不同血清型霍乱弧菌的m-PCR检测试剂盒及检测方法

摘要

不同血清型霍乱弧菌的m-PCR检测试剂盒及检测方法，该试剂盒中包括SEQ IDNOS.1/2、SEQ ID NOS.4/5、SEQ ID NOS.7/8的检测引物和SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.9的探针序列。与经典方法的细菌分离、鉴定和血清学分型试验方法相比，本发明方法更快速、准确。且较一般的多重PCR方法特异性强，灵敏度高，能够同时检测和鉴定O1群霍乱弧菌、O139群霍乱弧菌和非O1/非O139群霍乱弧菌。对此三种菌的检测特异性均为100％，检测灵敏度分别为O1群霍乱弧菌：19CFU/ml、O139群霍乱弧菌：22CFU/ml、非O1/非O139群霍乱弧菌：17CFU/ml。

说明书

技术领域

本发明涉及利用实时荧光PCR技术检测水体和食品样品中O1群霍乱弧菌、O139 群霍乱弧菌和非O1/非O139群霍乱弧菌的试剂盒及方法。尤其涉及检测所使用的特异 性引物和探针序列。

背景技术

对霍乱疫区的外环境水体和食品样品进行霍乱弧菌监测是霍乱防治工作的重要 组成部分，监测结果可对评价外环境水体中霍乱弧菌污染状况、制订霍乱防控策略提 供科学依据，另外，对环境水体和食品样品中的霍乱弧菌的监测可作为霍乱流行的预 警指标。水体和食品样品中的霍乱弧菌检测通常是采用传统的碱性蛋白胨增菌法，国 家卫生部编制的《霍乱防治手册》及GB15984-1995《霍乱诊断标准及处理原则》首选 方法也是此法。但在霍乱的非流行期，霍乱弧菌在外环境水体中自然生存状态下菌量 较少，同时由于外环境水体中存在大量其它杂菌，会对霍乱弧菌的分离鉴定产生干扰； 并且水体中含有大量的有机物，常规法在增菌过程中有机物在微生物的作用下pH值 迅速降低，严重抑制着霍乱弧菌的生长，致使霍乱弧菌不易检出而容易出现假阴性， 造成在疫情监测和调查中产生误差，不适应烈性传染病的监测需要。

因此，有必要研究一种方法，可同时针对不同血清型霍乱弧菌进行快速且大批量 检测。在PCR反应中使用一对以上的引物和不同荧光标记物的探针进行检测的多重实 时PCR技术在同一样品的多种致病菌检测中已经有一定的应用，但现有技术中还未见 有针对霍乱弧菌不同血清型检测的多重实时PCR技术；另外，Taqman MGB探针是在 Taqman探针基础上提出的一种新型分子探针，它的荧光淬灭基团是一种基本无荧光本 底的小沟结合物，降低了本底，可以用较短的探针达到更好地分辨效果，增加了对指 定目标检测的可靠性，可以更好的实现多重实时PCR反应。本发明人旨在建立利用多 重实时PCR技术快速、准确、灵敏检测水体和食品样品中不同血清型霍乱弧菌的检测 方法。

