因的6个区段，因而具有比PCR更高的特异性，同时是等温条件下即不需要PCR仪等特殊仪器，且样品的前处理非常简单、单位时间内扩增效率更高等优点，已引起人们的关注。

中国发明专利（申请号为：200710030435.0、200710030437.X、200710132320.2、200710026389.7、200810052321.0、200810015001.8、200810093986.6、200910041358.8、200910251055.9、200910090037.7、201010555073.9、201110339104.X等）分别公开了采用环介导等温扩增基因技术检测病菌和动物疫病的方法。但是，目前尚无利用环介导等温扩增基因技术检测动物Torque Teno virus的试剂盒及检测方法的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于同步进行动物TTV的TTV1和TTV2两种不同血清型的检测和鉴别诊断的LAMP检测试剂盒及检测方法。

在本发明的LAMP扩增引物的设计上，遵循环介导等温扩增技术的引物设计要求，设计针对动物TTV1和TTV2的特异性引物，且保证在等温扩增的条件下均能获得较好的扩增，且可同时鉴别两种不同的血清型。因此，本发明采用的技术方案是，即一种动物Torque Teno病毒LAMP检测试剂盒，包括LAMP扩增反应液I管、LAMP扩增反应液Ⅱ管、Calcein显色剂管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管。其中：

所述 LAMP扩增反应液I 管 管内由以下反应液组成：

序列为SEQ ID NO1的60mmol/L的TTV1内引物上游1.0 μL；

序列为SEQ ID NO2的60mmol/L的TTV1内引物下游1.0 μL；

序列为SEQ ID NO3的5 mmol/L的TTV1外引物上游1.0 μL；

序列为SEQ ID NO4的5 mmol/L的TTV1外引物下游1.0 μL；

10×LAMP buffer 缓冲液 12.5μL；

5U/μL Bst DNA 聚合酶 0.8μL；

灭菌去离子水 3.7μL；

合计21 μL，为单次反应的用量。

所述LAMP 扩增反应液Ⅱ管 管内由以下反应液组成：

序列为SEQ ID NO5的60mmol/L的TTV2内引物上游1.0 μL；

序列为SEQ ID NO6的60mmol/L的TTV2内引物下游1.0 μL；

序列为SEQ ID NO7的5 mmol/L的TTV2外引物上游1.0 μL；

序列为SEQ ID NO8 的5 mmol/L的TTV2外引物下游1.0 μL；

10×LAMP buffer缓冲液 12.5μL；

5U/μL Bst DNA 聚合酶 0.8μL；

灭菌去离子水 3.7μL；

合计21 μL，为单次反应的用量。

所述阳性对照管 管内为TTV1和TTV2阳性重组质粒，比例为1:1，体积为20μL；

TTV1阳性重组质粒pMD19-T-G的DNA序列为SEQ ID NO9；

TTV2阳性重组质粒pMD19-T-S的DNA序列为SEQ ID NO10。

所述阴性对照管 管内为猪Torque Teno病毒阴性的猪血清，体积约50μL。

所述Calcein显色剂管 管内体积约20μL。

所述灭菌去离子水管 1mL～2mL。

动物Torque Teno病毒环介导等温扩增技术快速检测方法，包括如下步骤；

（1）样品中核酸模板的提取：取200μL～300μL或200mg～300mg待检样品，可选用相应的市售商品化核酸提取试剂盒或实验室常规使用的提取病毒核酸的方法提取样品中的DNA，即为核酸模板。

（2）LAMP反应体系：取3μL核酸模板或阳性对照或阴性对照，分别加入LAMP扩增反应液I或LAMP 扩增反应液Ⅱ 21μL，Calcein显色剂1 μL，反应体系的总体积为25μL。

（3）LAMP扩增条件：将步骤（2）配制好的反应体系的PCR管于65℃恒温反应60min，80℃终止反应。

（4）结果判定：通过LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪进行实时观察：阳性扩增在30min内可见明显的实时扩增曲线和浊度扩增曲线，阴性无任何扩增；或者，反应产物显现绿色则为阳性，橙色则为阴性；或者，通过肉眼观察鉴定，与阴性对照管比较显示，检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性。

本发明的优点是：1、本发明可以快速地对待检样品是否感染猪TTV进行鉴定和鉴别，具有较高的灵敏度。在引物设计上，选择TTV1 (AY823990.1)和TTV2(AY823991.1)已知核酸序列，并通过文献检索、多重对比等方法对收集到的核酸序列进行了筛选。通过反复试验，排除了有非特异性扩增的引物，最后选定SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4引物，SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7和SEQ ID NO8引物分别作为TTV1和TTV2的鉴定引物。并通过优化LAMP反应条件等，可高灵敏度地对猪TTV1和TTV2进行鉴定。

