β-葡聚糖的测定方法和用于该方法的β-葡聚糖结合性蛋白质

摘要

本发明涉及βG的测定方法，其中，使样品与含有与序列号4、6、8、10、14、16、18或20的任一者所示氨基酸序列同一或实质上同一的氨基酸序列、且对βG具有结合性βG结合性蛋白质1和βG结合性蛋白质2接触，从而形成βG结合性蛋白质1、样品中的βG和βG结合性蛋白质2的复合体，然后测定该复合体的量，然后基于所得的该复合体的量来测定样品中的βG量。本发明还涉及用于该方法的试剂以及试剂盒、新的βG结合性蛋白质和编码该蛋白质的核酸分子、以及该βG结合性蛋白质的制造方法。

说明书

技术领域

本发明涉及使用新的β-葡聚糖结合性蛋白质的β-葡聚糖(以下简写为 “βG”)的新的测定方法和用于该方法的新的β-葡聚糖结合性蛋白质。

背景技术

真菌病包括皮肤中发生的浅部真菌感染和内脏、血液系统、淋巴系统 中发生的深部真菌感染。深部真菌感染是抵抗力弱(免疫缺陷状态)的患者 罹患的一种机会性感染症，会发展成极为严重的病态。作为深部真菌感染 的病原体的代表例，可列举假丝酵母属(Candida)、曲霉属(Aspergillus)， 任一者的细胞壁中都存在βG，所以测定血中βG是有用的。在临床诊断上， 血浆或血清中的β-葡聚糖的测定被用于真菌感染症的早期临床诊断、治疗 效果和康复的判定。

βG是以β-(1→3)键的葡萄糖重复结构为主链、有时具有(1→6)键和/ 或(1→4)键的支链的结构，具有几千～100万左右的高分子量(但是分布广)。 另外，βG与鲎的血细胞提取物(变形细胞，Amebocyte Lysate)中所存在的 G因子α亚基的βG结合结构域结合。

东方鲎属(Tachypleus)鲎的G因子的α亚基结构分析已经完成，其氨 基酸序列和碱基序列在NCBI(美国国家生物技术信息中心，National  Center for Biotechnology Information)数据库公开。另外，东方鲎属鲎的G 因子的α亚基已经成功地通过基因工程学方法表达(专利文献3)。

G因子是丝氨酸蛋白酶前体，通过结合βG而被活化，从而启动G因 子系统的蛋白酶级联。并且被活化的G因子使凝固酶前体被活化，最终生 成凝胶。于是，在医学、药学、微生物学领域开发出利用了鲎血细胞提取 物的该性质的βG检测法。

作为现在主要使用的βG检测法，除了利用了含鲎的血细胞提取物的 溶液与βG之间发生的凝胶化反应的凝胶化倒置法和/或比浊时间分析法之 外，还可列举终点合成底物法、动力学合成底物法等作为其代表方法。

例如，利用比浊时间分析法的βG的测定如下进行。即，将含鲎血细 胞提取物的试剂与含βG的样品混合，对该混合液照射光。接下来，使用 适当的测定仪器(例如，分光光度计、酶标仪等)，测定该混合液的例如透 射率的变化、吸光度的变化、透射光量比Rt的变动、透射光量比Rt的对 数值的变动等光学变化在光照射开始之后达到规定值所需的时间(凝胶化 时间，Tg)。将所得的该时间代入使用浓度已知的βG溶液预先制成的表示 凝胶化时间与βG浓度的关系的标准曲线中，求出样品中的βG浓度。

如上的使用鲎的血细胞提取物的测定方法是能够高灵敏度地测定血中 极微量的βG的方法。但是，这些方法另一方面存在以下问题：(1)因为手 动进行，所以试验者不同测定结果容易出现偏差；(2)为了特异性地测定 血液中的βG，需要使血液中的内毒素失活和/或使检查剂对内毒素脱敏化； (3)为了使血液中所含的对鲎级联反应的妨碍因子失活，需要对样本进行 前处理；(4)测定时间长(约90分钟)、(5)因为使用鲎的血细胞提取物、即 天然原材料(天然品)，所以担心资源枯竭；(6)因为使用鲎的血细胞提取物、 即天然原材料，所以使品质稳定化需要花费成本；等等。

于是，为了解决上述使用蛋白酶级联的测定方法中的问题，进一步开 发了几种新的测定方法。

例如有，通过基因工程学方法制备仅包含G因子α亚基的βG结合结 构域的蛋白质来代替作为天然原材料的鲎的血细胞提取物，使用经荧光标 记的该蛋白质1分子，通过荧光偏振法测定βG的方法(专利文献1)。但是， 利用该方法的检测灵敏度最高以茯苓聚糖(βG的一种)换算为数ng/mL左 右，不是用于临床检查领域充分的灵敏度。

另外，还有通过利用了传感器芯片的Biacore的测定方法(非专利文献 1)、使用与βG特异性结合且具有抑制鲎G因子活化的性质的βG结合性 蛋白质、以及经标记物质标记的针对βG结合性蛋白质的抗体来测定βG的 方法(专利文献2)。还记载了专利文献2所记载的βG结合性蛋白质也可以 通过基因工程学方法制备。

但是，利用传感器芯片的方法是主要测定βG与βG结合性蛋白质的亲 和性的方法，是定性方法且操作繁琐，将该方法应用于临床检查领域存在 问题。

另外，在使用具有抑制鲎G因子活化的性质的βG结合性蛋白质和经 标记物质标记的针对βG结合性蛋白质的抗体的方法中使用的βG结合性蛋 白质是天然品，因而存在产生批间允差这样的问题。另外，关于该方法能 否应用于临床检查领域尚未进行研究。而且，该方法的灵敏度存在问题。

此外，还已知如下发明：“一种真菌检测用试剂盒，包含能与β-1，3-葡 聚糖结合的重组蛋白质，该重组蛋白质包含1个～多个来源于半胱氨酸残 基被置换成了其他氨基酸的鲎G因子α亚基Xln Z1结构域和/或Z2结构 域的结构域。”(专利文献4)。

该方法是通过使具有如上所述的特征的重组蛋白质的一种与含真菌的 样品接触来检测真菌的方法。但是，关于使用该蛋白质的βG的测定方法(包 括夹心法)尚未进行研究。

还已知使用2分子作为βG的受体已知的Dectin 1通过ELISA等方法 测定βG的方法(非专利文献2)。但是，该方法也不能实现临床现场所要 求的灵敏度。

另外，还已知作为纤维素分解菌的产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter  succinogenes)等细菌中具有纤维素结合性蛋白质。纤维素结合性蛋白质的 与纤维素结合的区域被称为纤维素结合结构域(Cellulose binding domein， CBD)。CBD根据氨基酸序列的特征进一步被分类为多个家族(CBDI～X) (Advances in Microbial Physiology，vol.37，p.1-81，1995)。有的CBD具有木 聚糖酶Z样结构域，该结构域具有与βG结合的性质。但是，并不是所有 CBD都具有木聚糖酶Z样结构域。而且，作为CBD的结合对象的纤维素 是(1→4)-β-D-葡聚糖，但在临床检查中成为测定对象的血中的βG是 (1→3)-β-D-葡聚糖。因此，即使有的CBD中具有木聚糖酶Z样结构域， 关于CBD能否在临床检查领域用于测定βG也仍然不明。

如上所述，这些方法都在特异性地测定βG时，特别是在用于临床检 查时存在各种问题。

专利文献1：日本特开2003-155298号公报

专利文献2：日本特许第3793573号公报

专利文献3：日本特许第3781771号公报

专利文献4：日本特开2009-47588号公报

非专利文献1：Takaki Y.et al.，J.Biol.Chem.，2002，vol.277， p.14281-14287

非专利文献2：Graham L.M.et.al.，J.Immunol.Methods，2006， vol.314(1-2)，p.164-169

发明内容

发明所要解决的课题

本发明是鉴于如上所述的状况而做出的，课题是提供与现有的利用蛋 白酶级联的试剂具有同等的灵敏度和/或特异性、且解决了上述各种问题的 βG的测定方法和测定试剂。

用于解决课题的方法

本发明是为了解决上述课题而做出的，包括以下的构成。

(1)一种βG的测定方法，该方法通过下述方法来进行，

(i)使样品与βG结合性蛋白质1、βG结合性蛋白质2接触，从而形成 βG结合性蛋白质1、样品中的βG和βG结合性蛋白质2的复合体，所述 βG结合性蛋白质1是含有与序列号4、6、8、10、14、16、18或20的任 一者所示氨基酸序列同一或实质上同一的氨基酸序列、且对βG具有结合 性的蛋白质1，所述βG结合性蛋白质2是含有与序列号4、6、8、10、14、 16、18或20的任一者所示氨基酸序列同一或实质上同一的氨基酸序列、 且对βG具有结合性的蛋白质2，

(ii)测定该复合体的量，

(iii)基于所得的该复合体的量来测定样品中的βG量。

(2)一种βG测定用试剂，该试剂含有对βG具有结合性的蛋白质，该 蛋白质含有与序列号4、6、8、10、14或20的任一者所示氨基酸序列同一 或实质上同一的氨基酸序列。

(3)一种β-葡聚糖测定用试剂盒，该试剂盒含有下述(i)、(ii)作为构成 成分，

(i)含有对βG具有结合性的蛋白质1的试剂，所述蛋白质1含有与序 列号4、6、8、10、14、16、18或20的任一者所示氨基酸序列同一或实质 上同一的氨基酸序列，

(ii)含有对βG具有结合性的蛋白质2的试剂，所述蛋白质2含有与序 列号4、6、8、10、14、16、18或20的任一者所示氨基酸序列同一或实质 上同一的氨基酸序列。

(4)一种蛋白质，该蛋白质含有与序列号4、6、8、10、14或20的任 一者所示氨基酸序列同一或实质上同一的氨基酸序列，且对βG具有结合 性。

(5)一种核酸分子，该核酸分子含有与序列号1、3、5、7、9、13或 19的任一者所示碱基序列同一或实质上同一的碱基序列。

(6)一种核酸分子，该核酸分子编码含有与序列号2、4、6、8、10、 14或20的任一者所示氨基酸序列同一或实质上同一的氨基酸序列、且对 βG具有结合性的蛋白质。

(7)整合有上述(5)或(6)所述的核酸分子的重组体。

(8)利用上述(7)所述的重组体进行转化或转导而得的转化体或转导 体。

(9)含有与序列号2、4、6、8、10、14或20的任一者所示氨基酸序 列同一或实质上同一的氨基酸序列、且对βG具有结合性的蛋白质的制造 方法，其特征在于，培养上述(8)所述的转化体或转导体，从所得的培养物 中分离蛋白质。

本发明者在为了解决如上所述的课题而进行的锐意研究中，注意到存 在于鲎G因子α亚基的βG结合结构域，由于该结构域是2聚体结构，因 而考虑到应该可以使用包含该结构域结构的α亚基片段来测定βG。另外， 认为这样的α亚基片段可以通过基因学方法获得重组子(重组体)，并进一 步进行了研究，结果确立了使用该α亚基片段通过夹心法来进行的βG测 定体系。即，发现了在作为具有特定氨基酸序列的α亚基片段、且具有βG 结合结构域的至少1聚体的结构的片段中，存在适合用于βG测定的片段， 并且进一步确立了使用2分子这些α亚基片段通过所谓夹心法来进行的βG 测定体系，从而完成了本发明。

发明的效果

本发明提供使用了2分子具有特定氨基酸序列的βG结合性蛋白质的 βG测定方法和用于该方法的试剂和试剂盒、以及具有特定氨基酸序列的重 组体βG结合性蛋白质及其制造方法。根据本发明的βG测定方法，与现有 方法相比，能够更高灵敏度且更特异性地进行βG测定。另外，即使在对 含有蛋白酶的样品进行βG的测定时，也不需要进行用于预先使样品中的 蛋白酶失活的前处理。另外，由于灵敏度高，还实现了能够用于临床检查 这样的效果。

而且，如果使用本发明的重组子进行本发明的测定方法，则不需要使 用天然原料，因此还能够实现不存在所使用的试剂的批间允差、能够以固 定且高的测定灵敏度特异性地测定βG这样的效果。

而且，本发明的测定方法不仅能够应用于手动测定，而且能够应用于 使用自动分析装置的测定。

附图说明

图1显示美洲鲎属(Limulus)鲎G因子α亚基及其片段的示意图。图1 的上图显示美洲鲎属鲎G因子α亚基的示意图。图1的下图分别显示来源 于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段的示意图、以及各片段的N末端氨基酸 和C末端氨基酸在美洲鲎属鲎G因子α亚基上的位置。

图2显示东方鲎属(Tachypleus)鲎G因子α亚基及其片段的示意图。 另外，图2的上图显示东方鲎属鲎G因子α亚基的示意图。图2的下图分 别显示来自东方鲎属鲎G因子α亚基的片段的示意图、以及各片段的N末 端氨基酸和C末端氨基酸在东方鲎属鲎G因子α亚基上的位置。

图3显示实施例1所得的、来自美洲鲎属G因子α亚基的片段a(第 233-649位氨基酸)的蛋白质表达结果。(a)表示进行蛋白质印迹法(Western  blotting)的结果，(b)表示将SDS-PAGE后的凝胶进行银染色而得的结果。 另外，在图3(a)和(b)中，道(1)表示蛋白质分子量标记，道(2)表示以亲和纯 化后片段a为样品时的结果。

图4是显示实施例5所得的、样品中的香菇多糖(lentinan)浓度(换算值) 与样品在450nm的吸光度的关系的标准曲线。误差棒显示2SD的值。

图5显示实施例6所得的、来源于美洲鲎属G因子α亚基的片段a和 来源于美洲鲎属G因子α亚基的片段b在各片段浓度下的过氧化物酶活性 的测定结果。

图6显示实施例7所得的、在金属螯合剂存在下或不存在下来源于美 洲鲎属G因子α亚基的片段a的过氧化物酶活性的测定结果。

图7显示实施例6中使用的毛细管芯片的草图。

图8是显示实施例6所得的、样品中的香菇多糖浓度(换算值)与复合 体的荧光强度的时间积分值的关系的标准曲线。误差棒显示2SD的值。

图9显示实施例10所得的、本发明的通过夹心测定方法获得的βG浓 度与通过使用现有的鲎血细胞提取物的测定方法获得的βG浓度的相关。

图10是显示实施例11所得的、样品中的香菇多糖浓度(换算值)与发 光量(每秒计数(cps：count per second))的关系的图。误差棒显示1SD的值。

具体实施方式

作为本发明所涉及的βG，只要是含有βG作为其构成成分的多糖类即 可，不特别限定。可列举例如，具有引起鲎血细胞提取物的酶反应的性质 的物质。具体来说，可列举例如，由各种细菌类(例如，产碱菌属 (Alcaligenes)、农杆菌属(Agrobacterium)等)、酵母类(例如，酵母属 (Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝 孢酵母属(Trichosporon)、红酵母属(Rhodotorula)等)、霉菌类(曲霉属 (Aspergillus)、毛霉属(Mucor)、青霉属(Penicillium)、发藓菌属 (Trichophyton)、孢子丝菌属(Sporothrix)、瓶霉属(Phialophora)等)、放线 菌类(放线菌属(Actinomyces)、诺卡氏菌属(Nocardia)等)、蘑菇类(例如， 香菇、裂褶菌、云芝等)等的细胞壁等获得的天然多糖，具体例如，凝胶多 糖(Curdlan)、茯苓聚糖、核盘菌多糖(Sclerotan)、香菇多糖、裂裥菌素 (schizophyllan)、云芝多糖(Coriolan)等，或者藻类(例如，褐藻、眼虫藻、 硅藻等)的贮藏性多糖，具体例如，昆布多糖、副淀粉等。

在本发明的βG的测定方法中使用的“含有与序列号4、6、8、10、14、 16、18或20的任一者所示氨基酸序列同一或实质上同一的氨基酸序列、 且对βG具有结合性的蛋白质1”(βG结合性蛋白质1)、和“含有与序列号4、 6、8、10、14、16、18或20的任一者所示氨基酸序列同一或实质上同一 的氨基酸序列、且对βG具有结合性的蛋白质2”(βG结合性蛋白质2)可以 相同也可以不同，还可以是合成蛋白质。

此外，以下有时将“βG结合性蛋白质1”和“βG结合性蛋白质2”合并记 载为“本发明所涉及的βG结合性蛋白质”、或仅记载为“βG结合性蛋白质”。

“βG结合性蛋白质1”和“βG结合性蛋白质2”来源于鲎血细胞成分的G 因子α亚基。

美洲鲎属鲎G因子α亚基的氨基酸序列由本发明者阐明。其包含由序 列号1所示碱基序列编码的、序列号2所示的由约649个氨基酸构成的氨 基酸序列，N末端侧具有β-1，3-葡聚糖酶样结构域，C末端侧具有被认为 是βG结合结构域的2聚体的木聚糖酶Z样结构域(XlnZ)，并且序列中央 具有木聚糖酶A样结构域。木聚糖酶A样结构域具有2次重复的作为结构 基序的QQWS(Gln-Gln-Trp-Ser)基序。

另外本发明者以由本发明者所获得的关于美洲鲎属鲎G因子α亚基的 氨基酸序列的知识为基础，设计了结构中含有被认为是βG结合结构域的 木聚糖酶Z样结构域(XlnZ)的4种美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段。即，

·美洲鲎属鲎G因子α亚基片段a(以下有时仅记为“片段a”)、

·美洲鲎属鲎G因子α亚基片段b(以下有时仅记为“片段b”)、

·美洲鲎属鲎G因子α亚基片段c(以下有时仅记为“片段c”)、

·美洲鲎属鲎G因子α亚基片段d(以下有时仅记为“片段d”)。

由本发明者阐明的美洲鲎属鲎G因子α亚基的示意图示于图1的上图。 另外，由本发明者设计的来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段的示意图、 和各片段的N末端氨基酸和C末端氨基酸在美洲鲎属鲎G因子α亚基上 的位置合并示于图1的下图。

以下对于各片段的结构等进行说明。

片段a包含由序列号3所示碱基序列编码的、序列号4所示氨基酸序 列。相当于序列号2所示的美洲鲎属鲎G因子α亚基的氨基酸序列的从N 末端起第233位～第649位的氨基酸序列部分。具有木聚糖酶A样结构域 (存在2个QQWS基序)和2聚体的木聚糖酶Z样结构域(XlnZ)。

片段b包含由序列号5所示碱基序列编码的、序列号6所示氨基酸序 列。相当于序列号2所示的美洲鲎属鲎G因子α亚基的氨基酸序列的从N 末端起第387位～第649位的氨基酸序列部分。具有2聚体的木聚糖酶Z 样结构域(XlnZ)。

片段c包含由序列号7所示碱基序列编码的、序列号8所示氨基酸序 列。相当于序列号2所示的美洲鲎属鲎G因子α亚基的氨基酸序列的从N 末端起第524位～第649位的氨基酸序列部分。具有2聚体的木聚糖酶Z 样结构域(XlnZ)的中的C末端侧的1个结构域。

