一种表达Nectin-1基因胞外区片段的PK-15细胞系及其构建方法

摘要

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种表达Nectin-1基因胞外区片段的PK-15细胞系PK15-nectin-1-ecto的构建。将猪肝脏组织中的Nectin-1胞外区完整编码区序列克隆到慢病毒核心载体pLenti-7.3CA质粒，成功构建了pLenti7.3CA-nectin-1-ecto重组质粒，将重组质粒和另外三个辅助质粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG共同转染包装细胞人胚肾细胞293FT，获得HIV慢病毒粒子，将慢病毒粒子用低速离心的方法转导PK-15细胞，得到能够稳定表达猪pLenti7.3CA-nectin-1-ecto的PK-15细胞系PK15-nectin-1-ecto。PK15-nectin-1-ecto细胞系含有Nectin-1基因胞外区片段，该细胞系获得抗伪狂犬病毒的能力。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域。具体涉及一种包含α疱疹病毒的受体蛋白Nectin-1胞外区基因的重组质粒pLenti7.3CA-nectin-1-ecto的构建，以及表达Nectin-1基因胞外区可溶性片段的猪肾传代细胞PK-15细胞系PK15-nectin-1-ecto的构建。 

背景技术

伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PRV)又称猪疱疹病毒1型、传染性延髓麻痹病毒、奥叶兹基氏病病毒、奇痒症病毒。是引起猪、牛、羊、犬和猫等多种家畜和野生动物发热、奇痒(猪除外)及脑脊髓炎为主要症状的疱疹病毒。伪狂犬病毒是一种猪疱疹病毒，属于α-疱疹病毒亚科，病毒粒子直径约为110-150nm，具有典型的疱疹病毒的病毒粒子结构，衣壳壳粒的长度约12nm，宽9nm，位于胞浆内带囊膜的成熟PRV病毒粒子的直径约150-180nm，其空心部分的直径约4nm。 

伪狂犬病在世界范围内皆有爆发的案例，并对这些国家产生过巨大的经济损失。在二十世纪六十年代PRV在美国大面积爆发。这次爆发的时间与猪类产品生产的高强度和猪棚中高密度的养殖有惊人的一致性。在猪身上增收的赋税更加促进了PRV的传播。2003年，记录在案的PRV爆发的国家包括(按字母顺序排列)：白俄罗斯、巴西、古巴、法国、匈牙利、意大利、墨西哥、巴拿马、波兰、葡萄牙、罗马利亚、俄罗斯、斯洛伐克、斯洛文利亚、台湾和乌克兰。由于墨西哥与美国接壤，墨西哥爆发的PRV对美国造成了较大影响。 

PRV的起始复制发生在鼻内和口腔黏膜。PRV趋向于感染猪的呼吸和神经系统组织，病毒颗粒进入感官神经末端刺激对黏膜上皮细胞的感染。PRV感染的发病率和致死率随着猪年龄、动物的整体健康状态、病毒株和感染剂量的不同而变化。PRV感染的小猪反应最严重，表现出典型的中枢神经感染症状，未断奶仔猪的伪狂犬病致死率非常高，接近100％；而成年猪则表现出呼吸系统症状，发病的动物将变得瘦弱，体重急剧下降，给养殖业带来经济损失；如果感染发生在怀孕母猪妊娠的第一和第二个月，感染通常造成流产、死婴或出生后48小时就会死亡的弱胎。 

目前世界各地包括我国在内，广泛使用带有gE基因缺失的表型特征疫苗来控制和预防此病。而疫苗本身就可能会使动物产生潜伏感染。若要是能够从动物自身的角度出发，培育出具有抗伪狂犬病的转基因动物，无疑对养殖业来说，是划时代的进步。 