2、本发明提供的扩增试剂均经试验反复验证和优化，具有市场上同类LAMP等温扩增检测试剂盒相应优点。具有：（1）、不需要特殊试剂与设备；（2）、高特异性：应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，阳性率可达于99.9%，假阳性率小于0.1%；（3）、快速、高效扩增：检测时间2小时左右；（4）、灵敏度高：扩增模板仅需100.0pg/mL或更少，血清样本中DNA最低检测极限达到50.0pg/mL；标本的检出率达到99%；（5）、鉴定简便：无需电泳等其他任何分析步骤，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物----焦磷酸镁乳白沉淀，与Calcein显色剂结合，阳性结果显示为绿色，阴性结果为橙色，结果明显可靠，可通过肉眼观察鉴定；（6）、用途广：可广泛用于动物TTV的安全快速检测。

3、特异性好：本发明对圆环病毒属其它病毒DNA无扩增，假阳性率低。

4、灵敏度高：本发明对猪血清样本中TTV1和TTV2检测的最低检测量分别约为50.0pg/mL和60.0pg/mL。

附图说明

图1猪TTV1 LAMP扩增特异性试验结果；

图2猪TTV1 LAMP扩增灵敏性试验结果；

图3阴阳性对照LAMP扩增结果；

图中：A-实时扩增浊度曲线，B-实时扩增速率曲线，C-扩增柱型分析图；D-猪TTV1阳性,E-猪TTV2阳性,F-阴性对照；

图 1中：1-猪TTV1病毒DNA，2-猪TTV2病毒DNA，3-猪细小病毒（CPV），4-猪圆环病毒II型（PCV-II），5-猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP），6-猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)，7-猪繁殖与呼吸综合征病毒VR-2332株，8-阴性对照；

图2中：1-0.5×10^-1ug/mLTTV1 DNA，2-0.5×10^-2ug/mLTTV1 DNA，3-0.5×10^-3ug/mLTTV1 DNA，4-0.5×10^-4ug/mLTTV1 DNA，5-0.5×10^-5ug/mLTTV1 DNA，6-0.5×10^-6ug/mLTTV1 DNA，7、0.5×10^-7ug/mLTTV1 DNA，8-阴性对照。

具体实施方式

下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明技术的应用不限于实施例。

实施列1、动物Torque Teno病毒环介导等温扩增技术快速检测试剂盒包括LAMP扩增反应液I管、LAMP扩增反应液Ⅱ管、Calcein显色剂管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中：

LAMP扩增反应液I 管 管内由以下反应液组成：序列为SEQ ID NO1的60 mmol/L的TTV1内引物上游1.0 μL；序列为SEQ ID NO2的60 mmol/L的TTV1内引物下游1.0 μL；序列为SEQ ID NO3的5 mmol/L的TTV1外引物上游1.0 μL；序列为SEQ ID NO4的5 mmol/L的TTV1外引物下游1.0 μL；10×LAMP buffer 缓冲液 12.5μL；5U/μL Bst DNA 聚合酶 0.8μL；灭菌去离子水 3.7μL；合计21 μL，为单次反应的用量。

LAMP 扩增反应液Ⅱ管 管内由以下反应液组成：序列为SEQ ID NO5的60 mmol/L的TTV2内引物上游1.0 μL；序列为SEQ ID NO6的60 mmol/L的TTV2内引物下游1.0 μL；序列为SEQ ID NO7的5 mmol/L的TTV2外引物上游1.0 μL；序列为SEQ ID NO8 的5 mmol/L的TTV2外引物下游1.0 μL；10×LAMP buffer缓冲液 12.5μL；5U/μL Bst DNA 聚合酶 0.8μL；灭菌去离子水 3.7μL；合计21 μL，为单次反应的用量。

其中10×LAMP buffer缓冲液由以下成分组成：40mmol/L三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐；20 mmol/L氯化钾；20 mmol/L硫酸胺；体积百分比浓度为1% Tritonx-100；0.8mol/L Betaine；7.5mmol/L 氯化镁；1.2mmol/L dNTP。上述浓度为溶液终浓度。

阳性对照管 管内为猪TTV1和猪TTV2阳性重组质粒，比例为1:1，体积为20μL；猪TTV1阳性重组质粒pMD19-T-G的DNA序列为SEQ ID NO9；猪TTV2阳性重组质粒pMD19-T-S的DNA序列为SEQ ID NO10。