片段d包含由序列号9所示碱基序列编码的、序列号10所示氨基酸序 列。相当于序列号2所示的美洲鲎属鲎G因子α亚基的氨基酸序列的从N 末端起第233位～第515位的氨基酸序列部分。具有木聚糖酶A样结构域 (存在2个QQWS基序)和2聚体的木聚糖酶Z样结构域(XlnZ)中的N末端 侧的1个结构域。

另一方面，东方鲎属鲎G因子的α亚基结构分析已经完成，其氨基酸 序列和碱基序列在NCBI(美国国家生物技术信息中心，National Center for  Biotechnology Information)数据库公开。其包含由19个氨基酸构成的信号 肽和由本说明书中的序列号11所示碱基序列编码的、由序列号12所示的 673个氨基酸构成的氨基酸序列。N末端侧具有β-1，3-葡聚糖酶样结构域， C末端侧具有被认为是βG结合结构域的2聚体的木聚糖酶Z样结构域 (XlnZ)，并且序列中央具有木聚糖酶A样结构域。木聚糖酶A样结构域具 有3次重复的作为结构基序的QQWS基序。另外，日本特许第3781771 号(专利文献3)中公开了编码东方鲎属鲎G因子的α亚基的多肽的DNA。 该多肽由654个氨基酸构成，缺失了NCBI数据库所公开的氨基酸序列的 信号肽部分。

另外，本发明者与上述设计美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段同样地， 设计了其结构中包含被认为是βG结合结构域的木聚糖酶Z样结构域(XlnZ) 的4种东方鲎属鲎G因子α亚基的片段。即，

·东方鲎属鲎G因子α亚基片段e(以下有时仅记为“片段e”)、

·东方鲎属鲎G因子α亚基片段f(以下有时仅记为“片段f”)、

·东方鲎属鲎G因子α亚基片段g(以下有时仅记为“片段g”)、

·东方鲎属鲎G因子α亚基片段h(以下有时仅记为“片段h”)

东方鲎属鲎G因子α亚基的示意图示于图2的上图。另外，来源于东 方鲎属鲎G因子α亚基的片段的示意图、以及各片段的N末端氨基酸和C 末端氨基酸在东方鲎属鲎G因子α亚基上的位置合并示于图2的下图。其 中，片段e和片段h是由本发明者首次设计的。另外，片段f和g是公知 的，例如，有使用经标记物质标记的片段f或片段g来进行βG的测定的 例子，但使用这些片段二分子、或这些片段和其他片段二分子通过夹心法 来进行βG的测定的例子并不是已知的。

以下对于各片段的结构等进行说明。

片段e包含由序列号13所示碱基序列编码的、序列号14所示氨基酸 序列。相当于序列号12所示的东方鲎属鲎G因子α亚基的氨基酸序列的 从N末端起第268位～第673位的氨基酸序列部分。具有木聚糖酶A样结 构域(存在3个QQWS基序)、和2聚体的木聚糖酶Z样结构域(XlnZ)。

片段f包含由序列号15所示碱基序列编码的、序列号16所示氨基酸 序列。相当于序列号12所示的东方鲎属鲎G因子α亚基的氨基酸序列的 从N末端起第410位～第673位的氨基酸序列部分。具有2聚体的木聚糖 酶Z样结构域(XlnZ)。

片段g包含由序列号17所示碱基序列编码的、序列号18所示氨基酸 序列。相当于序列号12所示的东方鲎属鲎G因子α亚基的氨基酸序列的 从N末端起第548位～第673位的氨基酸序列部分。具有2聚体的木聚糖 酶Z样结构域(XlnZ)中的C末端侧的一个结构域。

片段h包含由序列号19所示碱基序列编码的、序列号20所示氨基酸 序列。相当于序列号12所示的东方鲎属鲎G因子α亚基的氨基酸序列的 从N末端起第268位～第547位的氨基酸序列部分。具有木聚糖酶A样结 构域(存在3个QQWS基序)、2聚体的木聚糖酶Z样结构域(XlnZ)中的N 末端侧的一个结构域。

美洲鲎属鲎G因子α亚基及其片段、以及东方鲎属鲎G因子α亚基 及其片段的各氨基酸序列的序列号和编码它们的碱基序列的序列号归纳示 于下述表1。

[表1]

本发明的测定方法中所使用的“含有与序列号4、6、8、10、14、16、 18或20的任一者所示氨基酸序列同一的氨基酸序列、且对βG具有结合性 的蛋白质”，即相当于上述的美洲鲎属鲎G因子α亚基的各片段、或东方 鲎属鲎G因子α亚基的各片段。

另外作为本发明的测定方法中使用的“与序列号4、6、8、10、14、16、 18或20的任一者所示氨基酸序列实质上同一的氨基酸序列”，可列举与序 列号4、6、8、10、14、16、18或20的任一者所示氨基酸序列具有约70％ 以上、优选为约80％以上、更优选为约90％以上、进一步优选为约95％ 以上的同源性、且对βG具有结合性的氨基酸序列。

另外，作为“含有与序列号4、6、8、10、14、16、18或20的任一者 所示氨基酸序列实质上同一的氨基酸序列的蛋白质”，可列举例如，具有与 序列号4、6、8、10、14、16、18或20的任一者所示氨基酸序列实质上同 一的氨基酸序列、且对βG具有结合性的蛋白质。

更具体地说，例如，具有在序列号4、6、8、10、14、16、18或20 所示氨基酸序列中1～5个(优选为1～3个)氨基酸置换或缺失、或者在该 氨基酸序列中插入或添加了1～5个(优选为1～3个)氨基酸的氨基酸序列、 且对βG具有结合性的蛋白质等。在构成该蛋白质的氨基酸序列中进行置 换、缺失、插入、添加等的位置只要不影响该蛋白质对βG的亲和性即可， 可以是任意的。

另外，置换、缺失、插入、添加只要不影响该蛋白质对βG的亲和性， 则对一个氨基酸序列也可以在多个位置发生。

作为本发明的测定方法中使用的βG结合性蛋白质1和βG结合性蛋白 质2的优选例，可列举本发明所涉及的片段a、片段b、片段c、片段d、 片段e、片段f、片段g、片段h。如果考虑容易获得重组体的方面，则特 别优选片段a、片段b、片段e和片段f。

另外，在将用标记物质标记本发明所涉及的βG结合性蛋白质而得的 标记βG结合性蛋白质用于βG的测定时，所使用的βG结合性蛋白质更优 选如下蛋白质。即，为了防止标记物质妨碍βG结合性蛋白质与βG的结合， βG结合性蛋白质最好具有使得βG结合性蛋白质中的结合标记物质的部位 与βG结合部位充分离开的程度的长度(氨基酸数)。而且，在将βG结合性 蛋白质用于夹心法时，还是长的(氨基酸数多的)βG结合性蛋白质的测定 灵敏度高。如果考虑到以上的方面，则作为本发明所涉及的βG结合性蛋 白质，优选片段a、片段b、片段e、片段f，特别优选片段a或片段b。

此外，上述的在本发明的βG测定方法中使用的βG结合性蛋白质不具 有鲎G因子α亚基的β-葡聚糖酶样结构域，将该βG结合性蛋白质用于βG 测定方法具有如下优点。

即，如上所述，鲎血细胞提取物是天然品，因此即使想将鲎血细胞提 取物、和/或从鲎血细胞提取物中进一步分离出的G因子、G因子α亚基 等用于βG的测定，也容易出现批间允差。另外，由于鲎血细胞提取物是 天然品，因而也无法否定将来供给变得不稳定的可能性。因此，如果能够 获得对βG具有结合能力的蛋白质的重组子，则能够解决这样的问题。

因此，本申请发明者们为了获得对βG具有结合能力的蛋白质的重组 子进行了反复研究，结果发现，虽然其原因不明，但特别是在使用大肠杆 菌(E.coli)作为宿主进行蛋白质表达的情况下，能够有效地表达缺失了鲎G 因子α亚基的葡聚糖酶样结构域的βG结合性蛋白质。

如下所述，本发明的βG测定方法中使用的βG结合性蛋白质当然在以 哺乳类细胞、昆虫细胞等为宿主的情况下也能够表达，但是，例如在使用 酵母作为宿主的情况下，因为酵母细胞具有βG，所以需要从表达蛋白质中 除去来源于酵母的βG的操作。另外，在使用昆虫细胞作为宿主的情况下， 存在可能由于培养昆虫细胞的培养基中所含的牛血清白蛋白而污染分泌表 达蛋白质这样的问题。

但是，因为大肠杆菌的细胞不具有βG，所以用大肠杆菌表达的蛋白质 不存在被βG污染的危险性。而且，正如公知的那样，大肠杆菌与其他细 胞相比，具有操作容易、容易增殖、增殖速度快、操作所需的费用便宜、 不需要特殊的培养设备等优点，因此，在使用大肠杆菌作为宿主的情况下， 具有能够快速、稳定并廉价地制造重组体蛋白质这样的优点。

因此，本申请所涉及的鲎G因子α亚基的葡聚糖酶样结构域缺失的βG 结合性蛋白质从在以大肠杆菌为宿主的情况下也能够表达的方面来看，也 是优异的。

本发明的βG的测定方法如下完成：

(1)使样品与βG结合性蛋白质1、βG结合性蛋白质2反应，从而形 成βG结合性蛋白质1、样品中的βG和βG结合性蛋白质2的复合体，

(2)测定该复合体的量，

(3)基于所得的该复合体的量来测定样品中的βG量。

本发明所涉及的测定方法的原理是使用βG结合性蛋白质1和βG结合 性蛋白质2进行测定的所谓夹心法。

例如，是在通常的免疫层析法、胶乳法、酶免疫测定方法(EIA)中进行 的夹心法中，使用βG结合性蛋白质1和βG结合性蛋白质2代替抗体或抗 原的方法。另外，还可应用于Micro-TAS(微型全分析系统，Micro-Total  Analysis Systems：μ-TAS、μ全分析系统)。

形成的复合体可以通过使用不溶性载体等进行BF分离的非均相法进 行测定，也可以通过不进行BF分离的均相法进行测定。

以下叙述本发明的实施方式的例子。此外，还可以在各操作之后根据 需要进行除去不需要的物质的操作(洗涤等)。

I-1.使用游离的βG结合性蛋白质的方法1

(i)使样品与(未被固定化于不溶性载体的)游离的βG结合性蛋白质1、 (未被固定化于不溶性载体的)游离的βG结合性蛋白质2接触，从而形成βG 结合性蛋白质1、样品中的βG和βG结合性蛋白质2的复合体，

(ii)测定该复合体的量，

(iii)基于所得的该复合体的量来测定样品中的βG量。

I-2.使用游离的βG结合性蛋白质的方法2

(i)使样品与(未被固定化于不溶性载体的)游离的βG结合性蛋白质1 接触，从而形成样品中的βG和βG结合性蛋白质1的复合体-1，接着，

(ii)使该复合体-1与(未被固定化于不溶性载体的)游离的βG结合性蛋 白质2接触，从而形成βG结合性蛋白质1、样品中的βG和βG结合性蛋 白质2的复合体-2，接着，

(iii)测定该复合体-2的量，

(iv)基于所得的该复合体-2的量来测定样品中的βG量。

II-1.使用被固定化于不溶性载体的βG结合性蛋白质1和游离的非标 记βG结合性蛋白质2的方法1

(i)使样品与被固定化于不溶性载体的βG结合性蛋白质1、游离的非 标记βG结合性蛋白质2接触，从而形成被固定化于不溶性载体的βG结合 性蛋白质1、样品中的βG和非标记βG结合性蛋白质2的复合体，

(ii)测定该复合体的量，

(iii)基于所得的该复合体的量来测定样品中的βG量。

II-2.使用被固定化于不溶性载体的βG结合性蛋白质1和游离的非标 记βG结合性蛋白质2的方法2

(i)使样品与被固定化于不溶性载体的βG结合性蛋白质1接触，从而 形成被固定化于不溶性载体的βG结合性蛋白质1和样品中的βG的复合体 -1，接着，

(ii)使该复合体-1与游离的非标记βG结合性蛋白质2接触，从而形成 复合体-1和非标记βG结合性蛋白质2的复合体-2，接着，

(iii)测定该复合体-2的量，

(iv)基于该复合体-2来测定样品中的βG量。

III-1.使用游离的βG结合性蛋白质1和经标记物质标记的游离的βG 结合性蛋白质2的方法1

(i)使样品与游离的βG结合性蛋白质1、经标记物质标记的游离的βG 结合性蛋白质2接触，形成βG结合性蛋白质1、样品中的βG和标记βG 结合性蛋白质2的复合体，

(iii)测定该复合体中的标记物质的量，

(iv)基于所得的标记物质的量来测定样品中的βG量。

III-2.使用游离的βG结合性蛋白质1和经标记物质标记的游离的βG 结合性蛋白质2的方法2

(i)使样品与游离的βG结合性蛋白质1接触，从而形成样品中的βG 和βG结合性蛋白质1的复合体-1，接着，

(ii)使该复合体-1与经标记物质标记的游离的标记βG结合性蛋白质2 接触，从而形成复合体-1和标记βG结合性蛋白质2的复合体-2，接着，

(iii)测定该复合体-2中的标记物质的量，

(iv)基于所得的标记物质的量来测定样品中的βG量。

IV-1.使用被固定化于不溶性载体的βG结合性蛋白质1和经标记物质 标记的游离的βG结合性蛋白质的方法1

(i)使样品与被固定化于不溶性载体的βG结合性蛋白质1、经标记物 质标记的游离的标记βG结合性蛋白质2接触，从而形成被固定化于不溶 性载体的βG结合性蛋白质1、样品中的βG和标记βG结合性蛋白质2的 复合体，

(iii)测定该复合体中的标记物质的量，

(iv)基于所得的标记物质的量来测定样品中的βG量。

IV-2.使用被固定化于不溶性载体的βG结合性蛋白质1和经标记物质 标记的游离的βG结合性蛋白质的方法2

(i)使样品与被固定化于不溶性载体的βG结合性蛋白质1接触，从而 形成被固定化于不溶性载体的βG结合性蛋白质1和样品中的βG的复合体 -1，接着，

(ii)使该复合体-1与经标记物质标记的游离的标记βG结合性蛋白质2 接触，从而形成复合体-1和标记βG结合性蛋白质2的复合体-2，接着，

(iii)测定该复合体-2中的标记物质的量，

(iv)基于所得的标记物质的量来测定样品中的βG量。

V-1.使用经标记物质标记的游离的βG结合性蛋白质1和经标记物质 标记的游离的βG结合性蛋白质2的方法1

(i)使样品与经标记物质标记的游离的βG结合性蛋白质1、经标记物 质标记的游离的βG结合性蛋白质2接触，从而形成βG结合性蛋白质1、 样品中的βG和标记βG结合性蛋白质2的复合体，

(iii)测定该复合体中的标记物质的量，

(iv)基于所得的标记物质的量来测定样品中的βG量。

V-2.使用经标记物质标记的游离的βG结合性蛋白质1和经标记物质 标记的游离的βG结合性蛋白质2的方法2

(i)使样品与经标记物质标记的游离的βG结合性蛋白质1接触，从而 形成样品中的βG和标记βG结合性蛋白质1的复合体-1，接着，

(ii)使该复合体-1与经标记物质标记的游离的标记βG结合性蛋白质2 接触，从而形成复合体-1和标记βG结合性蛋白质2的复合体-2，接着，

(iii)测定该复合体-2中的标记物质的量，

(iv)基于所得的标记物质的量测定样品中的βG量。

VI-1.使用被固定化于胶乳粒子等不溶性载体的βG结合性蛋白质1 和被固定化于胶乳粒子等不溶性载体的βG结合性蛋白质2的方法1

(i)使样品与被固定化于胶乳粒子等不溶性载体的βG结合性蛋白质 1、被固定化于胶乳粒子等不溶性载体的βG结合性蛋白质2接触，从而形 成被固定化于胶乳粒子等不溶性载体的βG结合性蛋白质1、样品中的βG 和被固定化于胶乳粒子等不溶性载体的βG结合性蛋白质2的复合体，

(iii)测定该复合体的量，

(iv)基于所得的该复合体的量来测定样品中的βG量。

VII-2.使用被固定化于胶乳粒子等不溶性载体的βG结合性蛋白质1 和被固定化于胶乳粒子等不溶性载体的βG结合性蛋白质的方法2

(i)使样品与被固定化于不溶性载体的βG结合性蛋白质1接触，从而 形成被固定化于胶乳粒子等不溶性载体的βG结合性蛋白质1和样品中的 βG的复合体-1，接着，

(ii)使该复合体-1与被固定化于胶乳粒子等不溶性载体的βG结合性 蛋白质2接触，从而形成复合体-1和被固定化于胶乳粒子等不溶性载体的 βG结合性蛋白质2的复合体-2，接着，

(iii)测定该复合体-2的量，

(iv)基于所得的该复合体的量来测定样品中的βG量。

此外，还可列举使用针对βG结合性蛋白质1或βG结合性蛋白质2 的抗体、以及βG结合性蛋白质1和βG结合性蛋白质2，通过形成该抗体、 βG结合性蛋白质1、βG结合性蛋白质2和样品中的βG的复合体，再测 定该复合体的量，从而测定样品中的βG量的方法。该方法中使用的抗体 既可以是单克隆抗体也可以是多克隆抗体，是不阻碍βG结合性蛋白质1、 βG结合性蛋白质2与βG形成复合体的抗体。另外，还可以在一个测定体 系中使用多种该抗体进行βG的测定。而且如上所述，当然βG结合性蛋白 质1和βG结合性蛋白质2可以与不溶性载体结合，也可以被标记物质标 记。

另外，本发明的测定方法中使用的βG结合性蛋白质1和βG结合性蛋 白质2的组合可以分别不同，也可以相同。

即，既可以是βG结合性蛋白质1和βG结合性蛋白质2各一种的组合， 也可以是多种βG结合性蛋白质1和多种βG结合性蛋白质2的组合。另外， 所使用的一种或多种βG结合性蛋白质1与一种或多种βG结合性蛋白质2 可以相同也可以不同。作为更优选的组合，可列举βG结合性蛋白质1为 片段a或b、βG结合性蛋白质2为片段a或b的组合。

另外，例如，在使用与不溶性载体结合的βG结合性蛋白质1和游离 的(标记)βG结合性蛋白质2的情况下，作为优选的(固定化于不溶性载体的 βG结合性蛋白质1-游离的βG结合性蛋白质2)的组合，可列举(片段a-片 段a)、(片段a-片段f)、(片段b-片段a)、(片段b-片段d)、(片段b-片段f)、 (片段e-片段f)和(片段f-片段f)。