Nectin-1基因是α疱疹病毒的受体，介导伪狂犬病毒进入猪的上皮细胞和神经细胞。gD糖蛋白是PRV病毒吸附和入侵靶细胞过程中重要的蛋白质，它与病毒穿透，进入宿主细胞有 关。Nectin-1的N端有一个类似免疫球蛋白的结构域，该结构域与伪狂犬病毒糖蛋白基因gD结合，进而导致病毒囊膜与细胞膜融合，核衣壳进入细胞，造成机体感染发病。转基因动物表达Nectin-1基因胞外区可溶性的片段，在伪狂犬病毒感染细胞前先与gD基因竞争性结合，阻断gD基因与细胞上的Nectin-1基因受体相结合，达到阻止伪狂犬病毒感染细胞的目的，从而增强转基因动物抗伪狂犬病的能力。日本科学家Ono E在2004年利用α疱疹病毒的受体蛋白Nectin-1基因，运用转基因技术成功获得了能够表达Nectin-1基因的转基因小鼠，该小鼠在后期的试验中显示具有良好的抗α疱疹病毒的能力。 

目前常用的动物转基因技术有原核显微注射法、逆转录病毒感染法、精子载体法、体细胞核移植法、精原干细胞介导的基因转移法。这几种方法的差异见表1。 

表1常用的5种转基因技术的比较 

慢病毒(Lentivirus，LV)是逆转录病毒科中的一个属，慢病毒分为如下五类：灵长类慢病毒(如HIV-1和HIV-2)，非灵长类慢病毒、牛免疫缺陷病毒、猴免疫缺陷病毒、马传染性贫血病毒等。慢病毒除了具有一般逆转录病毒gag、pol和env 3个基本基因结构外，还包含4个辅助基因：vif、vpr、nef、vpu和2个调节基因tat和rev。 

慢病毒载体的构建原理就是将HIV-1型基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重 复序列)和编码反式作用蛋白的基因序列分别构建在不同的载体上。由此，载体系统由包装成分和载体成分组成：包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白；载体成分与包装成分互补，含有包装、逆转录和整合所需的HIV-1顺式作用序列，同时还含有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。慢病毒不产生任何有效的细胞免疫应答，可作为一种体外基因运输的工具。因而，非功能型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)已经被开发为一种类慢病毒载体。 

慢病毒系统的构成结构中，gag基因编码病毒的核心蛋白和衣壳蛋白，pol基因编码病毒复制所需的酶类，env基因编码病毒的包膜糖蛋白，决定病毒感染宿主的靶向性，tat及rev基因编码的蛋白分别在转录及转录后对病毒基因表达进行调控，vpu参与病毒颗粒的组装。gag编码的基质蛋白、pol编码的整合酶和vpr辅助蛋白形成整合前复合物，本身具有核定位信号，有利于整合前复合物进入靶细胞核，而不完全依赖靶细胞的分裂状态，因此为慢病毒可感染非分裂细胞的主要机制。因为长末端序列中敲除了带有启动子功能的U3区域，在感染宿主细胞的过程中释放到细胞内的RNA并不编码感染性病毒所需的包装蛋白，所以新的病毒颗粒不会产生，这种病毒被称为复制缺陷型病毒。 

目前慢病毒系统主要分为二质粒表达系统、三质粒表达系统和四质粒表达系统三大系统。本发明主要运用慢病毒载体四质粒表达系统。四质粒系统(图1)是慢病毒系统中最安全的系统。第2代系统是以自身失活(SIN)的慢病毒载体为代表，删除了U3区的3’LTR，在载体逆转录时生成的5’LTR因缺乏HIV-1增强子及启动子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA，因此该载体系统更加安全，为了进一步减少RCV的可能性，避免HIV-1型基因组包装结构的序列同源性，将辅助基因去除。但由于gag-pol的转运需要rev，因此，在上述的三质粒系统的基础上，构建成四质粒表达系统，该系统加上含rev的质粒，减少了产生RCV的可能性，而且对非分裂期细胞转导效率无影响。 