发明内容

本发明的目的在于提供不同血清型霍乱弧菌的m-PCR检测试剂盒及检测方法。

本发明所述的不同血清型霍乱弧菌的m-PCR检测试剂盒中包括如下引物和探针：

①霍乱弧菌的O1群rfb基因的检测引物和探针序列：

正向引物(SEQ ID NO.1)：5′-GCCCGTTTTGCATTATGGAT-3′，

反向引物(SEQ ID NO.2)：5′-CCTTTTACCGCCGCAATACGA-3′，

探针(SEQ ID NO.3)：5′FAM-TGATCCGACAAGCCCAAATGCCACTA(MGB) -3′；

②霍乱弧菌的hlyA基因的检测引物和探针序列：

正向引物(SEQ ID NO.4)：5′-GAGAAATTTGAGCGCAAAGAGGTTT-3′，

反向引物(SEQ ID NO.5)：5′-ACTTCCACCCCACCAGTCA-3′，

探针(SEQ ID NO.6)：5′NED-CCAAGCTCAAAACCTG(MGB)-3′；

③霍乱弧菌的O139群rfb基因的检测引物和探针序列：

正向引物(SEQ ID NO.7)：5′-AGTTACCTGTTATGTACGATGAACC-3′，

反向引物(SEQ ID NO.8)：5′-CCATCACCAGACAAGCATACAG-3′，

探针(SEQ ID NO.9)：5′VIC-TGCTGACGCCTCTCAAGTGCCTACG(MGB)-3′。

所述的试剂盒中还包括其它用于PCR扩增的试剂，这些试剂本领域的普通技术 人员可以根据现有技术选择使用。

本发明另一方面的目的在于提供一种不同血清型霍乱弧菌的m-PCR检测方法， 主要针对食品和水体中存在的霍乱弧菌。所述方法使用上文所述本发明的检测不同血 清型霍乱弧菌的试剂盒，是利用特异性引物和探针进行多重PCR(m-PCR)扩增，并 以扩增结果进行判定的方法。

所述方法包括如下步骤：

①提取待测样品DNA，得到模板DNA溶液；

②反应体系：总体积20ul，包括步骤①制得的模板DNA溶液2μl，2×PCR Taqman GEx酶预混液10μl，霍乱弧菌的O1群rfb基因上下游引物各0.8μL、探针0.4μL，霍 乱弧菌的hlyA基因上下游引物各0.4μL、探针0.2μL，霍乱弧菌的O139群rfb基因上 下游引物各0.4μL、探针0.2μL、灭菌超纯水4.0μl；其中各引物和探针的浓度均为10 μM；

以上各组分加入至0.2mL实时荧光PCR反应管中，混匀，5000r/min，离心10s；

③步骤②的反应体系按下述条件进行实时荧光PCR检测：

95℃/10min，1个循环；95℃/15s，60℃/1min，40个循环；

每次循环的退火时收集荧光，检测结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果。

本发明中所应用的具体的判断标准是：

Ct值≥40，可判断样品结果为阴性，可直接报告未检出相应致病菌；

Ct值≤35.0，可判断该样品结果为阳性；

Ct值＞35.0而＜40，建议重做样本。重做结果Ct值≥40者为阴性，否则为阳性。

与经典方法的细菌分离、鉴定和血清学分型试验方法相比，本发明的方法更快速、 准确。且较一般的多重PCR方法特异性强，灵敏度高，能够同时检测和鉴定O1群霍 乱弧菌、O139群霍乱弧菌和非O1/非O139群霍乱弧菌。对此三种菌的检测特异性均 为100％，检测灵敏度分别为O1群霍乱弧菌：19CFU/ml、O139群霍乱弧菌：22CFU /ml和非O1/非O139群霍乱弧菌：17CFU/ml。

具体实施方式

下面为本发明的具体实施例，它对本发明技术方案的建立及其应用作进一步的说 明，但并不以任何形式限制本发明的内容。

若无特殊说明，本部分试验所用生物样品来自丹东出入境检验检疫局微生物实验 室、沈阳出入境检验检疫局微生物实验室和辽宁出入境检验检疫局微生物实验室的水 产品和外环境水体样品。

DNA提取试剂盒(货号4318930)(美国应用生物系统公司)；

2×PCR Taqman GEx酶预混液(美国应用生物系统公司)；

ABI 7300实时荧光PCR仪(ABI公司，美国)。

实施例1、检测方法的建立

一、引物和探针的设计

根据同源性基因筛查比较结果，选择具有很高特异性的霍乱弧菌的O1群rfb 基因(SEQ ID NO.10)、霍乱弧菌的hlyA基因(SEQ ID NO.11)和霍乱弧菌的 O139群rfb基因(SEQ ID NO.12)为检测扩增的目标基因。据NCBI上已公布的 上述基因的核酸序列，并通过对检测引物和探针的退火温度的一致性以及GC含量的 相似性等因素的综合考虑，设计了如下特异性引物和探针：