作为更优选的组合，可列举(片段a-片段a)、(片段a-片段b)、(片段 b-片段a)和(片段b-片段b)，作为进一步优选的组合，可列举(片段a-片段 a)和(片段b-片段a)。作为特别优选的组合，可列举(片段b-片段a)。

接下来，作为将所得的复合体-1或复合体-2、与未形成复合体的βG 结合性蛋白质1和/或βG结合性蛋白质2分离的方法，可列举在本身公知 的分离分析法中通常进行的方法。

例如，作为在使用被固定化于不溶性载体的本发明所涉及的βG结合 性蛋白质进行测定时的分离方法，可列举通过B/F分离法进行分离的方法。

另外，作为使用未被固定化于不溶性载体的游离的(标记)βG结合性蛋 白质1和/或游离的(标记)βG结合性蛋白质2进行测定时的分离方法，可列 举例如，色谱法、高速液相色谱法、电泳法、毛细管电泳法、毛细管芯片 电泳法、使用例如LiBASys(岛津制作所(株)制)等自动免疫分析装置的方 法等。其具体条件只要设定成能够使所得的复合体-1或复合体-2、与未形 成复合体的游离的(标记)βG结合性蛋白质1和/或游离的(标记)βG结合性 蛋白质2分离那样即可，其他条件可以依据本身公知的方法。例如，在使 用HPLC进行分离的情况下，依据Anal.Chem.65，5，613-616(1993)、日本 特开平9-301995号所记载的方法来进行即可；在使用毛细管电泳法的情况 下，依据J.Chromatogr.593253-258(1992)、Anal.Chem.641926-1932 (1992)、WO2007/027495等所记载的方法来进行即可。另外，作为使用自 动免疫分析装置例如LiBASys的情况下，依据生物样品分析(生物試料分 析)22卷4号303-308(1999)所记载的方法来进行即可。

作为本发明的βG的测定方法中使用的、用于固定化本发明所涉及的 βG结合性蛋白质的不溶性载体，只要是在例如通常的免疫学测定方法等中 使用的不溶性载体都可以使用，可列举例如聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸、 聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯、聚氯乙烯、聚乙 烯、聚氯碳酸脂、硅氧烷树脂、硅橡胶等合成高分子化合物，例如多孔性 玻璃、毛玻璃、陶瓷、氧化铝、硅胶、活性炭、金属氧化物等无机物质等。 另外，这些不溶性载体可以以微板、珠、管、多个管一体成形而得的专用 盘、圆盘状片、微粒(胶乳粒子)等多种形态使用。其中，从容易洗涤和同 时处理多个样品时的操作性等方面出发，特别优选微板、珠。

对于将本发明所涉及的βG结合性蛋白质固定化于载体的方法，只要 能够将βG结合性蛋白质固定化于不溶性载体即可，不特别限定。可列举 通常在本领域中利用的本身公知的所有固定化方法，例如，可列举化学键 合法(通过共价键进行固定化的方法)、物理吸附方法等。

作为优选例，可列举例如，使以通常为0.1μg/mL～20mg/mL、优选为 1μg/mL～5mg/mL的范围含有本发明所涉及的βG结合性蛋白质的溶液与 不溶性载体接触，在适当的温度下反应规定时间，从而获得结合了βG结 合性蛋白质的不溶性载体(固相)的方法。

作为用于制备βG结合性蛋白质的溶液的溶剂，只要不是具有妨碍本 发明所涉及的βG结合性蛋白质吸附或结合在不溶性载体上的性质的溶剂 即可，例如，优选纯化水、在例如pH值5.0～10.0、优选为pH值6.5～8.5 的中性附近具有缓冲作用的例如磷酸缓冲液、Tris缓冲液、Good’s缓冲液、 甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、MOPS缓冲液等。另外，作为这些缓冲液中 的缓冲剂浓度，可以从通常为10～500mM、优选为10～300mM的范围 中适宜选择。另外，该溶液中还可以含有不妨碍本发明所涉及的βG结合 性蛋白质吸附或结合在不溶性载体上的量的例如糖类、NaCl等盐类、表面 活性剂、防腐剂、蛋白质等。

此外，从防止测定时的非特异性反应的方面出发，优选进行通常本领 域所进行的封闭处理，即，将如上所述获得的结合了本发明所涉及的βG 结合性蛋白质的不溶性载体进一步浸渍在含有与βG结合性蛋白质无关的 蛋白质、例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、脱脂奶等乳蛋白质、卵白白 蛋白、市售的封闭剂(例如，ブロツクエ一ス(大日本住友制药(株)制))等的 溶液中进行处理。

另外，上述的“被固定化于不溶性载体的βG结合性蛋白质”可以直接 被固定化于不溶性载体，也可以介由被固定化于不溶性载体的抗βG结合 性蛋白质抗体而被固定化于不溶性载体。用于该方法的抗βG结合性蛋白 质抗体既可以是单克隆抗体也可以是多克隆抗体。另外，作为用于固定化 抗βG结合性蛋白质抗体的不溶性载体的具体例，可列举与上述的用于固 定化βG结合性蛋白质的不溶性载体相同的载体。另外，为了将抗βG结合 性蛋白质抗体固定化于不溶性载体，只要依据上述的将βG结合性蛋白质 固定化于不溶性载体的方法来进行即可。

此外，还可以利用本领域使用的如抗生物素蛋白-生物素反应那样的非 常强固的结合反应来将βG结合性蛋白质固定化于不溶性载体。

在本发明中，作为用于标记βG结合性蛋白质的标记物质，可列举例 如通常在免疫测定方法等中使用的过氧化物酶、微过氧化物酶、碱性磷酸 酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、乙酰胆碱酯酶、 苹果酸脱氢酶、萤光素酶等酶类、例如在放射免疫测定方法 (Radioimmunoassay、RIA)中使用的^99mTc、¹³¹I、¹²⁵I、¹⁴C、³H、³²p、³⁵S 等放射性同位素、例如在荧光免疫测定方法(Fluoroimmunoassay、FIA)中 使用的荧光素、丹酰(dansyl)、荧胺、香豆素、萘胺异硫氰酸荧光素(FITC)、 罗丹明、罗丹明X异硫氰酸盐、磺酰罗丹明101、荧光黄、吖啶、吖啶异 硫氰酸盐、核黄素或它们的衍生物等荧光性物质、例如萤光素、异鲁米诺 (isoluminol)、鲁米诺(luminol)、双(2，4，6-三氟苯基)草酸酯等发光性物质、 例如苯酚、萘酚、蒽或它们的衍生物等在紫外区具有吸收的物质、例如以 4-氨基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基、3-氨基-2，2，5，5-四甲基吡咯烷-1-氧基、 2，6-二叔丁基-α-(3，5-二叔丁基-4-氧代-2，5-环己二烯-1-亚基)-对甲苯基氧基 等具有氧基的化合物为代表的具有作为自旋标记化剂的性质的物质等标记 物质等通常在本领域中使用的所有标记物质。

另外，除了上述标记物质之外，还可以使用例如HiLyte Fluor 647、 HiLyte Fluor 488、HiLyte Fluor 555、HiLyte Fluor 680、HiLyte Fluor 750 等HiLyte系色素[均为HiLyte Bioscience，Inc.商品名]、Alexa Fluor Dye 350、Alexa Fluor Dye 430、Alexa Fluor Dye 488、Alexa Fluor Dye 532、 Alexa Fluor Dye 546、Alexa Fluor Dye 555、Alexa Fluor Dye 568、Alexa Fluor Dye 594、Alexa Fluor Dye 633、Alexa Fluor Dye 647、Alexa Fluor Dye 660、Alexa Fluor Dye 680、Alexa Fluor Dye 700、Alexa Fluor Dye 750等 Alexa系色素[均为Molecular Probes商品名]、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、 Cy7等CyDye系色素[均为Amersham Biosciences商品名]、例如考马斯亮 蓝R250、甲基橙等色素等。

另外，为了使如上所述的标记物质与βG结合性蛋白质结合(标记)，只 要适当利用例如在本身公知的免疫测定方法(EIA、RIA、FIA)等中一般进 行的本身公知的标记方法[例如，医化学实验讲座、第8卷、山村雄一主编、 第1版、中山书店、1971；图说荧光抗体、川生明著、第1版、(株)ソフ トサイエンス社、1983；酶免疫测定方法(酵素免疫測定法)、石川荣治、 河合忠、室井洁编、第2版、医学书院、1982等；分子克隆实验指南第 二版(モレキユラ一クロ一ニングアラボラトリ一マニユアル セカンドエデイシヨン)、J.サムブルツク，E.F.フリツシユ，T.マニアテイ ス、コ一ルドスプリングハ一バ一ラボラトリ一プレス等所述的方法]、 和/或利用抗生物素蛋白(或链霉抗生物素蛋白)与生物素的反应的常规方法 等即可。

此外，还可以通过介由1个或数个氨基酸、或1个或数个氨基酸和连 接物(linker)使βG结合性蛋白质与标记物质结合的方法来标记βG结合性 蛋白质。在介由氨基酸、或氨基酸和连接物与标记物质结合的βG结合性 蛋白质中，βG结合性蛋白质中的βG结合部位与标记物质之间更加远离。 因此标记物质妨碍βG结合部位与样品中的βG的结合的可能性降低，所以 更优选。为了获得结合了氨基酸的βG结合性蛋白质，只要通过常规方法 在本发明所涉及的βG的N末端结合氨基酸即可。另外，通过使用在N末 端添加了编码该氨基酸的核苷酸序列的F引物进行PCR，将所得的PCR 产物整合到适当的表达用载体DNA中，接着通过常规方法获得转化体， 使本发明的βG结合性蛋白质表达，也可以获得结合了氨基酸的βG结合性 蛋白质。

另外，使如上所述的标记物质与蛋白质结合(标记)的试剂盒也有各种 市售，因而可以使用它们按照试剂盒所附带的操作说明书进行标记。

另外，上述“经标记物质标记的标记βG结合性蛋白质”可以通过与经 标记物质标记的抗βG结合性蛋白质抗体结合而间接地被标记。用于该方 法的抗βG结合性蛋白质抗体既可以是单克隆抗体也可以是多克隆抗体。 另外，标记抗βG结合性蛋白质抗体的标记物质和该标记的测定方法的具 体例如关于标记βG结合性蛋白质的记载中所述。另外，为了用该标记物 质标记抗βG结合性蛋白质抗体，依据上述的用标记物质标记βG结合性蛋 白质的方法进行即可。

另外，作为标记物质还可以使用核酸链。

核酸链是以由嘌呤碱基或嘧啶碱基、作为糖部分的戊糖、和磷酸构成 的核苷酸残基为基本单元，在各核苷酸之间由该磷酸在糖的3’与5’位碳之 间通过二酯键连接聚合而成的链状多核苷酸，可列举例如，糖部分为核糖 的RNA或/和糖部分为脱氧核糖的DNA。另外，该核酸链可以由单链、双 链或双链以上的多条核酸链构成。

作为所使用的核酸链的长度，只要能够实现本发明的目标即可，通常 为1bp～1000kbp，优选为5bp～100kbp，更优选为10bp～50kbp。

此外，本发明中使用的核酸链只要是能够实现本发明的目标的范围即 可，也可以用适当的化合物进行适宜修饰等。

作为使核酸链与本发明所涉及的βG结合性蛋白质结合的方法，可列 举例如，日本特许第4214779号等所公开的公知方法。

例如，将本发明所涉及的βG结合性蛋白质和核酸链各自具有的官能 团直接或介由连接物[例如，N-(ε-马来酰亚胺基己酰氧基)琥珀酰亚胺 (EMCS)、磺基琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯 (Sulfo-SMPB)、磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸 酯(Sulfo-SMCC)等]等结合即可。

另外，还可以预先在核酸链中导入反应性官能团，然后通过日本特许 第4214779号所述的方法使本发明所涉及的βG结合性蛋白质与导入了反 应性官能团的核酸链结合。作为向核酸链导入反应性官能团的方法，可列 举本身公知的方法。

另外，作为使核酸链与本发明所涉及的βG结合性蛋白质结合的方法， 例如，可以通过使用5’末端导入了反应性官能团的PCR引物进行PCR， 作为PCR产物获得5’末端导入了反应性官能团的核酸链的方法(分子克隆 实验指南第二版(モレキユラ一クロ一ニングアラボラトリ一マ ニユアルセカンドエデイシヨン)、J.サムブルツク，E.F.フリツシユ，T. マニアテイス、コ一ルドスプリングハ一バ一ラボラトリ一プレス等) 等，从而向核酸末端导入反应性官能团。

另外，上述“经标记物质标记的标记βG结合性蛋白质”可以是结合了 经标记物质标记的核酸的蛋白质。用于该方法的核酸、和核酸与βG结合 性蛋白质的结合方法如上所述。

作为核酸与标记物质的结合方法，可列举例如，日本特许第4214779 号所记载的方法。

此外，在含有被标记的βG结合性蛋白质(标记βG结合性蛋白质)的溶 液中，还可以在通常本领域所使用的浓度范围内含有通常本领域中作为稳 定剂使用的物质，例如，糖类、蛋白质、表面活性剂等。

另外，作为实施本发明的测定方法所产生的复合体中的标记量的测定 方法，根据标记物质的种类不同而不同，只要根据标记物质所具有的能够 通过任何方法检测的性质，按照各自的规定的方法实施即可。例如，在标 记物质是酶的情况下，按照免疫测定方法的常规方法、例如，“酶免疫测定 方法(酵素免疫測定法)”(蛋白质核酸酶(蛋白質核酸酵素)增刊 No.31、北川常广·南原利夫·迁章夫·石川荣治编，51～63，共立出版 (株)、1987)等所记载的方法进行测定即可；在标记物质是放射性物质的情 况下，例如，按照RIA中进行的常规方法，根据该放射性物质所放出的放 射线的种类和强度适宜选择使用浸液型GM计数器、液体闪烁计数器、井 户型闪烁计数器、HPLC用计数器等测定仪器进行测定即可(例如，参考医 化学实验讲座、第8卷、山村雄一主编、第1版、中山书店、1971等)。另 外，在标记物质是荧光性物质的情况下，例如，依据在使用荧光光度计等 测定仪器的FIA中进行的常规方法、例如“图说荧光抗体、川生明著、第 1版、(株)ソフトサイエンス社、1983”等所记载的方法进行测定即可；在 标记物质是发光性物质的情况下，依据使用光子计数器等测定仪器的常规 方法、例如“酶免疫测定方法(酵素免疫測定法)”(蛋白质核酸酶(蛋白質 核酸酵素)增刊No.31、北川常广·南原利夫·迁章夫·石川荣治编集、 252～263、共立出版(株)、1987)等所记载的方法进行测定即可。另外，在 标记物质是在紫外区具有吸收的物质的情况下，使用分光光度计等测定仪 器通过常规方法进行测定即可；在标记物质具有自旋的性质的情况下，使 用电子自旋共振装置依据常规方法、例如，“酶免疫测定方法(酵素免疫測 定法)”(蛋白质核酸酶(蛋白質核酸酵素)增刊No.31、北川常广·南原 利夫·迁章夫·石川荣治编集、264～271、共立出版(株)、1987)等所记载 的方法进行测定即可。

更具体地说，例如，在标记物质是酶的情况下，可列举使其与显色试 剂反应诱导显色反应，通过分光光度计等测定其结果生成的色素量的方法 等本身公知的方法。

作为用于这样的目的的显色试剂，可列举例如，四甲基联苯胺(TMB)、 邻苯二胺、邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷、2，2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6- 磺酸)(ABTS)、N-乙基-N-磺丙基-间甲氧基苯胺(ADPS)、对硝基苯基磷酸 等通常在本领域中使用的显色试剂。另外，这些试剂的使用浓度只要在通 常本领域使用的浓度范围内适宜设定即可。

另外，为了停止显色反应，可以利用例如，在反应液中添加1～6N的 硫酸等酶活性抑制剂、试剂盒中附带的反应停止剂等通常在本领域进行的 反应停止方法。

另外，作为使用未被标记的βG结合性蛋白质测定βG的方法，可列举 例如利用来源于所得的复合体的性质进行测定的方法，具体有，作为吸光 度来测定复合体本身所具有的蛋白酶活性等酶活性和/或荧光偏振的方法， 或者表面等离子体振子共振等均相免疫测定系等的方法。

另外，作为在使用被固定化于胶乳粒子等不溶性载体的βG结合性蛋 白质1和被固定化于胶乳粒子等不溶性载体的βG结合性蛋白质2的方法 中使用的胶乳粒子等载体，可列举免疫学测定方法中使用的以例如核糖体、 高分子胶束等分子会合体、聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯 酰胺、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚氯碳酸 脂、硅氧烷树脂、硅橡胶等合成高分子化合物、多孔性玻璃、毛玻璃、氧 化铝、硅胶、活性炭、金属氧化物等无机物质等为材料制备的载体。另外， 其中，胶乳粒子由于是人工载体，容易根据目标对载体表面进行化学处理、 而且不易发生非特异性反应，因此特别优选。对其材质不特别限定，例如， 可列举聚苯乙烯胶乳粒子等苯乙烯系胶乳粒子、丙烯酸系胶乳粒子等作为 优选材质。

作为其形态，可列举珠、微粒、胶乳粒子等形态。

另外，对其粒径不特别限定，平均粒径通常为0.05～0.5μm，优选为 0.1～0.4μm。

作为将本发明所涉及的βG结合性蛋白质担载于上述载体的方法，只 要是通过使本发明所涉及的βG结合性蛋白质与载体接触来进行的方法即 可，不特别限定。可列举通常在本领域中利用的本身公知的担载方法(例如， 所谓物理吸附法)作为代表方法。

另外，在使用市售的载体的情况下，只要按照其操作说明书中推荐的 担载方法来将本发明所涉及的βG结合性蛋白质担载于载体即可。

在使用被固定化于胶乳粒子等不溶性载体的βG结合性蛋白质1和被 固定化于胶乳粒子等不溶性载体的βG结合性蛋白质2的测定方法中，作 为测定所形成的被固定化于胶乳粒子等不溶性载体的βG结合性蛋白质1、 样品中的βG和被固定化于胶乳粒子等不溶性载体的βG结合性蛋白质2 的复合体的量的方法，可列举例如，通过测定由于该复合体生成而造成的 浊度的变化来进行目标成分的测定的所谓比浊法、通过测定散射光强度的 变化来进行目标成分的测定的所谓浊度法、胶乳凝集法等常规方法。

为了通过上述方法获得样品中的βG量，可以通过代入预先使用βG浓 度已知的样品进行同样的操作获得的表示βG浓度与浊度、散射光强度的 变化的关系的标准曲线，从而求出样品中的βG浓度。

在本发明的βG测定方法中，各反应时的本发明所涉及的βG结合性蛋 白质1和βG结合性蛋白质2的浓度根据βG的测定范围为怎样的程度、以 及具体测定方法不同而不同。

例如，在测定0.1pg～1μg的βG的情况下，使用2分子游离的βG结 合性蛋白质进行测定时所使用的游离的βG结合性蛋白质1和游离的βG结 合性蛋白质2的使用量分别为0.1ng～0.1mg。