四质粒系统又经过一系列改进，现在第三代系统称为可调控慢病毒载体系统，将包膜蛋白换成水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)，应用VSV-G包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体及病毒颗粒的稳定性，允许通过高速离心对载体进行浓缩，提高了滴度。 

逆转录病毒法制备转基因动物，由于其具有胚胎和胎儿存活率高、技术要求相对较低、不易出现基因沉默现象等优点，被大家广泛运用于转基因动物生产中。在众多逆转录病毒载体中，HIV慢病毒载体属于最为常用的一种载体。HIV慢病毒载体与其它逆转录病毒载体不同，它不但感染分裂细胞，也感染静止细胞；由于病毒载体经改构后，不在宿主细胞繁殖，不会导致寄主细胞的死亡。而293FT细胞由于其具有高效的转染效果，也被常用做制备慢病毒粒 子的包装细胞。 

目前尚未见采用慢病毒四质粒系统表达Nectin-1基因胞外区片段的相关报道。 

发明内容

本发明的目的是在大肠杆菌和哺乳动物细胞表达体系中克隆和表达Nectin-1胞外区的基因，构建包含Nectin-1胞外区基因的重组质粒pLenti7.3CA-nectin-1-ecto和慢病毒转导法所获得的Nectin-1胞外区基因的PK-15细胞系PK15-nectin-1-ecto，为深入研究这种受体蛋白的转基因动物试验提供了依据。 

本发明的技术方案是： 

本发明采用生物信息学结合RT-PCR的方法将猪肝脏组织中的Nectin-1胞外区完整编码区序列克隆到慢病毒核心载体pLenti-7.3CA质粒，成功构建了pLenti7.3CA-nectin-1-ecto重组质粒。用携带有外源目的基因Nectin-1胞外区完整编码区序列的质粒pLenti7.3CA-nectin-1-ecto和另外三个辅助质粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG共同转染制备慢病毒粒子的包装细胞人胚肾细胞293FT。在包装细胞293FT中装配4种HIV慢病毒后，4种病毒粒子被分泌到细胞上清中。收集细胞上清、超离获得HIV慢病毒粒子。将超离获得慢病毒粒子按照一定浓度，用低速离心的方法转导PK-15细胞，得到能够稳定表达猪pLenti7.3CA-nectin-1-ecto的PK-15细胞系，为今后转基因动物的培育以及相关研究奠定基础。 

本发明设计人将获得的重组质粒pLenti7.3CA-nectin-1-ecto其培养物于2011年6月14日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2011198，保藏命名为：Escherichia coli pLenti7.3CA-nectin-1-ecto。 

本发明设计人将获得的能够稳定表达猪pLenti7.3CA-nectin-1-ecto的PK-15细胞系于2011年6月16日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：C201134，保藏命名为：猪肾细胞PK15-nectin-1-ecto。 

本发明的主要优点是： 

1、本发明构建了重组质粒pLenti7.3CA-nectin-1-ecto，该质粒含有Nectin-1胞外区完整编码区序列，可以阻止伪狂犬病毒感染细胞。 

2、本发明通过慢病毒转导法得到稳定表达Nectin-1胞外区的基因的PK-15细胞系，该细胞系能够应用于抑制伪狂犬病毒在PK-15细胞上增殖，为后续转基因猪的研究奠定了基础。 

附图说明

图1：是Nectin-1基因转基因动物抗伪狂犬病毒的原理示意图。 

图2：是慢病毒载体系统四质粒模式图。 

图3：是扩增的Nectin-1基因完整的编码产物，图中泳道M：DL2000DNA molecular marker； 泳道1、2：Nectin-1完整的编码产物。 

图4：是运用TMHMM Server 2.0软件对Nectin-1基因成熟蛋白做出的跨膜区预测。 

图5：是扩增的Nectin-1胞外区片段，图中泳道M：DL2000DNA molecular marker；泳道1：扩增的Nectin-1胞外区片段。 

图6：是构建的pGEX-6p-1-nectin-1-ecto原核表达质粒的双酶切鉴定，图中泳道M：DL5000DNA molecular marker；泳道1-4：pGEX-6p-1-nectin-1-ecto用BamH I、Xho I双酶切鉴定结果。 