阴性对照管 管内为猪Torque Teno病毒阴性的猪血清，体积约50μL。

所述Calcein显色剂管 管内体积约20μL。

所述灭菌去离子水管 1mL～2mL。

实施例2、本发明引物的设计及筛选

根据已知的TTV1 (AY823990.1)和TTV2(AY823991.1)核酸序列的基因组全长序列，利用应用ClustW 软件进行多重比对，用LAMP引物设计软件Primer Explorer V4.0软件设计特异性引物，分别标记为：SEQ ID NO1……SEQ ID NO8。所有引物均由宝生物工程(大连)有限公司合成。用市售病毒核酸提取试剂盒提取TTV病毒DNA，扩增，排除有非特异性扩增的引物。获得引物如下：

                                                 

实施例3、阳性对照品的制备

采用市售商品化核酸提取试剂盒提取阳性猪TTV1和TTV2的病毒DNA，分别进行PCR扩增，扩增长度分别为TTV1 449 bp，TTV2 468 bp。回收扩增的目的条带，将其与pMD19-T载体进行连接反应，4℃连接过夜，将连接产物转化至JM109感受态细胞，抗性筛选、摇菌、PCR鉴定阳性者，提取重组质粒，测序验证，获得含目的片段的克隆，将两种血清型的病毒阳性质粒等比例混合，分装每支50μL, 浓度控制在80～100ng/μL。

实施例4、阴性对照品的制备

采用市售商品化核酸提取试剂盒分别提取不含有猪TTV1和TTV2的阴性血清的DNA。用灭菌去离子水稀释，将浓度控制在80～100ng/μL，分装为每支50μL。

实施例5、制备待检样品的核酸模板

取200μL～300μL或200 mg～300mg待检样品，采用市售商品化核酸提取试剂盒提取样品中的基因组DNA，即为核酸模板。

实施例6、扩增体系的建立和优化

以标准阳性毒株DNA为模板，在非严谨的条件下进行扩增，优化扩增反应的温度，在优化后的温度条件下，优化反应体系中的引物浓度、10×LAMP buffer 缓冲液和Bst DNA 聚合酶等。优化的LAMP 扩增反应液I中包含：10×LAMP buffer 缓冲液 12.5μL，5U/μL Bst DNA聚合酶 0.8μL，60 mmol/L的引物SEQ ID NO1、 SEQ ID NO2各1μL、5 mmol/L 的引物SEQ ID NO3、SEQ ID NO4各1 μL ，灭菌去离子水 3.7mL；LAMP 扩增反应液Ⅱ中包含：10×LAMP buffer 缓冲液 12.5μL，5U/μL Bst DNA 聚合酶 0.8μL， 60 mmol/L的引物SEQ ID NO5、 SEQ ID NO6各1μL、5 mmol/L 的引物SEQ ID NO7、SEQ ID NO8各1 μL ，灭菌去离子水 3.7 mL；在优化的等温条件下，可实现对TTV1和TTV2两种血清型的鉴定。优化的LAMP扩增条件是：65℃恒温反应60min，80℃终止反应。

实施例7、特异性和灵敏度

采用上述优化的体系和扩增条件，对标准阳性猪TTV1、猪TTV2、猪细小病毒（CPV）、猪圆环病毒II型（PCV-II）、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP），猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)，猪繁殖与呼吸综合征病毒VR-2332株，猪TTV抗体阴性血清等核酸提取物进行扩增，均无非特异性扩增条带。

用灭菌去离子水梯度稀释阳性质粒DNA，用上述优化的体系和扩增条件扩增，本发明的最低检测限分别约为10.5 pg/μL和9.75 pg/μL。

参见图2可以得到反应灵敏度结果。

实施例8、试剂的制备

LAMP 扩增反应液 I：10×LAMP buffer 缓冲液 12.5μL，5U/μL Bst DNA 聚合酶 0.8μL， 60 mmol/L的引物SEQ ID NO1、 SEQ ID NO2各1μL、5 mmol/L 的引物SEQ ID NO3、SEQ ID NO4各1 μL，灭菌去离子水3.7μL，共21μL，每个试剂盒提供足做48个反应的量共21×48=1008μL。

LAMP 扩增反应液Ⅱ中包含：10×LAMP buffer 缓冲液 12.5μL，5U/μL Bst DNA 聚合酶 0.8μL，60 mmol/L的引物SEQ ID NO5、 SEQ ID NO6各1μL、5 mmol/L 的引物SEQ ID NO7、SEQ ID NO8各1 μL ，灭菌去离子水 3.7 Ml，共21μL，每个试剂盒提供足做48个反应的量共21×48=1008μL。