在使用固定化于不溶性载体的βG结合性蛋白质1和标记βG结合性蛋 白质2通过化学发光法、显色法进行测定的情况下，结合于不溶性载体的 βG结合性蛋白质1的使用量为0.1ng～0.1mg，标记βG结合性蛋白质2的 使用量为0.1ng～0.1mg左右。

另外，例如，在测定0.1pg～1μg的βG、且使用2分子结合于胶乳粒 子等不溶性载体的βG结合性蛋白质进行测定的情况下所使用的βG结合性 蛋白质1和βG结合性蛋白质2的使用量分别为0.1ng～0.1mg左右。

其用量在使含βG的样品与游离的βG结合性蛋白质反应的情况下，相 对于含βG的样品1～1000μL、优选为10～100μL(含βG 0.1pg～1μg)，本 发明所涉及的βG结合性蛋白质通常为1～1000μL(作为βG结合性蛋白质 含有0.1ng～0.1mg)、优选为2～500μL。

另外，反应时的温度为25～40℃、优选为30～37℃，反应时间通常为 10秒～30小时、优选为5分钟～20小时、更优选为30分钟～10小时。

βG结合性蛋白质1和βG结合性蛋白质2既可以同时与样品反应，也 可以依次反应。

作为本发明的βG量的测定方法的具体例，以使用过氧化物酶(POD) 作为标记物，使用固定化于不溶性载体的βG结合性蛋白质1、和经POD 标记的βG结合性蛋白质2，测定来源于生物体的样品中的βG量的方法为 例来进行说明，其概略如下。

即，使含βG的样品50μL(含βG 0.1pg～1μg)与将本发明所涉及的βG 结合性蛋白质1固定化于不溶性载体而得的固相(含有βG结合性蛋白质1 0.1ng～0.1mg)接触，在4～40℃反应3分钟～20小时，在不溶性载体上生 成βG和βG结合性蛋白质1的复合物(作为复合体-1)。接下来，使其与含 有经POD标记的本发明所涉及的βG结合性蛋白质2的溶液50～100μL(含 有βG结合性蛋白质20.1ng～0.1mg)在4～40℃反应3分钟～16小时，从 而在不溶性载体上生成固定化βG结合性蛋白质1-βG-标记βG结合性蛋白 质的复合物(作为复合体-2)。接着，例如，添加适当浓度的TMB溶液，然 后使其反应一定时间，加入1M磷酸等反应停止液，使反应停止。测定 450nm的吸光度。可以通过将所得的测定值代入对于预先浓度已知的βG 溶液使用与上述相同试剂进行同样的操作而获得的显示测定值与βG量的 关系的标准曲线，从而求出样品中的βG量。

在进行毛细管芯片电泳来检测βG的情况下，通过差示折射检测器、 荧光检测器、UV检测器等仪器来进行即可，其中优选UV检测器、荧光 检测器，更优选荧光检测器。

本发明的βG测定方法例如在用毛细管芯片电泳进行分离、用荧光检 测器进行测定的情况下，如下进行即可。所用的βG结合性蛋白质1和βG 结合性蛋白质2可以用标记物质标记。

即，将βG样品1～50μL与含有通常为0.001～10μM、优选为0.01～ 1μM的本发明所涉及的βG结合性蛋白质1、和通常为0.01～10μM、优选 为0.01～1μM的本发明所涉及的βG结合性蛋白质2的试液20～50μL混 合，在25～40℃保温下反应5～30分钟、优选为10秒～15分钟。然后， 将所得的溶液用适当的分离方法、例如毛细管芯片电泳进行分离，通过例 如荧光检测器等进行测定。将所得的测定值代入使用浓度已知的βG溶液 预先制成的表示βG浓度与该测定值的关系的标准曲线，可以求出样品中 的βG浓度。

此外，还可以使用经例如Alexa Fluor-488tetrafluorophenyl ester等标 记的βG结合性蛋白质1和经例如Alexa Fluor-647succinimidyl ester等标 记的βG结合性蛋白质2进行公知的所谓荧光相关分光法(Fluorescence  Correlation Spectroscopy，FCCS)来进行βG的测定。

作为本发明所涉及的样品，可列举例如，血液、血清、血浆、尿、淋 巴、脑脊液、胸水、腹水等临床样本、药品、医疗用具、食品等，但不限 于这些。

如果列举本发明的测定方法中所使用的、用于溶解βG结合性蛋白质 的缓冲液的具体例，则可列举例如，Tris缓冲液、磷酸缓冲液、佛罗那缓 冲液、硼酸缓冲液、Good’s缓冲液等通常在利用抗原抗体反应的测定方法 中使用的所有缓冲液，作为其pH值只要在不抑制本发明的蛋白质与βG 的反应的范围内即可，不特别限定，通常优选5～9的范围。

此外，本发明不仅在手动操作中可以充分利用，而且在使用自动分析 装置的测定体系也可以充分利用，能够容易且迅速地进行测定。此外，对 于使用手动或自动分析装置进行测定时的试剂类等的组合等没有特别限 制，只要根据应用的自动分析装置的环境、机种，或者考虑其他要因来适 当选择认为最好的试剂类等的组合即可。

作为本发明的βG测定用试剂，可列举“含有下述蛋白质的βG测定用 试剂，所述蛋白质含有与序列号4、6、8、10、14或20的任一者所示氨基 酸序列同一或实质上同一的氨基酸序列，且对βG具有结合性”。βG结合 性蛋白质可以被固定化于不溶性载体。

另外，βG结合性蛋白质可以经标记物质标记。不溶性载体和标记物质 的优选状态等如上所述。另外，作为固定化有上述βG结合性蛋白质的不 溶性载体，既可以是一种βG结合性蛋白质被固定化于不溶性载体而得的， 也可以是多种βG结合性蛋白质被固定化于不溶性载体而得的。

本发明的试剂中所含的βG结合性蛋白质的浓度通常为0.1ng/mL～ 100mg/mL，优选为1ng/mL～10mg/mL。

另外，本发明的试剂还可以进一步包含缓冲剂和/或碱土类金属盐等本 领域通常使用的其他适当试剂类，这些试剂类只要从所谓在生物化学反应 等中使用的试剂中适宜选择即可。作为上述缓冲剂，具体可列举通常本领 域中使用的三羟基氨基甲烷缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液、Good’s缓 冲液等，该缓冲剂在试剂中的浓度根据所使用的缓冲剂不同而多少存在差 异，通常为5mM～500mM，优选为20mM～200mM。此外，试剂中的本 发明所涉及的βG结合性蛋白质也可以是冻结干燥品。

作为本发明的βG测定用试剂盒，可列举含有下述(1)和(2)作为构成要 件的试剂盒：

(1)含有βG结合性蛋白质1的试剂，所述βG结合性蛋白质1是含有 与序列号4、6、8、10、14、16、18或20的任一者所示氨基酸序列同一或 实质上同一的氨基酸序列、且对βG具有结合性的蛋白质1，

(2)含有βG结合性蛋白质2的试剂，所述βG结合性蛋白质2是含有 与序列号4、6、8、10、14、16、18或20的任一者所示氨基酸序列同一或 实质上同一的氨基酸序列、且对βG具有结合性的蛋白质2。

βG结合性蛋白质可以被担载于不溶性载体。另外，可以被标记物质标 记。

其构成要件的优选状态和具体例如上所述。

另外，构成该试剂盒的上述(1)和(2)的βG结合性蛋白质1和βG结合 性蛋白质2分别可以为一种，也可以为多种。另外，构成(1)的βG结合性 蛋白质1和构成(2)的βG结合性蛋白质2可以相同也可以不同。

另外，本发明的βG测定用试剂盒还可以根据需要添加通常本领域中 使用的甘露糖醇、山梨糖醇等糖醇类、蔗糖、海藻糖等糖类、葡聚糖等多 糖类、牛血清白蛋白等蛋白质、表面活性剂等稳定剂等试剂，其浓度等只 要依据通常本领域中使用的范围来设定即可。另外，本发明的包含βG结 合性蛋白质的试剂中还可以使用上述本发明的试剂的项中记载的缓冲剂、 碱土类金属盐等，其浓度等也在与上述相同的范围内使用即可。而且，还 可以制成组合有标准曲线制成用的标准βG的试剂盒。该标准βG既可以使 用和光纯药工业株式会社等所制造的市售的βG的标准品，也可以使用按 照日本特许第3652738号所述的方法制造的标准品。另外，这些试剂盒中 的试剂类可以是冻结干燥品。

本发明的βG结合性蛋白质是鲎血细胞成分中的对βG具有结合性的G 因子的α亚基、和来源于该α亚基的片段，且是对βG具有结合性的蛋白 质。

可列举例如，作为美洲鲎属的鲎血细胞提取物的成分即G因子的α亚 基及其片段、且对βG具有结合性的蛋白质；以及作为东方鲎属的鲎血细 胞提取物的成分即G因子α亚基及其片段、且对βG具有结合性的蛋白质。

作为这样的本发明的βG结合性蛋白质的例子，可列举“含有与序列号 4、6、8、10、14或20的任一者所示氨基酸序列同一或实质上同一的氨基 酸序列、且对βG具有结合性的蛋白质”。

本发明的βG结合性蛋白质中的所谓“含有与序列号4、6、8、10、14 或20的任一者所示氨基酸序列同一的氨基酸序列、且对βG具有结合性的 蛋白质”，相当于上述的“βG的测定方法”中所说明的、美洲鲎属鲎G因子 α亚基的各片段、或东方鲎属鲎G因子的α亚基的各片段。

另外作为本发明的“与序列号4、6、8、10、14或20的任一者所示氨 基酸序列实质上同一的氨基酸序列”，可列举与序列号4、6、8、10、14 或20的任一者所示氨基酸序列具有约70％以上、优选为约80％以上、更 优选为约90％以上、进一步优选为约95％以上的同源性的氨基酸序列。

另外，作为“含有与序列号4、6、8、10、14或20的任一者所示氨基 酸序列实质上同一的氨基酸序列的蛋白质”，可列举例如，具有与序列号4、 6、8、10、14或20的任一者所示氨基酸序列实质上同一的氨基酸序列、 且对βG具有结合性的蛋白质。

更具体地说，例如，是具有在序列号4、6、8、10、14或20所示氨基 酸序列中1～5个(优选为1～3个)氨基酸置换或缺失、或在该氨基酸序列 中插入或添加1～5个(优选为1～3个)氨基酸而得的氨基酸序列、且对βG 具有结合性的蛋白质等。

置换、缺失、插入、添加只要不使该蛋白质对βG的结合性丧失即可， 对一个氨基酸序列可以在多个位置发生。

本发明的βG结合性蛋白质可以按照其氨基酸序列通过一般的化学法 制法来制造。例如，可以通过戊基甲基氧基羰基法(Fmoc法)、叔丁基氧基 羰基法(tBoc法)等通常的化学合成法来获得本发明的βG结合性蛋白质。 另外，还可以使用市售的肽合成仪来进行化学合成。

另外，本发明的βG结合性蛋白质还可以通过使用基因重组技术的公 知方法来获得，所述基因重组技术即，将编码本发明的βG结合性蛋白质 的核酸分子整合到适当的质粒、噬菌体等表达载体中，使用该重组表达载 体转化(或转导)宿主细胞，扩增所得的宿主细胞，使本发明的βG结合性蛋 白质在细胞内表达或向细胞外分泌。

编码本发明的βG结合性蛋白质的核酸分子是“含有与序列号1、3、5、 7、9、13或19的任一者所示碱基序列同一或实质上同一的碱基序列的核 酸分子”。

编码本发明的βG结合性蛋白质的“含有与序列号1、3、5、7、9、13 或19的任一者所示碱基序列同一的碱基序列的核酸分子”，意味着“由与序 列号1、3、5、7、9或13的任一者所示碱基序列同一的碱基序列构成核酸 分子”和“含有与序列号1、3、5、7、9、13或19的任一者所示碱基序列同 一的碱基序列的全部的核酸分子”。

“含有与序列号1、3、5、7、9、13或19的任一者所示碱基序列实质 上同一的碱基序列的核酸分子”，是指具有在序列号1、3、5、7、9、13 或19的任一者所示碱基序列中的1～数个碱基缺失、添加、置换、插入了 一部分的碱基序列的核酸分子。缺失、添加、置换、插入可以在一个核酸 分子的一个位置发生或在多个位置同时发生。

另外，作为编码本发明的βG结合性蛋白质的核酸分子，还可列举“作 为编码含有与序列号2、4、6、8、10、14或20的任一者所示氨基酸序列 同一或实质上同一的氨基酸序列、且对βG具有结合性的蛋白质(本发明的 βG结合性蛋白质)的碱基序列的核酸分子”。这里所说的“本发明的βG结 合性蛋白质”的具体例子如上述关于“本发明所涉及的βG结合性蛋白质”的 说明中所记载的那样。

核酸分子既可以是DNA也可以是RNA。

以下说明通过遗传学的方法来制备本发明所涉及的βG结合性蛋白质 (包含本发明的βG结合性蛋白质)的方法的一例。

1.表达用重组载体的制备

(1)cDNA的制备

通过常规方法从鲎血细胞回收总RNA，例如通过利用以mRNA所具 有的多聚(A)链钓出的常规方法等来获得纯化mRNA。以所得的纯化 mRNA为模板，利用常规方法通过逆转录反应来合成cDNA。将该cDNA 作为包含鲎G因子α亚基基因的cDNA文库，用作以下PCR时的模板。

(2)整合有包含本发明所涉及的βG结合性蛋白质的序列的表达用重 组载体的制备

1)整合有包含鲎G因子α亚基基因的序列的表达用重组载体的制备

例如，使用通过常规方法由选自编码鲎G因子α亚基的cDNA的碱基 序列(序列号1或11)的3’-末端侧区域的任意位置设计出的反向引物(R引 物)、由序列号1或11的从5’-末端侧区域至起始密码子之间的任意位置设 计出的正向引物(F引物)、以及作为模板的包含鲎G因子α亚基基因的 cDNA文库(上述的cDNA文库等)，通过PCR等核酸扩增法来扩增包含作 为目标的鲎G因子α亚基基因的序列(例如，序列号1或11)的DNA片段。 按照常规方法将所得的PCR产物整合到适当的表达用载体DNA中，从而 获得表达用重组载体。

根据需要，分析整合于表达用重组载体的DNA片段的碱基序列，确 认整合了包含作为目标的鲎G因子α亚基基因的序列。

2)整合有包含来源于鲎G因子α亚基的片段的基因的序列的表达用 重组载体的制备-1

首先，例如，使用通过常规方法由选自编码鲎G因子α亚基的cDNA 的碱基序列(序列号1或11)的3’-末端侧区域的任意位置设计出的R引物、 由序列号1或11的从5’-末端侧区域至起始密码子之间的任意位置设计出 的F引物、以及作为模板的包含鲎G因子α亚基基因的cDNA文库(cDNA 等)，通过PCR等核酸扩增法，来扩增包含鲎G因子α亚基基因又的序列 (例如，序列号1或11)的DNA片段。按照常规方法将所得的PCR产物整 合到适当的载体DNA中，从而获得重组载体。

作为这里所使用的载体，可列举例如，TA克隆载体等克隆载体。如 果使用市售的克隆载体则较为简便。例如，可通用pGEM-T Easy(Progema  Co.制)等。

根据需要，分析整合于重组载体的DNA片段的碱基序列，确认整合 有包含来源于鲎G因子α亚基的基因的序列。

接下来，使用由选自编码来源于鲎G因子α亚基的片段的cDNA的碱 基序列(序列号3、5、7、9、13、15、17、19)的3’-末端侧区域的任意位置 设计出的R引物、由同一序列的从5’-末端侧区域至起始密码子之间的任 意位置设计出的F引物、以及作为模板的包含来源于鲎G因子α亚基的片 段的基因的cDNA文库(cDNA、上述所得的整合有包含鲎G因子α亚基基 因的序列的重组载体等)，通过PCR等核酸扩增法，来扩增作为目标的鲎 G因子α亚基片段基因或包含该基因片段的序列(例如，序列号3、5、7、 9、13、15、17、19)的DNA片段。按照常规方法将所得的PCR产物整合 到适当的表达用载体DNA中，从而获得整合有包含作为目标的来源于鲎G 因子α亚基的片段基因的序列的表达用重组载体。

根据需要，分析整合于表达用重组载体的DNA片段的碱基序列，确 认整合有包含作为目标的来源于鲎G因子α亚基的片段基因的序列。

3)整合有包含来源于鲎G因子α亚基的片段基因的序列的表达用重 组载体的制备-2

例如，使用通过常规方法由选自编码来源于鲎G因子α亚基的片段的 cDNA的碱基序列(序列号3、5、7、9、13、15、17、19)的3’-末端侧区域 的任意位置设计出的R引物、由同一序列的从5’-末端侧区域至起始密码 子之间的任意位置设计出的F引物、以及作为模板的包含来源于鲎G因子 α亚基的片段的基因的cDNA文库(cDNA等)，通过PCR等核酸扩增法， 来扩增包含作为目标的来源于鲎G因子α亚基的基因的序列(序列号3、5、 7、9、13、15、17、19)的DNA片段。按照常规方法将所得的PCR产物整 合到适当的表达用载体DNA中，从而获得整合有包含作为目标的来源于 鲎G因子α亚基的片段基因的序列的表达用重组载体。

根据需要，分析整合于表达用重组载体的DNA片段的碱基序列，确 认整合有包含作为目标的来源于鲎G因子α亚基的片段基因或其片段的序 列。

此外，整合于表达用重组载体的DNA片段(包含鲎G因子α亚基或其 片段基因序列)根据目的不同可以直接使用，或按照需要用制限酶消化后使 用，和/或添加连接物后使用。

作为上述1)～3)的方法中使用的表达载体，只要是在原核细胞和/或真 核细胞的各种宿主细胞中表达本发明所涉及的βG结合性蛋白质、具有生 产这些蛋白质的功能的载体即可，不特别制限。包含例如质粒载体、噬菌 体载体和病毒载体。

具体可列举例如，pTrcHis2载体、pcDNA3.1/myc-His载体(Invitrogen 社制)、pUC119(宝酒造社制)、pBR322(宝酒造社制)、pBluescript II KS+ (Stratagene社制)、Pqe-tri(Qiagen社制)、pET、pGEM-3Z、pGEX、pMAL 等质粒载体，λENBL3(Stratagene社制)、λDASHII(フナコシ社制)等噬菌 体载体、Charomid DNA(和光纯药工业(株)制)、Lorist6(和光纯药工业(株) 制)等粘粒载体等。