图7：是使用的原核表达载体pCA结构图。 

图8：是构建的重组质粒pLenti7.3CA-nectin-1-ecto及其辅助质粒共转染293FT细胞，图中A：转染72小时后293FT细胞在常光和荧光下(×10)；B：转染72小时后293FT细胞在荧光下(×10)；C：转染72小时后293FT细胞在荧光下(×20)；D：转染72小时后293FT细胞在荧光下(×40)。 

图9：是获得的慢病毒粒子转导PK-15细胞系，图中A：转导的PK-15细胞在常光和荧光下(×10)；图中B：转导的PK-15细胞在荧光下(×10)；图中C：转导的PK-15细胞在荧光下(×20)；图中D：转导的PK-15细胞在荧光下(×40)。 

图10：是构建的PK15-nectin-1-ecto细胞系抑制病毒增殖实验分析，图中“*”表示差异显著，“**”表示差异极显著。 

图11：是构建的PK15-nectin-1-ecto细胞系和PK-15两种细胞系一步法增殖曲线实验。 

具体实施方式

以下结合说明书附图和实施例对本发明做进一步的说明，但不是限制本发明。 

实施例1猪Nectin-1的克隆、测序及序列分析 

1.猪Nectin-1的RT-PCR扩增 

参照GenBank上猪Nectin-1基因序列(登录号AF308632)，设计1对引物Nectin-1P₁/Nectin-1P₂(见表2)，以从猪肝脏组织中用Trizol(购自Invitrogen)提取总RNA，用反转录试剂盒(购自大连宝生物公司)将RNA反转录成cDNA。以反转录的cDNA为扩增模板，扩增出猪Nectin-1完整编码区序列。扩增结果是获得大小约1548bp的特异性条带，片段大小与预期结果一致(图3)。 

表2本发明所用的引物 

表注：有下划线部分标示酶切位点，斜体加粗序列标示His标签。 

2.猪Nectin-1序列测定及分析 

利用综合性序列分析软件DNAStar对测序结果进行拼接得到全长为1548bp的片段，编码515个氨基酸，包括编码31个氨基酸的信号肽。预测蛋白的分子质量为57.05ku，等电点为5.82，信号肽最可能的切割位点是在31和32个氨基酸之间。氨基酸序列可能存在3个N-糖基化位点和7个半胱氨酸残基，这2个N-糖基化位点和7个半胱氨酸残基都有很高的保守性。将扩增到的Nectin-1与GenBank上登录的Nectin-1序列比对后发现在其开放阅读框(ORF)内第579位和第714位发生突变，分别是由G突变为C和由G突变为A，但未引起氨基酸的改变，两者相似性为99.7％。 

3.跨膜区预测 

运用在线软件TMHMM Server 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm/)对猪Nectin-1成熟蛋白预测结果发现，猪Nectin-1基因编码的蛋白质分子可能由胞外区(36-354位氨基酸)、跨膜区(13-35和355-377位氨基酸)和胞浆区(1-12和378-515位氨基酸)3部分组成(图4)，因此猪Nectin-1受体蛋白应该是一种跨膜蛋白。 

实施例2猪Nectin-1胞外区在大肠杆菌中的表达 

1.猪Nectin-1胞外区的PCR扩增和pMD-18-nectin-1-ecto的构建 

参照猪Nectin-1基因序列设计引物P3、P4(见表2)，其中下游引物P4增加了6个His标签。用引物P3、P4，反转录的cDNA为扩增模板，扩增猪Nectin-1胞外区完整编码区序列。结果扩增出一条大小约为978bp的特异性条带，片段大小与预期结果一致(图5)。将PCR产物做TA克隆(TA克隆试剂盒购自大连宝生物公司)，连进pMD-18T载体，构建成 pMD-18-nectin-1-ecto，用BamH I和EcoR I双酶切验证正确。 