实施例9、试剂盒的组装

如上所配制的阳性对照管、阴性对照管各1支，LAMP 扩增反应液I管 和LAMP 扩增反应液Ⅱ管各1支，灭菌去离子水管2支，贴上生产日期及产品标签。低温保存及运输。

实施列10、动物Torque Teno病毒环介导等温扩增技术快速检测方法，包括如下步骤；

（1）样品中核酸模板的提取：取200μL～300μL或200 mg～300mg待检样品，可选用相应的市售商品化核酸提取试剂盒或实验室常规使用的提取病毒核酸的方法提取样品中的DNA，即为核酸模板。

（2）LAMP反应体系：取3μL核酸模板或阳性对照或阴性对照，分别加入LAMP扩增反应液I或LAMP 扩增反应液Ⅱ 21μL，Calcein显色剂1 μL，反应体系的总体积为25μL。

（3）LAMP扩增条件：将步骤（2）配制好的反应体系的PCR管于65℃恒温反应60min，80℃终止反应。

（4）结果判定：通过LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪进行实时观察：阳性扩增在30min内可见明显的实时扩增曲线和浊度扩增曲线，阴性无任何扩增；或者，反应产物显现绿色则为阳性，橙色则为阴性；或者，通过肉眼观察鉴定，与阴性对照管比较显示，检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性。

参见图1可以明显得出1号有TVV病毒扩增，图3可以明显得出D和E分别有含有TVV1和TVV2病毒出现浑浊。

<110>  重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>  动物Torque Teno病毒环介导等温扩增技术快速检测试剂盒及检测方法

<160>  10   

<210>  1

<211>  17

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400> SEQ ID NO1

cccgcaagct gggttac                                                      17

<210>  2

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  SEQ ID NO2

ccccatgctc ggccatag                                                     18

<210>  3

<211>  36

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  SEQ ID NO3

acacgggatg tcccgcaccg cactaactcc ctgcca                                36

<210>  4

<211>  37

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  SEQ ID NO4

aactacccgg ctttgcttcg attgcgcccc ctacctg                              37

<210>  5

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  SEQ ID NO5

aaccatgggt agaagggt                                                   18

<210>  6

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  SEQ ID NO6

ttaaaggttg ttgccatgtt                                                  20

<210>  7

<211>  43

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  SEQ ID NO7

tgaccagtgt ccttggtctt ttggggaaat gcattttatt ccg                        43

<210>  8

<211>  45

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  SEQ ID NO8

tattggatct atgacacggg agtcctggat tatcagtaac gtctt                       45

<210>  9

<211>  449

<212>  DNA

<213>  pMD19-Torque Teno virus 1

<400>  SEQ ID NO9

cgtccagtat cacgagtgcc gaaagctcta ctgagggaga tggatcgtct gatgatgaag       60

agacaatcag acgcagaagg aggacctgga agcgactcag acgaatggtc agagagcagc      120

ttgaccgacg aatggaccac aagcgacagc gacttcattg acacccccat aagagaaaga      180

tgcctcaata aaaaacaaaa gaaacgctaa acagtgtccg attactaatg ggggggggtc      240

cggggggggc ttgccccccc gcaagctggg ttaccgcact aactccctgc caagtgaaac      300

tcggggacga gtgagtgcgg gacatcccgt gtaatggcta cataactacc cggctttgct      360

tcgacagtgg ccgtggctcg accctcacac aacactgcag gtagggggcg caattgggat      420

cgttagaaaa ctatggccga gcatggggg                                        449

<210>  10

<211>  468

<212>  DNA

<213>  pMD19-Torque Teno virus 2

<400>  SEQ ID NO10

ggatcaagat ataccatgca ggccactacc ttatcaaaac ctgcatccac tcctaatgct      60

actaaaaaaa cagcacaaaa ttgtactttc acagcaaaac tgtaacccaa acagaaaaca     120

aaaacctgtc acattaaaat tcaaacctcc gccaaaacta acatcacaat ggagactaag     180

tagagaatta gcaaagatgc cactaataag acttggagta agctttatag acctaacaga     240

accatgggta gaagggtggg gaaatgcatt ttattccgtg ctaggatatg aagcagtaaa     300

agaccaagga cactggtaaa actggacaca aataaaatac tattggatct atgacacggg     360

agtaggaaat gcagtatatg ttatactatt aaaaaaagac gttactgata atccaggaaa     420

catggcaaca acctttaaag catcaggagg acagcatcca gatgcaat                  46