此外，还可列举来源于大肠杆菌的质粒(例如，pTrc99A、pKK223、 pET3a)、来源于枯草杆菌的质粒(例如，pUB110、pTP5、pC194)、来源于 酵母的质粒(例如，pSH19、pSH15)、λ噬菌体等噬菌体、逆转录病毒、牛 痘病毒、杆状病毒等动物病毒等，以及pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、 pcDNA I/Neo、p3×FLAG-CMV-14、pCAT3、pcDNA3.1、pCMV等。

此外，为了使检测、纯化容易，可以将作为目标的本发明所涉及的βG 结合性蛋白质(鲎G因子α亚基或其片段)制成与其他标签肽或蛋白质的融 合蛋白使其表达。作为用于融合的标签肽，可列举FLAG标签、3XFLAG 标签、His标签(His标签、例如，6×His标签)等，作为蛋白质，可列举β- 半乳糖苷酶(β-Gal)、绿色荧光蛋白(GFP)、麦芽糖结合蛋白质(MBP)等。

实际上，通过将使用在开放阅读框(open reading frame)的前后设计了 编码如上所述的标签肽的序列的引物进行PCR反应而得的产物亚克隆到 表达载体中，或在该基因与表达载体之间插入编码标签肽的序列的连接物， 或使用预先包含编码标签肽或蛋白质的序列的表达载体，从而本发明所涉 及的βG结合性蛋白质作为与这些肽或蛋白质的融合蛋白质而表达。例如， 如果预先使用整合有His标签基因的pTrcHis 2载体(Invitrogen制)作为表 达载体，在其上游整合含有βG结合性蛋白质的基因的序列，则通过确认 该His标签表达，从而也可以确认其上游区域的βG结合性蛋白质基因表 达。

本发明的重组体是整合有如上所述的本发明的核酸分子的重组体，可 列举整合有本发明所涉及的βG结合性蛋白质基因的表达用重组载体。其 具体例如上所述。

2.转化体的制备

本发明的转化体(转导体)可以通过使用所得的表达用重组载体转化(转 导)适当的宿主细胞来制备。

作为所用的宿主细胞，可列举例如，微生物[细菌(例如，埃希氏菌属 (Escherichia)菌、芽孢杆菌属(Bacillus)菌)、酵母(例如，酵母属 (Saccharomyces)等)、动物细胞和昆虫细胞等]。此外，还可以使用本领域 通常使用无细胞表达体系、植物细胞体系。

具体来说，埃希氏菌属菌中可列举大肠杆菌(Escherichia coli)，例如， 可列举BL21、BL21(DE3)、K-12、DH1、DH5、DH5α、M15、HB101、 C600、XL-1Blue、JM109、JM105、JM127、XL1-Blue、VCS257、TOP10) 等。在芽孢杆菌属菌中，可列举枯草杆菌(B.subtilis)、短芽孢杆菌(B. subtilis)、波茨坦芽孢杆菌(B.borstelenis)等。作为酵母，可列举酿酒酵母 (S.cerevisiae)、非洲粟酒彭贝裂殖酵母(Scizo.Pombe)、构巢曲霉(A. nidulans)、Pichia pastoria等，或者还可列举构巢曲霉(Asperigillus nidulans) 等曲霉属(Aspergillus)丝状菌。作为动物细胞，可列举猴细胞COS-7、Vero、 中国仓鼠细胞CHO、小鼠L细胞、人HeLa细胞、FL细胞等。作为昆虫 细胞，可列举BmN4、Sf9等，但不特别限于这些。

此外，还可以使用质粒、噬菌体DNA的导入效率更高的感受态细胞 (Competent Cell)。例如，大肠杆菌DH5α感受态细胞、大肠杆菌JM109感 受态细胞(タカラバイオ社制)等。

利用表达载体的宿主细胞的转化(或转导)可以使用现有公知的方法来 进行。

例如，宿主细胞是细菌(例如大肠杆菌)的情况下，可以通过例如Cohen 等的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，(1972)9，2110)、原生质体法(Mol.Gen. Genet.，(1979)168，111)或感受态法(J.Mol.Biol.，(1971)56，209)、 M.Morrison的方法(Method in Enzymology，68，326-331，1979)等的常规方 法来进行。另外，在使用市售的感受态细胞的情况下，按照该制品方案进 行转化(转导)即可。

这里，作为确认获得了经“整合有包含作为目标的编码βG结合性蛋白 质的基因序列的片段的表达用重组载体”转化而得的转化体的方法，例如， 利用用于获得重组载体的表达载体预先具有的抗药性的基因，研究导入体 的抗药性，确认为抗性的方法。例如，在使用pTrcHis2载体作为表达载体 的情况下，该载体具有氨苄青霉素抗性(amp ^r)的基因。因此，可列举以下 方法：将所得的转化体在添加了氨苄青霉素的培养基中培养，将培养而得 的转化体(氨苄青霉素抗性株)确认为被整合有作为目标的编码βG结合性 蛋白质的碱基序列的表达用重组载体转化了的转化体。

为了确认所得的转化体(转导体)生成作为目标的本发明所涉及的βG 结合性蛋白质(以下有时记载为“重组体βG结合性蛋白质”)(βG结合性蛋 白质基因表达)，除了有例如作为常规方法的使用探针的DNA杂交 (Southern hybridization)、菌落杂交等杂交之外，还有例如以下的方法。

在重组体βG结合性蛋白质作为例如跨膜型蛋白表达的情况等不分泌 到转化体的培养液中的情况下，用破坏或溶解细胞的常规方法(例如，超音 波处理、用匀浆器等处理、用适当的表面活性剂等膜溶解剂处理等)来处理 所得的转化体，获得其溶解产物(lysate)。然后，对于该溶解产物(根据需 要可在进一步纯化蛋白质之后)，例如，进行使用针对标签肽的抗体的通常 的免疫学测定方法(斑点蛋白质印迹法(Dot Western blotting)、蛋白质印迹 法(Western blotting)等)，选择确认了其培养上清中表达标签肽的导入体， 从而可以获得表达作为目标的重组体βG结合性蛋白质的转化体。

另外，在重组的来源于鲎G因子α亚基的片段分泌到该导入体的培养 液中的情况下，对于该培养液(培养上清)与对于上述溶解产物的情况下同 样地进行通常的免疫学测定方法，用同样的方法选择、获得表达作为目标 的重组体βG结合性蛋白质的转化体即可。

3.βG结合性蛋白质的表达

本发明所涉及的βG结合性蛋白质可以如下获得：将经如上所述获得 的整合有包含βG结合性蛋白质基因的序列的表达用质粒载体转化而得的 转化体在营养培养基中培养，生成重组体βG结合性蛋白质。

营养培养基优选含有宿主细胞(转化体)的生长所需的碳源、无机氮源 或有机氮源。作为碳源，可列举例如，葡萄糖、葡聚糖、可溶性淀粉、蔗 糖等，作为无机氮源或有机氮源，可列举例如，铵盐类、硝酸盐类、氨基 酸、玉米浆、胨、酪蛋白、肉提取物、大豆粕、马铃薯提取液等。另外， 根据需要还可以含有其他营养素[例如，氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁]、 维生素类、抗生素、生长促进因子等。培养基的pH值优选为约5～8。

培养通过本领域公知的方法来进行。选择培养条件例如温度、培养基 的pH值和发酵时间以获得本发明所涉及的βG结合性蛋白质最高效价。

在培养转化体的宿主为大肠杆菌的转化体(转导体)的情况下，在培养 大肠杆菌的常规方法的条件下、在通常使用的培养基中进行即可，作为培 养中使用的培养基，液体培养基是适合的。

作为培养转化体的宿主为大肠杆菌的转化体时的培养基，只要是培养 大肠杆菌时通常使用的培养基即可。可列举例如，D-MEM、RPMI等合成 培养基、LB培养基、2×YT培养基、Terrific Broth、M9培养基[Miller， Journal of Experiments in Molecular Genetics，431-433，Cold Spring  Harbor Laboratory，New York，1972)等。培养可以根据需要在通气、搅拌 的同时，在通常为14～42℃、优选为28～39℃下进行约3～24小时。另外 根据需要还可以加入例如异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)、3β-吲 哚基丙烯酸等药剂。

4.重组体βG结合性蛋白质的回收

本发明所涉及的βG结合性蛋白质可以如下从上述培养所得的培养物 中获得。

即，在本发明所涉及的βG结合性蛋白质存在于所培养的转化体的周 质或细胞质内的情况下，将培养物通过过滤或离心分离等常规方法收集菌 体或者细胞，悬浮于适当的缓冲液中，用例如表面活性剂处理、超音波处 理、溶菌酶处理、冻结融化等方法破坏细胞等的细胞壁和/或细胞膜，然后 通过离心分离和/或过滤等方法获得含有本发明所涉及的βG结合性蛋白质 的粗提取液。然后，为了从该粗提取液中纯化并分离天然或合成蛋白质， 按照一般使用的常规方法纯化、分离本发明所涉及的βG结合性蛋白质， 避免混入βG。

作为βG结合性蛋白质的分离、纯化方法，可列举例如，盐析、溶剂 沉淀法等利用溶解度的方法、透析、超滤、凝胶过滤、十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳等利用分子量差的方法、离子交换色谱等利用荷电的 方法、亲和色谱等利用特异亲和性的方法、逆相高速液相色谱等利用疏水 性差的方法、等电点电泳等利用等电点差的方法等。

例如，在使用pTrcHis2载体等预先包含编码His标签基因标签肽等的 标签肽的序列的表达载体的情况下，表达的重组体βG结合性蛋白质带有 His标签。因此，可以将含有重组体βG结合性蛋白质的溶液使用Ni-NTA (次氮基三乙酸镍，nickel-nitrilotriacetic acid)等含有镍离子的柱填充剂进 行亲和色谱，来纯化作为目标的重组体βG结合性蛋白质。

另外，还可以将经上述方法纯化处理后的含有重组体βG结合性蛋白 质的溶液进一步使用结合本发明所涉及的β结合性蛋白质的填充剂进行亲 和色谱。特别是在重组体βG结合性蛋白质的表达中使用的宿主是酵母菌 等真核生物的情况下，有时宿主的生成物中还含有宿主所产生的βG。因此， 为了除去该来源于宿主的βG而获得作为目标的重组体βG结合性蛋白质， 优选在上述纯化处理中进一步加入该亲和色谱处理。

这样分离、纯化而得的本发明所涉及的βG结合性蛋白质的存在可以 通过例如使用抗His抗体的ELISA等进行测定来确认。

以下列举实施例更详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例任何 限制。

实施例

实施例1

(1)RNA的回收

使用RNA提取用试剂ISOGEN(ニツポンジ一ン社制)，按照该制品 附带的操作方案如下地从美洲鲎属鲎血细胞中回收总RNA。

首先，在加入了ISOGEN 7ml的管中加入美洲鲎属鲎(美国产)血细胞 640mg，使用Polytron匀浆器(Kinematica AG社制)破碎血细胞。

将所得的血细胞的匀浆在室温温育5分钟，然后添加1.4mL的氯仿， 搅拌15秒，再在室温温育3分钟。然后将匀浆以4℃、12000G离心分离 15分钟，然后将水相移至新的管中，添加3.5mL的异丙醇并搅拌，然后在 室温温育10分钟。接下来，将匀浆以4℃、12000G离心分离10分钟，得 到沉淀物。将所得的沉淀物用7mL的70％乙醇洗涤，再干燥，获得RNA 沉淀物。将所得的RNA沉淀物溶解在800μL的灭菌水中。测定所得的RNA 水溶液的吸光度，从而测定所得的总RNA的量。从美洲鲎属鲎血细胞 640mg中获得了779μg的总RNA。

(2)mRNA的纯化

使用Oligotex^TM-dT30<Super>(タカラバイオ社制)用下述的方法纯化 mRNA。

首先，在上述(1)所得的总RNA水溶液250μl(总RNA约为243μg)中 添加250μL的缓冲液(10mM Tris-HCl，1mMEDTA，0.1％SDS，pH值7.5)， 再添加500μL的Oligotex^TM-dT30，然后在65℃温育5分钟使其反应。将 反应液在冰上放置3分钟。接下来，在反应液中添加0.1mL的5M NaCl， 在37℃温育10分钟。然后，将反应液以15000转/分钟离心分离3分钟， 除去上清，使小颗粒溶解于450μl TE(Tris-EDTA缓冲液、pH值8.0)中。 将小颗粒的溶液在65℃温育5分钟，然后在冰上放置3分钟。然后，将小 颗粒的溶液以20000G离心分离3分钟，回收400μL量的上清。将上清进 行通常的乙醇沉淀处理，然后将所得的沉淀物溶解在10μL TE中，获得纯 化mRNA的溶液。

(3)cDNA的制作和PCR克隆

1)cDNA

使用上述(2)所得的纯化mRNA作为模板，使用寡聚(dT)_12-18(和光纯药 工业制)和Reverscript II(ニツポンジ一ン制)进行通常的逆转录反应，合成 cDNA。

2)PCR

编码美洲鲎属G因子α亚基的基因序列尚未被确定。因此，考虑到如 果从编码东方鲎属G因子α亚基的碱基序列设计扩增编码东方鲎属G因 子α亚基的基因序列的PCR引物，使用该引物进行PCR，则能够扩增编 码美洲鲎属G因子α亚基的碱基序列，如下进行。

首先，以NCBI(美国国家生物技术信息中心，National Center for  Biotechnology Information)数据库所公开的东方鲎属G因子α亚基的基因 序列(示于序列号11)为基础，设计下述引物序列，委托Sigma公司合成。

引物序列

引物F15’-gcaatgttggtgttgc-3’(序列号21)

引物R15’-gaagaaacaacagctgttgacc-3’(序列号22)

上述引物中，引物F1对应于NCBI(美国国家生物技术信息中心， National Center for Biotechnology Information)数据库所公开的编码东方 鲎属G因子α亚基的基因的起始密码子的5’侧的3个碱基(gca：被认为编 码信号序列的序列的一部分)、和接下来的从起始密码子开始到向3’末端侧 的第13位碱基的16碱基的序列。另外，引物R1编码上述东方鲎属G因 子α亚基的C末端侧的数个氨基酸。

PCR使用该引物对，使用上述(3)1)所得的cDNA作为模板，在下述反 应条件下进行：在98℃加热2分钟之后，将95℃15秒、50℃30秒、68 ℃2分钟重复30次，最后68℃5分钟。

PCR反应条件

将所得的PCR产物进行含1μg/mL溴乙锭的1％琼脂糖凝胶电泳，切 下1.2Kbp附近的带部分的凝胶。使用QIAquick Gel Extraction kit(キア ゲン制)，从切下的凝胶纯化PCR产物。

(4)重组载体的制备和碱基序列的确定

在pGEM-T Easy(Promega Co.制)0.1μg中，混合上述(3)2)所得的纯 化PCR产物约5μg、DNA ligation kit Ver.2(宝酒造制)I液5μL，然后用灭 菌蒸馏水制成总量10μL。接下来，在16℃进行1小时的连接反应，获得 重组载体。所得的重组载体中插入有与上述(3)1)所得的cDNA相同的碱基 序列、即编码美洲鲎属G因子α亚基的碱基序列。这里，将所得的该重组 载体命名为“美洲鲎属G因子α/pGEM-T”。

使用所得的重组载体美洲鲎属G因子α/pGEM-T 200ng作为模板，使 用上述(3)2)中使用的引物的组合，使用DYEnamic ET Terminator Cycle  Sequencing Kit(GEヘルスケア社制)，依据附带的说明书记载的方法进 行测序反应。

(5)碱基序列的同源性检索

使用BaseStation(バイオラツドラボラトリ一ズ(株))进行所得的测序 反应物[具有与上述(3)1)所得的cDNA相同的碱基序列]的碱基序列的解读。 将通过解读获得的编码美洲鲎属G因子α亚基的碱基序列示于序列号1， 将由该碱基序列推定的、由该碱基序列所编码的氨基酸序列示于序列号2。

接下来，使用NCBI(美国国家生物技术信息中心，National Center for  Biotechnology Information)数据库，进行插入载体中的PCR产物的碱基序 列的同源性检索(BLAST)。其结果明确了，插入载体中的PCR产物的碱基 序列、即cDNA的碱基序列虽然与公知的东方鲎属G因子α亚基的基因序 列显示高同源性，但是不同。即，公知的东方鲎属G因子α亚基的基因序 列与相当于美洲鲎属G因子α亚基(除去信号肽和N末端侧的一部分序列、 以及终止密码子之外)的基因序列的同源性为85.6％。另外，将由各个碱基 序列推定的氨基酸序列进行比较，则两者的同源性为79.5％。

另外，以由所得的cDNA的碱基序列推定的、由该碱基序列所编码的 氨基酸序列(序列号2)为基础，详细分析美洲鲎属G因子α亚基的结构。 其结果明确了，在美洲鲎属G因子α亚基中，N末端侧存在β-1，3-葡聚糖 酶样结构域、C末端侧存在被认为是βG结合结构域的2聚体的木聚糖酶Z 样结构域(XlnZ)、并且中央存在木聚糖酶A样结构域(XlnA样结构域)。作 为与公知的东方鲎属G因子α亚基的氨基酸序列的不同点有：(i)存在于 C末端侧的2聚体序列的βG结合结构域之间的连接序列完全不同；(ii)作 为存在于序列中央的木聚糖酶A样结构域中的结构基序的QQWS基序在 东方鲎属G因子α亚基中重复3次，与此相对，在美洲鲎属G因子α亚 基中重复2次。

以以上的分析结果为基础，比较美洲鲎属G因子α亚基与公知的东方 鲎属G因子α亚基的碱基序列、氨基酸序列、蛋白质结构。结果归纳示于 下述表2中。

表2

另外，将由以上的分析预测出的美洲鲎属G因子α亚基的结构的示意 图示于图1，将公知的东方鲎属G因子α亚基结构的示意图示于图2。

(6)表达载体的制备

首先，使用上述(4)所得的重组载体美洲鲎属G因子α/pGEM-T为模 板进行PCR反应。关于引物，根据上述(5)中阐明的碱基序列(序列号1)设 计下述引物序列，使用由Sigma公司通过常规方法的合成法合成的引物。 通过使用该引物进行PCR，能够扩增上述(5)中阐明的编码美洲鲎属G因 子α亚基的序列号1所示碱基序列中的从5’末端起第696位～第1947位 的碱基序列、即编码“序列号2所示的美洲鲎属G因子α亚基的氨基酸序 列的第233位(天冬酰胺)～第649位(缬氨酸)的氨基酸序列”的碱基序列。

引物序列

引物F25’-aatacaccttctcctgttgacg-3’(序列号23)

引物R25’-ctggattaagattacaaaggtt-3’(序列号24)

此外，将具有该美洲鲎属G因子α亚基的第233～649位氨基酸序列 的肽命名为“来源于美洲鲎属G因子α亚基的片段a”。即，“来源于美洲鲎 属G因子α亚基的片段a”具有序列号4所示氨基酸序列。并且，该片段a 的氨基酸序列由序列号3所示碱基序列编码。