①霍乱弧菌的O1群rfb基因的检测引物和探针序列：

正向引物(SEQ ID NO.1)：5′-GCCCGTTTTGCATTATGGAT-3′，

反向引物(SEQ ID NO.2)：5′-CCTTTTACCGCCGCAATACGA-3′，

探针(SEQ ID NO.3)：5′FAM-TGATCCGACAAGCCCAAATGCCACTA(MGB)-3′；

②霍乱弧菌的hlyA基因的检测引物和探针序列：

正向引物(SEQ ID NO.4)：5′-GAGAAATTTGAGCGCAAAGAGGTTT-3′，

反向引物(SEQ ID NO.5)：5′-ACTTCCACCCCACCAGTCA-3′，

探针(SEQ ID NO.6)：5′NED-CCAAGCTCAAAACCTG(MGB)-3′；

③霍乱弧菌的O139群rfb基因的检测引物和探针序列：

正向引物(SEQ ID NO.7)：5′-AGTTACCTGTTATGTACGATGAACC-3′，

反向引物(SEQ ID NO.8)：5′-CCATCACCAGACAAGCATACAG-3′，

探针(SEQ ID NO.9)：5′VIC-TGCTGACGCCTCTCAAGTGCCTACG(MGB)-3′。

二、霍乱弧菌的m-PCR检测方法的建立

1、制备模板DNA样品溶液；

本实施例基因组DNA的抽提采用美国应用生物系统公司生产的DNA提取试剂盒 (货号4318930)并按其操作说明进行抽提样品DNA。

DNA浓度和纯度的测定：取5μL制得的DNA溶液加ddH₂O梯度稀释至1mL， 使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的光密度值。DNA的浓 度按照如下公式计算获得：C＝A×N×50/1000，式中：

C为DNA浓度(μg/μL)；

A为260nm处的吸光值；

N为核酸稀释倍数；

1OD_260nm＝50μg/mL双链DNA；

当OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.7～1.9之间时，适宜于PCR扩增。

2、m-PCR检测

①反应体系：总体积20ul，包括步骤1制得的模板DNA溶液2μl，2×PCR Taqman GEx酶预混液10μl，霍乱弧菌的O1群rfb基因上下游引物各0.8μL、探针0.4μL，霍乱弧 菌的hlyA基因上下游引物各0.4μL、探针0.2μL，霍乱弧菌的O139群rfb基因上下游引 物各0.4μL、探针0.2μL、灭菌超纯水4.0μl；

其中各引物和探针的浓度均为10μM；

②以上各组分加入至0.2mL实时荧光PCR反应管中，混匀，5000r/min，离心10s；

③步骤②的反应体系按下述条件进行实时荧光PCR检测：

95℃/10min，1个循环；95℃/15s，60℃/1min，40个循环；

每次循环的退火时收集荧光，检测结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果，其 中Ct值(cycle threshold)是指每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循 环数；

3、结果判断：

Ct值≥40，可判断样品结果为阴性，可直接报告未检出相应致病菌；

Ct值≤35.0，可判断该样品结果为阳性；

Ct值＞35.0而＜40，建议重做样本。重做结果Ct值≥40者为阴性，否则为阳性。

对于阳性结果，参照ISO/TS 21872-1方法做进一步的生化鉴定和报告。

三、霍乱弧菌的m-PCR检测应用

应用上述三种特异性引物和探针及检测方法检测含有不同血清型霍乱弧菌的 DNA样品，DNA样品包括31株O1群霍乱弧菌、27株非O1/O139群霍乱弧菌和5 株O139群霍乱弧菌，以及其它水体中能分离出的8种常见弧菌(包括拟态弧菌、副 溶血弧菌、溶藻弧菌、麦氏弧菌、河弧菌、创伤弧菌、弗尼斯弧菌、嗜水气单胞菌)。 以对方法的在实际样品检测中的应用进行评估，检测结果如下。