2.pGEX-6p-1-nectin-1-ecto原核表达质粒的构建 

将上述通过PCR扩增的猪的Nectin-1胞外区片段用BamH I、Xho I双酶切处理后克隆到原核表达载体pGEX-6p-1(由华中农业大学动科动医学院陈焕春院士赠送)中，用BamHI、XhoI双酶切鉴定，能得到预期大小的酶切片段(图6)，说明成功构建猪Nectin-1胞外区的原核表达质粒pGEX-6p-1-nectin-1-ecto。 

实施例3携带Nectin-1胞外区完整编码区序列的质粒pLenti7.3CA-nectin-1-ecto的构建 

1.pCA-nectin-1-ecto的构建 

参照之前设计引物P3、P4(见表2)，重新设计一对引物P5、P6，其中上游引物P5的EcoR I酶切位点替换P3引物中的BamH I酶切位点，下游引物P6则删除掉了原先下游引物P4中的6个His标签。用之前构建的重组质粒pMD-18-nectin-1-ecto作为模板扩增nectin-1-ecto，回收960bp片段(UNIQ-10柱式离心式DNA凝胶回收试剂盒购自北京天根生物有限公司)，同时用EcoR I和Xho I(所有限制性内切酶均购自大连宝生物公司)双酶切pCA真核表达载体(由华中农业大学动科动医学院钱平教授惠赠，结构见图7)，使外源片段nectin-1-ecto连入pCA真核表达载体多克隆位点中。经EcoR I和Xho I双酶切检测，得到符合预期大小的酶切片段，成功构建到表达猪Nectin-1-ecto的真核质粒pCA-nectin-1-ecto。 

2.pLenti7.3CA-nectin-1-ecto重组质粒的构建 

用Acc I和Xho I双酶切重组质粒pCA-nectin-1-ecto，回收1716bp片段，该片段是一个完整的真核细胞表达核，并且携带有外源基因nectin-1-ecto；接下来用Cla I+Xho I双酶切pLenti7.3/V5-GW/lacZ(购自Invitrogen公司)，回收7256bp大片段，去掉了本载体原有的真核细胞表达核，从而构建pLenti7.3CA-nectin-1-ecto。 

实施例4慢病毒病毒粒子的获取 

1.脂质体介导的细胞转染 

本实验中采用的慢病毒载体是利用四质粒表达系统进行构建的。四质粒分别是上述构建成功的慢病毒核心载体重组质粒pLenti7.3CA-nectin-1-ecto与其辅助转移质粒pLP1、pLP2、pLP/VSVG(购于Invitrogen公司)共转染来源于人胚肾细胞系的包装细胞293FT细胞(购自中国兽药监察所)。 

转染的步骤如下： 

1)在24孔细胞培养板中培养293FT细胞，于转染前1h，即细胞单层长至60～70％，换成细胞维持液，继续培养1-2h。细胞维持液配方如下：将1L装DMEM粉剂(购于美国GIBCO BRL公司)溶于900mL三蒸水中，加入3.7g NaHCO₃，用1mol/L HCl调pH值至6.8左右，定 容至1.0L后，用0.22μm滤膜过滤除菌，配制成DMEM基础培养液，室温保存备用。在DMEM基础培养液中加入10％的胎牛血清(购自美国GIBCO BRL公司)、100μg/mL链霉素、100U/mL青霉素，配制成细胞维持液，4℃冰箱保存备用。 

2)取两支细胞用1.5mL EP管。其中A管加50μL OPTI-MEM培养基(购自Invitrogen公司，)和1-2μgDNA，B管加入50μLOPTI-MEM和2μL Lipofectin Reagent(脂质体转染试剂盒LipofectAMINETM2000购自Invitrogen公司)，室温静置5min。 