为了能够与美洲鲎属G因子α亚基的示意图进行比较，将来源于美洲 鲎属G因子α亚基的片段a的示意图示于图1的下图。即，来源于美洲鲎 属G因子α亚基的片段a具有美洲鲎属G因子α亚基的木聚糖酶A样结 构域(存在2个QQWS基序)、和被认为是βG结合结构域的2聚体的木聚 糖酶Z样结构域(XlnZ)。

PCR在下述反应条件下进行：在98℃加热2分钟之后，将95℃15 秒、63℃30秒、68℃1分钟重复30次，最后68℃5分钟。

PCR反应条件

将所得的PCR产物进行含1μg/mL溴乙锭的1％琼脂糖凝胶电泳，切 下1.3Kbp附近的带部分的凝胶，使用QIAquick Gel Extraction kit(キア ゲン制)从切下的凝胶中纯化PCR产物。

接下来，将pTrcHis2载体(インビトロジエン(株)制)1μL量与所得的 PCR产物4μL混合，用灭菌水制成总量5μL。接下来，在25℃温育5分 钟进行连接反应，制备重组载体。使用该重组载体通过常规方法转化大肠 杆菌K株派生的DH5α感受态细胞株(ニツポンジ一ン(株)制)。将该转化 体在含氨苄青霉素(和光纯药工业(株)制)(100μg/ml)的LB琼脂培养基上、 在37℃培养1天，形成菌落。

通过常规方法从各菌落的转化体中分别提取DNA，使用BaseStation (バイオラツドラボラトリ一ズ(株)制)确认碱基序列。并且，将具有编码序 列号4的氨基酸序列的碱基序列作为阅读框的转化体命名为“来源于美洲 鲎属G因子α亚基的片段a(第233-649位氨基酸)/DH5α”。

(7)来源于美洲鲎属G因子α亚基的片段a(第233-649位氨基酸)的表 达

将作为上述(6)中选择出的转化体的来源于美洲鲎属G因子α亚基的片 段a(第233-649位氨基酸)/DH5α进行前培养过夜。在含100mg/L的氨苄 青霉素的LB培养基1L中接种该培养液(5mL)，在37℃搅拌培养4小时。 在菌体的OD_600nm达到0.8的时刻在培养基中添加最终浓度为1mM的异丙 基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)(和光纯药工业(株)制)，进一步在20℃搅 拌培养48小时。

培养后，将培养液进行离心分离，回收所得的沉淀物(菌体)。将沉淀 物用蒸馏水(大塚制药制)洗涤，然后将菌体用超音波破碎，进行离心分离 (5000g×10分钟)，获得上清级分。

表达出的蛋白质在C末端侧添加了来源于pTrcHis2载体的6个His。 于是，使用Ni-琼脂糖(和光纯药工业(株)制)，依据附带的说明书记载的方 法进行利用Ni-琼脂糖的亲和纯化，从上述所得的上清级分中纯化蛋白质。

(8)来源于美洲鲎属G因子α亚基的片段a(第233-649位氨基酸)的表 达的确认

首先，将上述(7)所纯化的表达蛋白质(重组的来源于美洲鲎属G因子α 亚基的片段a)使用聚丙烯酰胺凝胶(和光纯药工业(株)制)进行SDS-PAGE， 然后使用iBlot(インビトジエン社制)转印至PVDF膜。将PVDF膜用1％ ブロツクエ一ス进行封闭处理，然后使其与用过氧化物酶标记了的抗His 抗体(GEヘルスケアバイオサイエンス社制)在室温反应1小时。将反应后 的PVDF膜用PBS-T(含有聚氧乙烯20失水山梨糖醇单月桂酸酯0.05％) (和光纯药(株)工业制)洗涤3次，然后使用ECLplus(GEヘルスケアバイ オサイエンス社制)使其发光，使X射线胶片(GEヘルスケアバイオサイ エンス制)感光。

另外，使用银染色试剂盒(和光纯药工业制)，依据试剂盒附带的说明 书所记载的方法将SDS-PAGE后的凝胶进行染色。

结果示于图3(a)和(b)。(a)显示进行蛋白质印迹法的结果、(b)显示将 SDS-PAGE后的凝胶进行银染色而得的结果。

另外，在图3(a)中，道(1)是蛋白质分子量标记ドクタ一ウエスタン(オ リエンタル酵母工业(株)制)的结果，道(2)是使用亲和纯化后的片段a作为 样品的情况下的结果。

在图3(b)中，道(1)是蛋白质分子量标记プレシジヨンプラスプロテ インスタンダ一ド(BIO-RAD制)的结果，道(2)是使用亲和纯化后的片段a 作为样品的情况下的结果。

正如由图3(a)的结果明确的那样，检测到了表达出的蛋白质与过氧化 物酶标记抗His抗体反应而得的带(用箭头显示)。

另外，由序列号4所示氨基酸序列推测出的来源于美洲鲎属G因子α 亚基的片段a的分子量为约48kDa。正如由图3(b)的结果可明确的那样， 经SDS-PAGE确认的、与过氧化物酶标记抗His抗体反应而得的带(图3(a)) 的蛋白质的大小为约48kDa，能够在与来源于美洲鲎属G因子α亚基的片 段a的分子量相同的位置确认带。

因此，确认了通过以上的方法表达来源于美洲鲎属G因子α亚基的片 段a(第233-649位氨基酸)，能够获得重组的来源于美洲鲎属G因子α亚基 的片段a。

实施例2.利用各种βG结合性蛋白质的βG的测定

(1)各种βG结合性蛋白质的制备

1)来源于鲎(美洲鲎属)G因子α亚基的片段a

使用实施例1所得的、重组的来源于美洲鲎属G因子α亚基的片段a。

2)来源于蚕的β识别蛋白质(第1-479位氨基酸)的制备

Ochiai M.et al.，J.Biol.Chem.，vol.275，No.7，p.4995-5002(2000)的 Fig.3中记载了来源于蚕的β-1，3-葡聚糖识别蛋白质(β-1，3-glucan  recognition protein)的氨基酸序列和编码该氨基酸序列的基因的碱基序列。 该蛋白质是包含479个氨基酸的蛋白质，由1575bp的碱基序列所编码。 按照上述文献所记载的方法和上述实施例1所述的方法，获得上述文献的 Fig.3所公开的来源于蚕的β-1，3-葡聚糖识别蛋白质(以下，在本说明书中记 载为“来源于蚕的βG识别蛋白质(第1-479位氨基酸)”)。

即，由从蚕幼虫的血细胞获得的提取物纯化mRNA，通过逆转录反应 获得cDNA。使用所得的cDNA作为模板，使用5’-tacgaggcaccaccg-3’(序 列号39)作为F引物，使用5’-gttaaagtttttgcaata-3’(序列号40)作为R引物， 在该文献所记载的条件下进行PCR。将所得的PCR产物进行含1μg/mL 溴乙锭的1％琼脂糖凝胶电泳，切下1.5kbp附近的带部分的凝胶。使用 QIAquick Gel Extraction kit从切下的凝胶中纯化PCR产物。

接下来，使用与实施例1(6)所使用的相同的表达载体(pTrcHis2载体) 进行表达载体的制备、和大肠杆菌K株派生的DH5α感受态细胞株的转化。 然后，用与实施例1(7)相同的方法培养该转化体，使“来源于蚕的βG识别 蛋白质(第1-479位氨基酸)”表达。培养后，用与实施例1(7)同样的方法从 培养液中纯化蛋白质。

3)来源于蚕的βG识别结合蛋白质(第1-454位氨基酸)的制备

Proc.Natl.Acad.Sci.USA vol.93，p.7888-7893(1996)的Fig.3中记载了 来源于蚕的革兰氏阴性菌结合性蛋白质(Gram-negative bacteria-binding  protein)的氨基酸序列和编码该氨基酸序列的碱基序列。该蛋白质是包含 467个氨基酸的蛋白质，由2257bp的碱基序列所编码。由于上述文献中记 载该蛋白质的结构“包含葡聚糖酶样结构域，与G因子α结构域类似”，因 而推测该蛋白质具有与βG结合的性质。

因此，按照上述文献所记载的方法和上述实施例1所述的方法，获得 了Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.93，p.7888-7893(1996)的Fig.3所公开的来 源于蚕的革兰氏阴性菌结合性蛋白质(以下，在本说明书中记为“来源于蚕 的βG识别结合蛋白质(第1-454位氨基酸)”)。

即，由从蚕幼虫的血细胞获得的提取物中纯化mRNA，通过逆转录反 应获得cDNA。使用所得的cDNA作为模板，使用5’-atatcgtacgctcaaatgcc-3’ (序列号41)作为F引物，使用5’-ctttgtcaaagttatcgcctta-3’(序列号42)作为 R引物，在该文献所记载的条件下进行PCR。将所得的PCR产物进行含 1μg/mL溴乙锭的1％琼脂糖凝胶电泳，切下1.5kbp附近的带部分的凝胶。 使用QIAquick Gel Extraction kit从切下的凝胶中纯化PCR产物。

接下来，使用与实施例1(6)中所用的相同的表达载体(pTrcHis2载体) 进行表达载体的制备、和大肠杆菌K株派生的DH5α感受态细胞株的转化。 然后，用与实施例1(7)相同的方法培养该转化体，表达“来源于蚕的βG识 别结合蛋白质(第1-454位氨基酸)”。培养后，用与实施例1(7)同样的方法 从培养液中纯化蛋白质。

4)来源于印度谷螟的βG识别蛋白质(第181-471位氨基酸)的制备

印度谷螟(Plodia interpunctella)的血淋巴(hemolymph)中存在βG识别 蛋白质(β-1，3-glucan recognition protein)。Fabrick J.A.，et al.，Insect  Biochem.Mol.Biol.，vol.33，p.579-594，2003中记载了其氨基酸序列和编码 该氨基酸序列的碱基序列。该蛋白包含471个氨基酸，C末端侧具有葡聚 糖酶样部分(葡聚糖酶样结构域，glucanase-Like domain)(Fabrick J.A.et  al.，J.Biol.Chem.，vol.279，No.25，p.26605-26611，2004、Fig.1)。

因此，按照Fabrick J.A.，et al.，Insect Biochem.Mol.Biol.，vol.33， p.579-594，2003所记载的方法和上述实施例1所述的方法，获得了该印度 谷螟的、包含C末端侧第181位～第471位氨基酸序列的βG识别蛋白质 的葡聚糖酶样部分的蛋白质(以下，在本说明书中记为“来源于印度谷螟的 βG识别蛋白质(第181-471位氨基酸)”)。

即，由从印度谷螟的血淋巴获得的提取物纯化mRNA，通过逆转录反 应获得cDNA。使用所得的cDNA作为模板，使用5’-gaggtcaagtttcctgaag-3’ (序列号43)作为F引物，使用5’-gtcagagtctatgcgctg-3’(序列号44)作为R 引物，在该文献所记载的条件下进行PCR。将所得的PCR产物进行含 1μg/mL溴乙锭的1％琼脂糖凝胶电泳，切下1.5kbp附近的带部分的凝胶。 使用QIAquick Gel Extraction kit从切下的凝胶中纯化PCR产物。

接下来，使用与实施例1(6)中所用的相同的表达载体(pTrcHis2载体) 进行表达载体的制备、和大肠杆菌K株派生的DH5α感受态细胞株的转化。 然后，用与实施例1(7)相同的方法培养该转化体，表达“来源于印度谷螟的 βG识别蛋白质(第181-471位氨基酸)”。培养后，用与实施例1(7)同样的方 法从培养液中纯化蛋白质。

5)其他βG结合性蛋白质的制备

另外，作为βG结合性蛋白质使用下述蛋白质。

·来源于小鼠的Dectin-1(R&D SYSTEMS公司制)

·来源于小鼠的抗(1，3)βG抗体(Biosupplies Australia Pty Ltd制)

(2)βG结合性蛋白质的过氧化物酶标记

使用Peroxidase Labeling Kit-NH2((株)同仁化学研究所制)，依据试 剂盒附带的说明书所记载的方法，将上述(1)所制备的各βG结合性蛋白用 过氧化物酶进行标记。

(3)夹心测定

1)βG结合性蛋白质固定化ELISA用微板的制备

将上述(1)所制备的βG结合性蛋白质分别用50mM MOPS缓冲液(pH 值7.0)调制成5μg/mL，分注到ELISA用微板(Nunk社制)的各孔中各50μL， 在10℃静置16小时，在该微板上固定化各βG结合性蛋白质(作为βG结 合性蛋白质为约250ng/孔)。

接下来，作为用于减少非特异性吸附的封闭操作，将溶解于50mM磷 酸缓冲生理盐水(pH值7.0)的1％ブロツクエ一ス(大日本住友制药(株)制) 溶液在各孔中分别注入0.2ml，在室温静置1小时，然后进行洗涤各孔的 处理。

2)过氧化物酶标记βG结合性蛋白质的制备

将上述(2)所得的过氧化物酶标记βG结合性蛋白质分别用溶解于 50mM磷酸缓冲生理盐水(pH值7.0)的1％ブロツクエ一ス溶液稀释至 8000倍。

3)样品的制备

将β-葡聚糖テストワコ一“β-葡聚糖标准品”(和光纯药工业(株)制)用 溶解于50mM磷酸缓冲生理盐水(pH值7.0)的1％ブロツクエ一ス溶液调 制成香菇多糖换算值为1000pg/mL。使用该调制液作为样品。

4)测定

将上述3)所制备的样品50μL(香菇多糖换算值50pg)添加到上述1)所 制备的βG结合性蛋白质固定化ELISA用微板的各孔中，在37℃反应1 小时。接着，将各孔用PBS-T(和光纯药工业制)洗涤3次。将上述2)所制 备的过氧化物酶标记βG结合性蛋白质(2μg/mL)以每孔50μl分别分注到各 孔中，在37℃反应1小时。将各孔用PBS-T洗涤3次，然后用蒸馏水洗涤 1次，在各孔中分别添加50μL的TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)溶液(和光 纯药工业(株)制)，在25℃反应30分钟。然后，在各孔中分别添加50μL的 反应停止液(1M磷酸溶液)使反应停止。使用Vmax(モレキユラ一デバイ ス社制)测定450nm的吸光度。

此外，使用香菇多糖换算值0pg/mL的样品同样地进行测定，作为空 白值。

(4)结果

将所得的结果示于表3。

表3

OD450nm(×1000)

此外，表3所记载的数值是从所得的450nm的吸光度中减去空白值， 再乘以1000倍所得的值。

另外，在表3中，各标号是使用下述各样品的情况下的结果。

i：来源于蚕的βG识别蛋白质

ii：来源于蚕的βG识别结合蛋白质

iii：来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段a

iv：来源于印度谷螟的βG识别蛋白质

v：来源于小鼠的DectinI

vi：来源于小鼠的抗(1，3)βG抗体

即，例如，在上述表3中，在“固定化于板的蛋白质：iii”且“过氧化物 酶标记了的蛋白质：iii”中的值为“412”的情况，是指“使用固定化有来源于 美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段a的ELISA用微板、与用过氧化物酶标 记了的来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段a进行上述测定，所得的 450nm的吸光度测定值乘以1000倍而得的值为‘412’”。

接下来，将所得的各吸光度测定值除以空白值而得的值S/N比示于下 述表4。

表4

S/N

并且，以表3和表4的结果为基础获得的评价结果示于下述表5。

表5

评价

在表5中，各标号分别表示下述含义。

◎：OD450nm(×1000)为200以上、且S/N为3.0以上

○：OD450nm(×1000)为100以上、且S/N为1.5以上

△：OD450nm(×1000)为50～99、或S/N为1.0以上

×：OD450nm(×1000)为0～49、或S/N为1.0以上

此外，在表5中，使用固定化有来源于小鼠的DectinI的板(v)、和过 氧化物酶标记的来源于小鼠的DectinI(v)两者的测定方法是通过非专利文 献1等而公知的利用2分子Dectin通过夹心法来进行的测定方法。

另一方面，在表5中，使用本发明所涉及的βG结合性蛋白质的βG的 测定方法，是使用固定化有来源于鲎(美洲鲎属)G因子α亚基的片段a的 板(iii)和来源于鲎(美洲鲎属)G因子α亚基的片段a(iii)两者的测定方法。

正如由表5的结果可明确的那样，表3的值为100以上且表4的S/N 比1.5以的组合是使用固定化有来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的a片段 的板(iii)、和来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的a片段(iii)的测定体系。

在作为公知的夹心测定体系的使用2分子Dectin的方法(使用固定化 有Dectin的板、和过氧化物酶标记了的Dectin两者的方法)中，不能获得 良好结果。

以上显示，使用作为本发明的βG结合性蛋白的来源于鲎(美洲鲎属)G 因子α亚基的a片段(iii)的夹心测定体系在βG测定中是有用的。

实施例3.使用来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段的夹心测定1

(1)来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段的设计

以实施例1(5)所得的美洲鲎属鲎G因子α亚基的氨基酸序列(序列号 2)为基础，设计出下述4种来源于美洲鲎属G因子α亚基的片段。此外， 为了能够与美洲鲎属鲎G因子α亚基的示意图进行比较，将各片段的示意 图合并示于图1。

1)来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段a：实施例1所得的片段a。 由序列号3所示碱基序列编码、由序列号4所示氨基酸序列构成。相当于 序列号2所示的美洲鲎属鲎G因子α亚基的氨基酸序列的从N末端起第 233位～第649位的氨基酸序列部分。具有木聚糖酶A样结构域(存在2个 QQWS基序)和2聚体的木聚糖酶Z样结构域(XlnZ)。

2)来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段b：由序列号5所示碱基序 列编码、由序列号6所示氨基酸序列构成。相当于序列号2所示的美洲鲎 属鲎G因子α亚基的氨基酸序列的从N末端起第387位～第649位的氨基 酸序列部分。具有2聚体的木聚糖酶Z样结构域(XlnZ)。

3)来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段c：由序列号7所示碱基序 列编码、由序列号8所示氨基酸序列构成。相当于序列号2所示的美洲鲎 属鲎G因子α亚基的氨基酸序列的从N末端起第524位～第649位的氨基 酸序列部分。具有美洲鲎属G因子α亚基所具有的2聚体的木聚糖酶Z样 结构域(XlnZ)中的C末端侧的一个结构域。

4)来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段d：由序列号9所示碱基序 列编码、由序列号10所示氨基酸序列构成。相当于序列号2所示的美洲鲎 属鲎G因子α亚基的氨基酸序列的从N末端起第233位～第515位的氨基 酸序列部分。具有木聚糖酶A样结构域(存在2个QQWS基序)、和美洲鲎 属G因子α亚基所具有的2聚体的木聚糖酶Z样结构域(XlnZ)中的N末 端侧的一个结构域。

(2)来源于东方鲎属鲎G因子α亚基的片段的设计

以NCBI(美国国家生物技术信息中心，National Center for  Biotechnology Information)数据库所公开的、东方鲎属G因子α亚基的基 因序列(序列号11)为基础，设计出下述4种来源于东方鲎属G因子α亚基 的片段。此外，为了能够与东方鲎属鲎G因子α亚基的示意图进行比较， 将各片段的示意图合并示于图2。