阴性对照结果显示，FAM、NED和VIC通道均无荧光信号检出，说明反应结 果正常，反应体系无污染。阳性对照结果显示，FAM、NED和VIC通道均有荧光信 号检出，反应结果正常。

对霍乱弧菌的O1群rfb基因进行检测结果显示，在Ct值为16左右时，出现荧光 曲线增幅现象，检测结果为阳性。

对霍乱弧菌中hlyA基因进行检测结果显示，在Ct值为28～34之间时，出现荧光 曲线增幅现象，检测结果为阳性。

对霍乱弧菌的O139群rfb基因进行检测结果显示，在Ct值为19左右时，出现荧 光曲线增幅现象，检测结果为阳性。

其他弧菌的rfb基因和hlyA基因检测结果显示，FAM、NED和VIC三通道，均 无荧光信号检出，检测结果均为阴性。

由上述实验结果可见，采用三重实时荧光PCR法时三种目的片段均获得扩增，结 果互不干扰，并且能够与其它弧菌相区别。说明O1群、O139群特异性rfb基因霍乱弧 菌和属特异性的溶血素基因(hlyA)共同检测时特异性高，没有交叉反应和干扰现象。

实施例2、特异性试验

应用实施例1的特异性引物和探针及检测方法检测含有不同血清型霍乱弧菌的 DNA样品。同时检测含有单增李斯特氏菌、麦氏弧菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、嗜 水气单胞菌、拟态弧菌、创伤弧菌、弗尼斯弧菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、普通 变形菌、志贺氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、阪崎肠杆菌等其它致病菌DNA 样品，以对方法的特异性进行评估，检测结果如下。

阴性对照结果显示，FAM、NED和VIC通道均无荧光信号检出，说明反应结 果正常，反应体系无污染。阳性对照结果显示，FAM、NED和VIC通道均有荧光信 号检出，反应结果正常。

对霍乱弧菌的O1群rfb基因进行检测结果显示，在Ct值为16.5左右时，出现荧 光曲线增幅现象，检测结果为阳性。

对霍乱弧菌中hlyA基因进行检测结果显示，在Ct值为18左右时，出现荧光曲线 增幅现象，检测结果为阳性。

对霍乱弧菌的O139群rfb基因进行检测结果显示，在Ct值为17左右时，出现荧 光曲线增幅现象，检测结果为阳性。

其他致病菌的rfb基因和hlyA基因检测结果显示，FAM、NED和VIC三通道， 均无荧光信号检出，检测结果均为阴性。

由上述实验结果可见，本发明具有很好的特异性。

实施例3、灵敏度试验

一、标准菌株纯培养物检测灵敏度

应用实施例1的特异性引物和探针及检测方法，对O1群、非O1/非O139群(O22) 和O 139群霍乱弧菌标准菌株纯培养物进行检测灵敏度的研究。

取上述三种标准菌株于普通肉汤培养基中培养18h左右后，测其OD值，估计其 菌数，然后按十倍递增进行梯度稀释到10^-7，取最后四个稀释液的菌液进行平板计数， 每个稀释度重复3个，按照相应的方法培养后进行菌落计数取平均值确定其真实的菌 密度。同时每个稀释液各取1mL菌液于2mL离心管中并作3管重复，用于提取DNA 并应用本发明方法进行三重实时荧光PCR检测，以确定本发明方法的检测灵敏度。