3)将B管中的溶液小心加入A管中，然后轻轻的充分混匀，室温静置20-30min后，加入500μL OPTI-MEM。 

4)吸弃板中所有的培养液，用DMEM基础培养液洗涤细胞数次。然后将A管中的溶液加至24孔板的细胞上，在37℃条件按下，于5％CO₂培养箱中培养12-24h。 

5)吸弃24孔板中所有的液体，加入含有3％胎牛血清(购于美国GIBCO BRL公司)的DMEM基础培养液继续培养(48-72h)待细胞出现病变。 

转染293FT细胞荧光照片如图所示(图8)： 

2.慢病毒病毒粒子的获取 

(1)用pLenti7.3CA-nectin-1-ecto及其辅助质粒转染293FT细胞48h后，70％的细胞出现病变，开始收集细胞上清。 

(2)将含有病毒及残余细胞的DMEM基础培养基放入到50ml离心管中，3000r/min，4℃，离心10min后，收集上清液弃掉细胞沉淀。 

(3)将上步收集的上清液用0.45μm的滤器过滤。 

(4)将上步收集的滤液加入到Beckman离心管中后，再在Beckman离心管底部小心加入40μL50％蔗糖溶液，将整个离心管放入超离桶中。 

(5)在4℃，25,000r/min条件下超速冷冻离心2.5h。 

(6)取出离心管，尽量倒掉上清液，用70％乙醇溶液洗涤沉淀，室温干燥. 

(7)将上步沉淀加入150μLPBS缓冲液(KCl 0.2g，NaCl 8.0g，Na₂HPO₄1.44g，KH₂PO₄0.24g，溶于800.0mL蒸馏水中，调pH至7.4，定容至1.0L，高压灭菌20min后，室温保存备用)中，用RNA酶去除RNA，分装贮存于-80℃冰箱中备用。 

实施例5慢病毒转导的PK-15细胞系的筛选 

将超离获得慢病毒病毒粒子(5×10⁸pfu/mL)，用低速离心的方法转导PK-15细胞(购自中国兽药监察所)，在离心转导置于离心机(Eppendorf5810)中用水平离心转(A-4-81-MTP/Flex)进行离心，最大离心半径为163mm；静置转导置于27℃恒温箱中进行。1h后重新放入36℃细胞培养箱中培养。在72h后通过倒置式荧光显微镜观察，挑取阳性细胞克隆扩大培养，从而 获得慢病毒转导的能够稳定表达猪pLenti7.3CA-nectin-1-ecto的PK-15细胞系PK15-nectin-1-ecto(图9)。 

实施例6PK15-nectin-1-ecto细胞系的检验 

1.抑制病毒增殖试验 

将正常PK-15细胞和本发明所构建的PK15-nectin-1-ecto按照相同的量培养于同一块24孔板中，24h后接种于1MOI的病毒浓度为1×108的PRV-Ea株(陈焕春，方六荣，何启盖，金梅林，吴美洲.猪伪狂犬病病毒鄂A株的分离鉴定.畜牧兽医学报，1998，29：156-161)的病毒，并按照(10-5、10-6、10-7的梯度稀释)，48h后甲醛固定并用结晶紫染色。结果显示，PK15-nectin-1-ecto与正常的PK-15细胞系比较，具有明显的抑制病毒增殖的作用。说明通过慢病毒转导法获得的PK15-nectin-1-ecto细胞系能够有效的抑制PRV病毒的增殖(图10)。 

2.一步法增殖曲线试验 

将正常PK-15细胞和本发明所构建的PK15-nectin-1-ecto按照相同的量各培养于7瓶T-25细胞瓶中，24h后接种5MOI计量的PRV-Ea株的病毒，其病毒浓度为1×10⁸，并按照0h、3h、6h、9h、12h、18h、24h共7个时间点，收集上述三种细胞的细胞上清液。测定毒价，绘制一步法增长曲线图，结果如下图所示(图11)。测定毒价，发现通过慢病毒转导法获得的PK15-nectin-1-ecto在第9h开始能有效的抑制病毒的增殖。