1)来源于东方鲎属鲎G因子α亚基的片段e：由序列号13所示碱基 序列编码、由序列号14所示氨基酸序列构成。相当于序列号12所示的东 方鲎属鲎G因子α亚基的氨基酸序列的从N末端起第299位～第673位的 氨基酸序列部分。具有木聚糖酶A样结构域(存在3个QQWS基序)、和2 聚体的木聚糖酶Z样结构域(XlnZ)。

2)来源于东方鲎属鲎G因子α亚基的片段f：由序列号15所示碱基 序列编码、由序列号16所示氨基酸序列构成。相当于序列号12所示的东 方鲎属鲎G因子α亚基的氨基酸序列的从N末端起第410位～第673位的 氨基酸序列部分。具有2聚体的木聚糖酶Z样结构域(XlnZ)。

3)来源于东方鲎属鲎G因子α亚基的片段g：由序列号17所示碱基 序列编码、由序列号18所示氨基酸序列构成。相当于序列号12所示的东 方鲎属鲎G因子α亚基的氨基酸序列的从N末端起第548位～第673位的 氨基酸序列部分。具有东方鲎属G因子α亚基所具有的2聚体的木聚糖酶 Z样结构域(XlnZ)中的C末端侧的一个结构域。

4)来源于东方鲎属鲎G因子α亚基的片段h：由序列号19所示碱基 序列编码、由序列号20所示氨基酸序列构成。相当于序列号12所示的东 方鲎属鲎G因子α亚基的氨基酸序列的从N末端起第299位～第547位的 氨基酸序列部分。具有木聚糖酶A样结构域(存在3个QQWS基序)、和2 聚体的木聚糖酶Z样结构域(XlnZ)中的N末端侧的一个结构域。

(3)来源于鲎G因子α亚基的片段的表达

根据编码上述(1)和(2)中设计出的各片段的氨基酸序列的各碱基序列， 设计出用于扩增编码各片段的碱基序列的PCR引物。

将各片段的氨基酸序列的序列号、编码该氨基酸的碱基序列的序列号、 和克隆各碱基序列时使用的引物对的碱基序列及其序列号归纳示于下述表 6。

表6

将具有表6所述的碱基序列的各引物委托Sigma公司进行合成。接下 来，除了使用该引物以外，通过与实施例1(6)同样的方法，使用重组载体 美洲鲎属G因子α/pGEM-T作为模板进行PCR。将所得的PCR产物进行 含1μg/mL溴乙锭的1％琼脂糖凝胶电泳，切下1.5kbp附近的带部分的凝 胶。使用QIAquick Gel Extraction kit从切下的凝胶中纯化PCR产物。

接下来，使用与实施例1(6)中所用的相同的表达载体(pTrcHis2载体) 进行表达载体的制备、和大肠杆菌K株派生的DH5α感受态细胞株的转化。 然后，用与实施例1(7)相同的方法培养该转化体，使各片段表达。通过以 上的方法进行各片段的大量生产。

(4)来源于鲎G因子α亚基的片段的过氧化物酶标记

使用Peroxidase Labeling Kit-SH((株)同仁科学研究所制)，依据试剂 盒附带的说明书所记载的方法，将上述(3)所得的来源于美洲鲎属鲎G因子 α亚基的各片段、和来源于东方鲎属鲎G因子α亚基的各片段分别用过氧 化物酶进行标记。

(5)夹心测定

1)来源于鲎G因子α亚基的各片段固定化ELISA用微板的制备

除了使用上述(3)所制备的来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的各片段、 和来源于东方鲎属鲎G因子α亚基的各片段作为βG结合性蛋白质以外， 通过与实施例2(3)1)同样的方法，分别制备固定化有来源于美洲鲎属鲎G 因子α亚基的各片段、或东方鲎属鲎G因子α亚基的各片段的ELISA用 微板。

2)过氧化物酶标记βG结合性蛋白质的制备

将上述(4)所制备的来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的各片段的过氧化 物酶标记物、和来源于东方鲎属鲎G因子α亚基的各片段的过氧化物酶标 记物分别用溶解于50mM磷酸缓冲生理盐水(pH值7.0)的1％ブロツクエ 一ス溶液稀释至8000倍。

3)样品的制备

使用与实施例2(3)3)相同的试剂，通过相同的方法制备样品。

4)测定

将上述3)所制备的样品50μL(香菇多糖换算值50pg)添加到上述1)所 制备的各微板的各孔中。之后通过与实施例2(3)4)同样的方法，使用Vmax (モレキユラ一デバイス社制)来测定450nm的吸光度。

此外，使用香菇多糖换算值为0pg/mL的样品同样地进行测定，作为 空白值。

(6)结果

所得的结果示于表7。

表7

OD450nm(×1000)

NT未试验

表7所记载的数值是从所得的OD450nm的吸光度中减去空白值，再 乘以1000倍所得的值。

另外，在表7中，各标号是使用下述来源于鲎G因子α亚基的片段的 情况下的结果。

a：美洲鲎属鲎G因子α亚基片段a

b：美洲鲎属鲎G因子α亚基片段b

c：美洲鲎属鲎G因子α亚基片段c

d：美洲鲎属鲎G因子α亚基片段d

e：东方鲎属鲎G因子α亚基片段e

f：东方鲎属鲎G因子α亚基片段f

g：东方鲎属鲎G因子α亚基片段g

h：东方鲎属鲎G因子α亚基片段h

表7的数据的读法与表3的情况是同样的。

接下来，将所得的各吸光度测定值除以空白值所得的值S/N比示于下 述表8。

表8

S/N

NT未试验

并且，将基于表7和表8的结果获得的评价结果示于下述表9。

表9

评价

此外，表9中标号表示下述含义。

◎：OD450nm(×1000)为200以上、且S/N为3.0以上

○：OD450nm(×1000)为100以上、且S/N为1.5以上

△：OD450nm(×1000)为50～99、或S/N为1.0以上

×：OD450nm(×1000)为0～49、或S/N为1.0以上

NT：未检测

正如由表9的结果可明确的那样，将固定化于板的片段和过氧化物酶 标记了的片段的组合(固定化于板的片段-过氧化物酶标记了的片段)按照 该片段的来源鲎分类的情况下，可判断使用(美洲鲎属-美洲鲎属)、(美洲鲎 属-东方鲎属)、(东方鲎属-美洲鲎属)和(东方鲎属-东方鲎属)的任一组合进 行测定，都能够进行βG的测定。

另外，正如由表9的结果可明确的那样，通过本实施例的方法测定βG 时，更优选(固定化于板的片段-过氧化物酶标记了的片段)的组合是(片段a- 片段a)、(片段a-片段f)、(片段b-片段a)、(片段b-片段d)、(片段b-片段 f)、(片段e-片段f)和(片段f-片段f)。

另外，在测定所使用的片段中，美洲鲎属鲎G因子α亚基片段a、美 洲鲎属鲎G因子α亚基片段b、东方鲎属鲎G因子α亚基片段e和东方鲎 属鲎G因子α亚基片段f均具有2个(2聚体)木聚糖酶Z样结构域的重复 序列。

另一方面，美洲鲎属鲎G因子α亚基片段c、美洲鲎属鲎G因子α亚 基片段d、东方鲎属鲎G因子α亚基片段g和东方鲎属鲎G因子α亚基片 段h均具有1个(1聚体)木聚糖酶Z样结构域。

因此，在将测定所使用的固定化于板的片段和过氧化物酶标记了的片 段的组合(固定化于板的片段-过氧化物酶标记了的片段)按照该片段所含的 木聚糖酶Z样结构域的结构进行分类的情况下，可判断使用(2聚体-2聚 体)、(2聚体-1聚体)、(1聚体-2聚体)、(1聚体-1聚体)的任一组合进行测 定，都能够进行βG的测定。

另外，这些结果暗示，对于在本次的测定条件下未获得那么好的结果 的一部分组合，如果调整条件也可以测定。

由以上可判断，与测定所使用的片段的来源鲎和木聚糖酶Z样结构域 的结构无关，只要实施使用固定化有本发明所涉及的βG结合性蛋白质1 的板和经标记物质标记的本发明所涉及的βG结合性蛋白质2的夹心测定 体系，就能够进行βG的测定。

实施例4.使用来源于鲎G因子α亚基的片段的夹心测定2

(1)来源于鲎G因子α亚基的片段的制备

1)来源于美洲鲎属G因子α亚基的片段b和来源于东方鲎属G因子 α亚基的片段g的制备

除了作为转化用的大肠杆菌菌株使用由蛋白酶缺陷株B株派生的 BL21(DE3)以外，进行与实施例3(3)同样的方法，表达并纯化来源于美洲 鲎属G因子α亚基的片段b和来源于东方鲎属G因子α亚基的片段g。

2)来源于东方鲎属G因子α亚基的片段g/Cys的制备

设计出在来源于东方鲎属G因子α亚基的片段g(第547氨基酸～第 673氨基酸)的N末端导入了1个半胱氨酸残基的来源于东方鲎属G因子α 亚基的片段g/Cys。接下来，使用具有序列号45所记载的碱基序列 (5’-tgttctaaattaattcaggcag-3’)的引物作为引物F，使用具有序列号36所记 载的碱基序列的引物作为引物R(引物F和引物R委托Sigma公司合成)， 除此以外，进行与实施例3(3)同样的方法，表达并纯化来源于东方鲎属G 因子α亚基的片段g/Cys。

(2)夹心测定

1)βG结合性蛋白质固定化ELISA用微板

使用与实施例3(5)1)所制备的相同的微板。

2)过氧化物酶标记表达片段的制备

使用Peroxidase Labeling Kit-SH，依据试剂盒附带的说明书所记载的 方法将上述(1)所得的各片段进行过氧化物酶标记。

3)样品：使用与实施例2(3)3)相同的试剂，用相同的方法制备样品。

4)测定

将上述3)所制备的样品50μL(香菇多糖换算值50pg)添加到上述(2)1) 所制备的各微板的各孔中。之后，通过与实施例2(3)4)同样的方法，使用 Vmax(モレキユラ一デバイス社制)测定450nm的吸光度。

此外，使用香菇多糖换算值为0pg/mL的样品同样地进行测定，作为 空白值。

(3)结果

所得的结果示于下述表10和表11。

表10显示使用上述(1)1)所得的来源于美洲鲎属G因子α亚基的片段b 的过氧化物酶标记物或来源于东方鲎属G因子α亚基的片段g的过氧化物 酶标记物作为过氧化物酶标记片段的情况下的结果。

表10

另外，表11显示使用上述(1)2)所得的来源于东方鲎属G因子α亚基 的片段g/Cys的过氧化物酶标记物作为过氧化物酶标记片段的情况下的结 果。

表11

将表10和表11的结果与实施例3所得的表9的结果比较可知，在使 用上述(1)1)所得的来源于美洲鲎属G因子α亚基的片段b作为过氧化物酶 标记片段的情况下，即使对于在实施例3中不能进行βG的测定的(固定化 于板的片段-过氧化物酶标记了的片段)的组合是(片段a-片段b)、(片段b- 片段b)、(片段c-片段b)、(片段f-片段b)、(片段g-片段b)的情况，也能够 以充分的灵敏度进行βG的测定。

另外，在使用上述(1)1)所得的来源于东方鲎属G因子α亚基的片段g 作为过氧化物酶标记片段的情况下，即使对于在实施例3中灵敏度不充分 的(片段g-片段g)的情况，也能够以充分的灵敏度进行βG的测定。

而且，在实施例3中，通过(固定化于板的片段-过氧化物酶标记了的 片段)的组合(片段c-片段g)的组合不能进行βG的测定，另外通过(片段b- 片段g)的组合不能以充分的灵敏度进行βG的测定。但是，在使用上述(1)2) 所得的来源于东方鲎属G因子α亚基的片段g/Cys作为过氧化物酶标记片 段的情况下，通过(片段c-片段g/Cys)和(片段b-片段g/Cys)的组合能够以 充分的灵敏度进行βG的测定。

认为其原因如下。即，在实施例3中，G因子α亚基片段的βG结合 结构域中的2个位置的Cys残基部分与过氧化物酶结合。但是，在βG测 定中使标记片段与样品反应时，与片段结合的过氧化物酶抑制了片段与βG 的结合。因而，在本实施例中在片段的N末端导入Cys残基，使其与过氧 化物酶结合。由此，认为过氧化物酶不会抑制片段与βG的结合，能够以 充分的灵敏度进行βG的测定。

如上可知，本实施例所使用的3种过氧化物酶标记片段即使对于实施 例3中不反应的组合也能够进行反应。

实施例5.使用来源于鲎G因子α亚基的片段的夹心测定3

(1)来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段a/Cys的制备

设计出在来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段a的N末端导入有1 个半胱氨酸残基的来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段a/Cys。接下来， 使用具有序列号46所记载的碱基序列(5’-tgtctggattaagattacaaagg-3’)的引 物作为引物F，使用具有序列号24所记载的碱基序列的引物作为引物R(引 物F和引物R委托Sigma公司合成)，除此以外，进行与实施例1(6)～(8) 同样的方法，表达并纯化来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段a/Cys。

(2)来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段a/Cys的过氧化物酶标记

使用Peroxidase Labeling Kit-SH，依据附带的说明书记载的方法将上 述(1)所得的重组的来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段a/Cys用过氧化 物酶标记。

将标记物用溶解于50mM磷酸缓冲生理盐水(pH值7.5)的含酪蛋白的 1％ブロツクエ一ス溶液稀释至8000倍，用于测定。

(3)样品的制备

将作为βG测定用试剂盒的β-葡聚糖テストワコ一所附带的“β-葡聚糖 标准品”(和光纯药工业制)用溶解于50mM PBS(pH值7.5)的0.5％血清白 蛋白稀释，调制成香菇多糖换算值(“βG标准品”所附带的实物说明书记 载：指示值35pg相当于香菇多糖1ng)为1000pg/mL。然后，再用溶解于 50mM磷酸缓冲生理盐水(pH值7)的0.5％血清白蛋白调制成香菇多糖换算 值为0、20、50、100、250、400、500pg/mL。将它们作为样品使用。

(4)来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段b固定化ELISA用微板的 制备

将实施例3所得的重组的来源于美洲鲎属G因子α亚基的片段b用 50mM MOPS缓冲液(pH值7.0)调制成5μg/mL，在ELISA用微板的各孔 中分注各50μL，在10℃静置16小时，从而在该微板上固定化来源于美洲 鲎属鲎G因子α亚基的片段b。

接下来，作为用于减少非特异性吸附的封闭操作，将溶解于50mM磷 酸缓冲生理盐水(pH值7.0)的0.5％血清白蛋白在各孔中分注各0.2ml，在 室温静置1小时，然后对各孔进行洗涤处理。

(5)夹心测定

在上述(4)所制备的微板的各孔中，分别添加上述(3)所制备的各香菇多 糖浓度的样品各50μL，在37℃反应1小时。接着，将各孔用PBS-T(和光 纯药工业制)洗涤3次。将上述(2)所制备的过氧化物酶标记美洲鲎属鲎G 因子α亚基片段a在各孔分注各50μl，在37℃反应1小时。将各孔用PBS-T 洗涤3次。然后用蒸馏水洗涤1次。接着，在各孔中添加TMB溶液(和光 纯药工业制)各50μL，在25℃反应30分钟。然后，在各孔中添加试剂盒的 反应停止液(1M磷酸溶液)各50μL，使反应停止。使用Vmax(モレキユラ 一デバイス社制)测定波长450nm的吸光度。

以所得的测定值为基础，将450nm的吸光度(OD450nm、y轴)相对于 样品中的香菇多糖浓度(换算值、pg/mL、x轴)作图，从而制成标准曲线。

(6)结果

所得的标准曲线示于图4。在图4中，误差棒显示2SD的值。

另外，由测定值通过最小2乘法求得的回归直线方程和相关系数如下。

y＝0.0013x+0.1342

R²＝0.9989

正如由图4可明确的那样，可知在使用本发明所涉及的βG结合性蛋 白质进行βG的测定的情况下，得到了与样品中的βG浓度(香菇多糖浓度 换算值为0～500pg/mL)成比例的、良好的标准曲线，能够用于βG的定量。 特别是确认了，直到香菇多糖浓度的下限为20pg/mL都能够显著地检测。 此外，在用作为测定所使用的βG测定用试剂盒的β-葡聚糖テストワコ一 进行测定的情况下，香菇多糖浓度20pg/mL相当于血中葡聚糖 0.7pg/mL(截止值11pg/mL以下)。

实施例6.来源于鲎G因子α亚基的片段的过氧化物酶样活性的确认

(1)βG结合性蛋白质

使用实施例1所得的重组的来源于美洲鲎属G因子α亚基的片段a、 和实施例3所得的重组的来源于美洲鲎属G因子α亚基的片段b。

此外，如上所述，来源于美洲鲎属G因子α亚基的片段a具有美洲鲎 属G因子α亚基的从N末端起第233位～第649位的氨基酸序列，来源于 美洲鲎属G因子α亚基的片段b具有美洲鲎属G因子α亚基的从N末端 起第387位～第649位的氨基酸序列。即，来源于美洲鲎属G因子α亚基 的片段b与来源于美洲鲎属G因子α亚基的片段a相比，缺失了美洲鲎属 G因子α亚基的从N末端起第233位～第386位的氨基酸序列。

(2)过氧化物酶活性的测定

将上述(1)的βG结合性蛋白质分别用50mM MOPS缓冲液(pH值7.0) 调制成0、3、4、5、6、7μg/mL，在ELISA用微板的各孔中分注各50μL。 在10℃静置16小时，在微板上固定化各βG结合性蛋白质。

接下来，作为用于减少非特异性吸附的封闭操作，在各孔中分注溶解 于50mM磷酸缓冲生理盐水(pH值7.0)的1％ブロツクエ一ス溶液或0.1％ 血清白蛋白各0.2ml，在室温静置1小时，对各孔进行洗涤。

接下来，在各孔中添加TMB溶液(和光纯药工业制)各50μL，在25℃ 反应30分钟。然后，在各孔中添加反应停止液(1M磷酸溶液)各50μL使反 应停止。使用Vmax(モレキユラ一デバイス社制)测定波长450nm的吸光 度。

此外，使用仅含有0.1％血清白蛋白的样品代替βG结合性蛋白质，同 样地进行测定，作为空白值。

(3)结果

所得的结果示于图5。在图5中，各棒分别显示分别使用下述的βG结 合性蛋白质的情况的结果。

  来源于美洲鲎属G因子α亚基的片段a   来源于美洲鲎属G因子α亚基的片段b

正如由图5可明确的那样，来源于美洲鲎属G因子α亚基的片段b在 其浓度为0、3、4、5、6、7μg/mL的范围内不显示过氧化物酶活性。另一 方面，确认了来源于美洲鲎属G因子α亚基的片段a在其浓度为0、3、4、 5、6、7μg/mL的范围内显示依赖于片段a的浓度的过氧化物酶活性。