检测结果：阴性对照检测结果显示，FAM通道、NED通道和VIC通道均无荧光 信号检出，说明反应结果正常，反应体系无污染；阳性对照检测结果显示，FAM通道、 NED通道和VIC通道均有荧光信号检出，反应结果正常；标准菌株纯培养物灵敏度检 测结果显示：O1群霍乱弧菌标准菌株浓度分别为1900CFU/ml、190CFU/ml和19 CFU/ml时均能很好检出；非O1/非O139群霍乱弧菌标准菌株浓度分别为1700CFU /ml、170CFU/ml和17CFU/ml时均能很好检出，O139群霍乱弧菌标准菌株浓度分 别为2200CFU/ml、220CFU/ml和22CFU/ml时均能很好检出。

结果表明该标准方法对标准菌株纯培养物检测灵敏度分别为：O 1群霍乱弧菌：19 CFU/ml、O139群霍乱弧菌：22CFU/ml和非O1/非O139群霍乱弧菌：17CFU/ml。

二、样品中添加O1、非O1/非O139和O139三种血清型霍乱弧菌标准菌株的灵 敏度实验

应用实施例1的特异性引物和探针及检测方法，对样品中添加O1、非O1/非O139 和O139三种血清型霍乱弧菌标准菌株进行检测灵敏度的研究。

选用已经确认霍乱弧菌阴性的样品，分别取10g样品加入100mL增菌液中同时添 加已知不同浓度梯度的上述三种血清型霍乱弧菌，均质后取1mL均质液提取DNA， 用于三重灵敏度试验，确定样品中添加上述三种致病菌的灵敏度。同时提取阴性样品 均质液1mL提DNA用于PCR检测。

检测结果：阴性对照检测结果显示，FAM通道、NED通道和VIC通道均无荧光 信号检出，说明反应结果正常，反应体系无污染；阳性对照检测结果显示，FAM通道、 NED通道和VIC通道均有荧光信号检出，反应结果正常；样品中添加O1、非O1/非 O139和O139三种霍乱弧菌标准菌株灵敏度检测结果显示，O1群霍乱弧菌添加浓度 分别为1900CFU/ml、190CFU/ml和19CFU/ml时均能很好检出，非O1/非O139 群霍乱弧菌菌株添加浓度分别为1700CFU/ml、170CFU/ml和17CFU/ml时均能 很好检出，O139群霍乱弧菌菌株添加浓度分别为2200CFU/ml、220CFU/ml和22 CFU/ml时均能很好检出。

结果表明该标准方法对样品中添加O1、非O1/非O139和O139三种血清型霍乱 弧菌标准菌株检测灵敏度分别为：O1群霍乱弧菌19CFU/ml、非O1/非O139群霍乱 弧菌17CFU/ml和O139群霍乱弧菌22CFU/ml。

实施例4、应用于实际样品检测

应用实施例1的特异性引物和探针及检测方法，以传统的检测方法为对照(SN/T 1022-2010)。实际检测样品包括江瑶贝、海螺肉、冻牛肉及水样等共885份。检测结 果如下表(表1)所示：

表1三重实时荧光PCR对食品样品和水体标本中霍乱弧菌的检测

结果显示，所检测实际样品共885份，其中：

检测食品样品245份，采用m-PCR方法检测O1群霍乱弧菌阳性3份，非O1/非 O139群霍乱弧菌阳性15份，采用传统生化培养方法检测O1群霍乱弧菌阳性3份， 非O1/非O139群霍乱弧菌阳性15份，O139群霍乱弧菌均未检出；

检测水体标本640份，采用m-PCR方法检测O1群霍乱弧菌阳性9份，非O1/非 O139群霍乱弧菌阳性438份，O139群霍乱弧菌2份，采用传统生化培养方法检测O1 群霍乱弧菌阳性9份，非O1/非O139群霍乱弧菌阳性438份，O139群霍乱弧菌2份。

由大量的实际应用结果可见，应用本发明方法检测不同血清型霍乱弧菌具有较好 的应用结果。