由以上结果可认为，美洲鲎属G因子α亚基片段的从N末端起第233 位～第386位的氨基酸序列对于具有过氧化物酶活性是必需的。

实施例7.金属离子参与来源于美洲鲎属G因子α亚基的片段a的过 氧化物酶活性

(1)过氧化物酶活性的测定

在实施例1所得的重组的来源于美洲鲎属G因子α亚基的片段a的 10μg/mL溶液(50mM MOPS缓冲液(pH值7.0))中，混合乙二胺四乙酸· 2Na(EDTA)使其终浓度为70m，或者混合NaN₃使其终浓度为0.05％，在 25℃温育1小时。作为对照，制备不含这些金属螯合剂的来源于美洲鲎属 G因子α亚基的片段a的10μg/mL溶液。

接下来，将温育后的各溶液用50mM MOPS缓冲液(pH值7.0)调制成 来源于美洲鲎属G因子α亚基的片段a为5μg/mL，在ELISA用微板的各 孔中分注各50μL，在10℃静置12小时～20小时使其固定化。作为用于减 少非特异性吸附的封闭操作，在各孔分注溶解于50mM磷酸缓冲生理盐水 (pH值7.0)的1％ブロツクエ一ス溶液或0.1％血清白蛋白各0.2ml，在室 温静置1小时，对各孔进行洗涤。

在各孔中添加TMB溶液(和光纯药工业制)各50μL，在25℃反应30 分钟。然后，在各孔中添加反应停止液(1M磷酸溶液)各50μL，使用Vmax (モレキユラ一デバイス社制)测定波长450nm的吸光度。

(2)结果

所得的结果示于图6。

正如由图6可明确的那样，可以确认，对于来源于美洲鲎属G因子α 亚基的片段a，如果存在作为金属螯合剂的EDTA或NaN₃，则来源于美洲 鲎属G因子α亚基的片段a的过氧化物酶活性丧失。由该结果认为，美洲 鲎属G获得过氧化物酶活性需要金属离子参与。

实施例8.使用来源于鲎G因子α亚基的片段的夹心测定4

(1)来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段a/Cys的制备

设计出在来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段a的N末端导入了1 个半胱氨酸残基的来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段a/Cys。接下来， 使用具有序列号46所记载的碱基序列(5’-tgtctggattaagattacaaagg-3’)的引 物作为引物F，使用具有序列号24所记载的碱基序列的引物作为引物R(引 物F和引物R委托Sigma公司合成)，除此以外，进行与实施例1(6)～(8) 同样的方法，表达并纯化来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段a/Cys。

(2)来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段a的DNA标记

(i)标记用的250bp DNA片段的制备

委托Sigma公司合成引物1(5’-gcctagcaaactcggaagatt-3’、序列号47)、 和预先在5’末端导入了C6氨基连接物(C6amino linker)(Sigma公司制) 的引物2(碱基序列5’-atctatgactgtacgccaatgtccctag-3’、序列号48)。使用该 引物对，使用λDNA(株式会社日本ジ一ン制)作为模板进行PCR，制备在 一个末端具有C6氨基连接物的250bp DNA片段。通过DEAE离子交换色 谱和异丙醇沉淀来纯化该PCR产物，获得标记用250bp DNA片段。

(ii)250bp DNA片段和来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段a的结 合

通过EMCS附带说明书记载的方法使被导入DNA片段的C6氨基连 接物的NH₂基与N-(ε-马来酰亚胺基己酰氧基)琥珀酰亚胺酯(EMCS)连接 物(サ一モフイシヤ一社制)进行反应，然后进行凝胶过滤处理，除去未反 应的EMCS连接物而获得结合了EMCS连接物的DNA片段。通过EMCS 附带说明书记载的方法使该EMCS连接物结合DNA片段与上述(1)的片段 a反应。通过DEAE离子交换色谱和凝胶过滤色谱纯化所得的反应物，获 得来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段a的DNA标记物。

(3)来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段a/Cys的荧光标记

使用HiLyte Fluor 647C2maleimide(AnaSpec，Inc.制)，依据附带的说 明书记载的方法，将上述(1)所得的片段a/Cys用HiLyte Fluor 647进行荧 光标记。

(4)βG样品的制备

将作为βG测定用试剂盒的β-葡聚糖テストワコ一所附带的“β-葡聚糖 标准品”(和光纯药工业制)，用试剂盒附带的β-葡聚糖标准溶解液溶解，制 成标准液(原液)。进一步用试剂盒附带的β-葡聚糖标准溶解液稀释制备成 香菇多糖换算浓度为0、25、50、100、200、400、800pg/mL。使用它们作 为样品。

(5)利用毛细管电泳法的夹心测定

1)毛细管芯片

按照“微科学芯片的技术与应用(マイクロ科学チツプの技術と応用)” 185～217页[北森武彦等，2004年出版(丸善株式会社)]所记载的方法，如 下制作具有图7所示的草图的毛细管芯片。

即，在成膜于石英基板上的Si上成膜出光致抗蚀剂膜。对该光致抗蚀 剂使用具有图7所示毛细管设计(草图)的掩模进行曝光，再进行显影。将 通过显影被除去了光致抗蚀剂的部分的Si通过溅蚀除去，然后使用氟化氢 溶液进行湿蚀刻，在石英基板上制作毛细管通道沟槽(细管)。除去残留在 石英基板上的光致抗蚀剂和Si膜，然后将该石英基板与具有对各种孔导入 或排出各种试剂类用的孔的盖板通过HF接合法贴合，从而制作毛细管芯 片。

此外，图7中，L1和L2表示上样缓冲液导入用孔，R1表示拖尾缓冲 液(trailing buffer)导入用孔，S表示电泳用样品导入用孔，W1和W2表示 排液用孔。另外，图中的L1-R1之间为6.3cm、L1-L2之间为2.8cm。

2)电泳用样品

使用上述(2)所得的来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段a/Cys的 DNA标记物、和上述(3)所得的来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段 a/Cys的荧光标记物，调制以下组成的反应用试液。

25nM来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段a/Cys的DNA标记物

6nM来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段a/Cys的荧光标记物

150mM BisTris

100mM氯化镁

0.56％pDMA22(聚(N，N-二甲基丙烯酰胺))

3.33％甘油

0.056％Tween20

0.01％BSA

1％肝素锂

将pH值调整为7.0

将该反应用试液45μL与上述(4)所制备的βG样品5μL在室温混合1 分钟，将样品中的βG与来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段a/Cys的 DNA标记物、以及与来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段a/Cys的荧 光标记物反应的产物作为电泳用样品。

3)电泳用试液

a)拖尾缓冲液：含有75mM Tris碱、0.5％pDMA 22、3％甘油、0.05％ Tween20、0.01％BSA的125mM HEPES

b)上样缓冲液：含有50mM NaCl、0.5％pDMA22、3％甘油、0.05％ Tween20、0.01％BSA、1％Heparin Li的75mM Tris-HCl(pH值8.0)

4)电泳用样品和试液的导入

在图7的S孔(电泳用样品导入用孔)中滴加上述2)所得的电泳用样品 10μL，在R1孔(试液导入用孔)中滴加拖尾缓冲液10μL，在L1孔和L2孔 中滴加上样缓冲液10μL，在W1(排液用孔)-W2(排液用孔)之间施加100秒、 -5psi的压力，将电泳用样品和上样缓冲液导入通道。

5)浓缩、分离、检测

在图7的R1孔-L1孔之间施加2500V的电压，在30℃一边沿R1→L1 方向使电泳用样品浓缩一边进行电泳。通过监视L1孔-L2孔之间的电压来 确认通过L2通道与主通道的交叉部分，在通过的情况下，在L2孔-L1孔 之间施加1500V的电压120秒，沿L2→L1方向进行电泳，使该样品中的 未反应的来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段a/Cys的荧光标记物、与 样品中的βG、来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段a/Cys的DNA标记 物和来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段a/Cys的荧光标记物的复合体 分离，检测该复合体量。

此外，检测如下进行，在从L2通道交叉部分到距离L12cm的毛细管 部分，使用荧光显微镜(BX-50；KSオリンパス(株)制)，通过650nm激光 激发经时地测定荧光强度。

基于该结果，将该复合体的荧光强度的时间积分值(经时地监视荧光强 度，将该峰的部分对时间积分而得的值，y轴)相对于样品中的香菇多糖浓 度(换算值、pg/mL、x轴)作图，制成标准曲线。

(6)结果

所得的标准曲线示于图8。在图8中，误差棒显示2SD。

另外，由测定值通过最小2乘法求得的回归直线方程和相关系数如下。

y＝0.0370x+5.1

R²＝0.9999

正如由图8可明确的那样，可知在使用本发明所涉及的βG结合性蛋 白质进行βG的测定的情况下，能获得与样品中的βG浓度(香菇多糖浓度 换算值为0～800pg/mL)成比例的良好的标准曲线，可以用于βG的定量。 特别是可以确认在直到香菇多糖浓度浓度的下限为50pg/mL的范围内都可 以显著地检测。此外，在通过作为测定所使用的βG测定用试剂盒的βGテ ストワコ一进行测定的情况下，香菇多糖浓度50pg/mL相当于血中葡聚糖 1.75pg/mL(截止值11pg/mL)。

实施例9.使用来源于鲎G因子α亚基的片段的夹心测定5

(1)来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段a/Cys

使用实施例8所得的重组的来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段 a/Cys。

(2)来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段a/Cys的过氧化物酶标记

使用Peroxidase Labeling Kit-SH，依据附带的说明书记载的方法，将 上述(1)的重组的来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段a/Cys用过氧化物 酶标记。

将标记产物用溶解于50mM磷酸缓冲生理盐水(pH值7.5)的含酪蛋白 的1％ブロツクエ一ス溶液稀释至8000倍，用于测定。

(3)血浆样品的制备

将人血浆用50mM PBS(pH值7.5，含有0.5％血清白蛋白)稀释至10 倍，将其半量在70℃、在温浴中加热处理(前处理)10分钟。

分别使用经前处理的血浆、未经前处理的血浆作为血浆样品。

(4)来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段a固定化ELISA用微板的 制备

将实施例1所得的重组的来源于美洲鲎属G因子α亚基的片段a用 50mM MOPS缓冲液(pH值7.0)调制成5μg/mL，在ELISA用微板的各孔 中分注各50μL，在10℃静置16小时，在该微板上固定化来源于美洲鲎属 鲎G因子α亚基的片段a。

接下来，作为用于减少非特异性吸附的封闭操作，在各孔中分注溶解 于50mM磷酸缓冲生理盐水(pH值7.0)的0.5％血清白蛋白各0.2ml，在室 温静置1小时，然后对各孔进行洗涤处理。

(5)夹心测定

在上述(4)所制备的微板的各孔中分别添加上述(3)所制备的血浆样品 各50μL，在37℃反应1小时。接着，将各孔用PBS-T(和光纯药工业制)洗 涤3次。在各孔中分注上述(1)所制备的过氧化物酶标记美洲鲎属鲎G因子 α亚基片段a各50μl，在37℃反应1小时。将各孔用PBS-T洗涤3次，然 后用蒸馏水洗涤1次。接着，在各孔中添加TMB溶液(和光纯药工业制) 各50μL，在25℃反应30分钟。然后，在各孔中分别添加反应停止液(1M 磷酸溶液)50μL，使反应停止。使用Vmax(モレキユラ一デバイス社制) 测定波长450nm的吸光度。

另外对β-葡聚糖标准品使用通过实施例5(3)的方法所制备的样品同样 地进行测定，制成标准曲线。

将使用血浆样品获得的吸光度值代入该标准曲线，计算出血浆样品中 的βG量。

此外，为了确认本发明的测定方法的性能，通过常规方法进行添加回 收试验。即，使用在βG阴性的人血浆中加入适当量的βG而得的血浆样品， 通过本实施例的方法进行βG的测定。其结果是添加回收率为72.8～ 93.9％，显示良好的回收率。

另外确认了利用本实施例的方法的βG测定方法不受血浆中所含的肝 素的影响。

(6)结果

所得的结果示于表12。

比较例1.

(1)血浆样品

使用在实施例9中使用的、经前处理的血浆样品。

(2)βG浓度的测定

对于上述(1)的血浆样品的βG浓度，使用作为βG测定用试剂盒的市 售的β-葡聚糖テストワコ一(和光纯药工业(株)制)，按照该试剂盒的小册 子所记载的操作法，根据比浊时间分析法的常规方法，如下进行βG的测 定。

即，将经前处理的血浆样品200μL添加到试剂盒的美洲鲎属试剂(冻结 干燥品。含有鲎血细胞提取物(AL))中，用涡流混合器搅拌数秒，然后在 37℃保温下使用トキシノメ一タ一MT-5500(和光纯药工业(株)制)，测定上 述混合液的透射光量从测定开始到减少5％的时间(以下，简记为Tg)。另 外，使用蒸馏水和浓度已知的βG溶液进行同样的测定，制成表示βG浓度 与Tg的关系的标准曲线。基于该标准曲线计算出样品中的βG的浓度。

(3)结果

所得的结果合并示于表12。

表12

现有的使用鲎血细胞提取物的βG的测定方法是利用蛋白质分解酶级 联的方法，但血液样品中所含的蛋白酶会抑制该级联。因此，为了使用现 有的鲎血细胞提取物进行βG的测定，需要将血液样品进行加热处理、从 而预先使血液样品中的酶失活的前处理。

在实施例9中，通过本发明的夹心ELISA法来测定经前处理的血浆样 品与未经前处理的血浆样品中的βG含量。其结果如从表12可明确的那样， 使用未经前处理的血浆样品测定出的βG浓度与使用经前处理的血浆样品 测定出的βG浓度近似。而且该值与通过使用现有的鲎血细胞提取物测定 经前处理的血浆样品中的βG浓度的测定方法测得的βG浓度(比较例1)也 近似。

由此可判断，如果进行本发明的βG测定方法，则可以在不进行样品 的前处理的条件下进行βG的测定。另外，以上的结果暗示，本发明的βG 的测定方法可以成为用于检测临床样品中的βG的新检测体系。

实施例10.通过本发明的夹心测定方法和使用现有的鲎血细胞提取物 的测定方法测定的血浆βG值的相关

(1)本发明的夹心测定

1)过氧化物酶标记的来源于美洲鲎属G因子α亚基的片段a/Cys

使用实施例9所制备的过氧化物酶标记的来源于美洲鲎属G因子α亚 基的片段a/Cys。

2)来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段a固定化ELISA用微板

使用实施例9所制备的来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段a固定 化ELISA用微板。

3)血浆样品的制备

使用在使用市售的β-葡聚糖テストワコ一(和光纯药工业(株))的测定 中确认了βG浓度为截止辞意下的人血浆(N＝50)，通过与实施例9相同的 方法进行前处理，然后作为血浆样品。

4)夹心测定

使用与实施例9相同的仪器，在同样的测定条件进行测定，计算出血 浆样品中的βG量。

(2)使用鲎血细胞提取物的测定(比浊时间分析法)

除了使用与上述(1)3)相同的血浆样品以外，通过与比较例1同样的方 法计算出血浆样品中的βG量。

(3)结果

将通过本发明的夹心测定方法获得的βG浓度(本发明的βG测定方 法)、与使用市售的试剂盒使用现有的鲎血细胞提取物的测定方法获得的 βG浓度(现有的测定方法)的相关图示于图9。

对图9的结果进行回归分析，所得的回归直线方程与相关系数如下。

y＝0.506x+6.248

R＝0.933

正如由以上的结果可明确的那样，可判断通过本发明βG测定方法获 得的βG浓度与通过使用现有的鲎血细胞提取物的测定方法获得的βG浓度 显示良好的相关关系。以上的结果暗示，本发明的βG的测定方法可以成 为用于检测临床样品中的βG的新的检测系统。

实施例11.使用来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段的夹心测定6

(1)过氧化物酶标记的来源于美洲鲎属G因子α亚基的片段a/Cys

使用实施例9所制备的过氧化物酶标记的来源于美洲鲎属G因子α亚 基的片段a/Cys。

(2)来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段b固定化ELISA用微板

使用实施例5(4)所制备的来源于美洲鲎属鲎G因子α亚基的片段b固 定化ELISA用微板。

(3)βG样品的制备

将作为βG测定用试剂盒的β-葡聚糖テストワコ一所附带的“β-葡聚糖 标准品”(和光纯药工业制)，用试剂盒附带的β-葡聚糖标准溶解液溶解，制 备标准液(原液)。进一步用试剂盒附带的β-葡聚糖标准溶解液稀释，调制 成香菇多糖换算浓度为0、1、5、10、17、50、100pg/mL。使用它们作为 样品。

(4)夹心测定

在上述(2)的微板的各孔中分别添加上述(3)所制备的样品各50μL，在 37℃反应1小时。接着，将各孔用PBS-T(和光纯药工业制)洗涤3次。在 各孔中分注上述(1)的过氧化物酶标记的美洲鲎属鲎G因子α亚基a/Cys各 50μl，在37℃反应1小时。将各孔用PBS-T洗涤3次，然后用蒸馏水洗涤 1次。接着，加入SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo scientific制)，按照试剂盒附带的操作说明书使其反应。

使用Ultra Evolution(TECAN Group Ltd.制)测定发光量(cps，每秒计 数，count per second)。

(5)结果

结果示于图10。在图10中，误差棒显示1SD的值。

正如由图10可明确的那样，在使用本发明所涉及的βG结合性蛋白质 通过荧光测定进行βG的测定的情况下，直到香菇多糖浓度的下限为 1pg/mL的范围内都可以显著地检测。

另外，在使用作为市售的βG测定用试剂盒的βGテストワコ一进行测 定时，血中葡聚糖截止值为11pg/mL。已知香菇多糖1pg相当于葡聚糖 0.035pg。在本实施例中，能够检测的香菇多糖浓度的下限为1pg/mL，即 使考虑样品稀释倍率也能够测定低于市售的βG测定用试剂盒的截止值的 浓度，即，判断能够以极高灵敏度测定βG。

认为这是由于，与实施例4的情况同样，通过将导入了Cys的片段a 进行过氧化物酶标记，在与片段a结合的过氧化物酶和片段a中的βG结 合部位之间产生距离，从而使得过氧化物酶不抑制片段与βG的结合，从 而能够以充分的灵敏度进行βG的测定。

产业可利用性

本发明的βG测定方法可以利用重组体βG结合性蛋白质，无需使用天 然原料，所以不存在试剂产生的批间允差，可以实现能够以一定且高的测 定灵敏度特异性地测定βG这样的效果。

附图标记说明

L1、L2 上样缓冲液导入用孔

R1     拖尾缓冲液导入用孔

S      电泳用样品导入用孔

W1、W2 排液用孔