海岛棉脂质转运蛋白及其在纤维改良上的应用

摘要

本发明提供了一种新的能够提高棉花纤维品质的脂质转运蛋白基因lpt及其编码的LTP蛋白质多肽，以及经重组技术产生这种LTP蛋白质的方法。本发明还公开了lpt基因在提高棉花纤维长度和强度方面的功能与应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有脂质转运功能的蛋白，在棉花纤维中特异表达编码该蛋白的 基因能够提高棉花品种的纤维长度。

背景技术

利用基因工程手段提高棉花的纤维品质包括棉花的纤维长度是当前棉花分子育 种的重要方向。

植物脂质转运蛋白(LTP)是一类小分子碱性蛋白，占植物可溶性总蛋白的4％左 右。LTP是一种多功能的蛋白家族，LTP蛋白家族的成员不仅参与了磷脂在生物膜之间 的运输，而且还在生物膜、角质和脂质的形成、植物的生殖发育以及信号的转导等生 物过程中发挥了重要的作用。近期的研究表明，LTP蛋白具有信号肽，可以从细胞内 分泌到细胞外并定位于细胞壁上。LTP蛋白的细胞壁定位功能对于植物的抗病反应、 抗逆境反应(高温、高盐、干旱协迫)、以及生物膜和脂质的形成具有重要作用。

在棉花的纤维发育过程中，脂类代谢在棉纤维快速伸长中发挥了重要的作用。在 棉花胚培养基中添加碳链长度在20以上的脂类化合物能够促进纤维的伸长发育。烟草 中脂类运输蛋白基因的研究表明，脂类运输蛋白具有疏松细胞壁的功能。但是到目前 为止，哪种蛋白参与运输C20以上的脂类化合物并不清楚，利用基因工程手段提高棉 花的纤维长度也没有报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的脂质转运蛋白基因以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途，尤 其是在提高棉花脂质转运蛋白在胚细胞中的表达水平从而促进棉花纤维伸长方面的用 途。

本发明人经过广泛而深入的研究，首次采用分子克隆方法从海岛棉胚特异表达的 cDNA中分离获得了新的ltp基因，并且通过实验证实了它具有促进纤维伸长功能，ltp 基因转入植物后可导致棉花纤维伸长。在此基础上完成了本发明。

本发明包括以下内容：

1、提供了一种新的分离出的脂质转运蛋白(以下简称为“LTP”蛋白质)，包含：

具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或 其活性衍生物。较佳地，该多肽选自下组：(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽； (b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个(较佳地1-20个)氨基酸残基的取代、缺 失或添加而形成的，且具有促进棉花纤维伸长功能的LTP蛋白质活性的由(a)衍生的多 肽。

2、提供了编码上述多肽的多核苷酸，选自：

(a)编码上述LTP蛋白质多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较 佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷 酸的序列是选自下组的一种：(a)具有SEQ ID NO：1中1-363位的序列；(b)具有SEQ ID  NO：1中1-400位的序列。

3、提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被 上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

4、提供了制备上述LTP蛋白质多肽的方法，该方法包含：(a)在适合表达的条件 下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有活性的多肽。

5、提供了上述多核苷酸和LTP蛋白质多肽的用途，即，在培育提高棉花纤维长度 的棉花品种方面的应用。

6、提供了一种改变植物脂质转运蛋白，以提高棉花纤维品质的方法，它包括步骤：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有SEQ ID NO：1所示序列的多 核苷酸，所述的LTP选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而 形成的，且具有促进棉花纤维伸长的由(a)衍生的多肽；

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使lpt基因编码序列 转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(3)选择出转入lpt基因的DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；

(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。

在本发明中，术语“LTP蛋白质”、“LTP多肽”或“脂质转运蛋白”可互换使 用，都指具有LTP氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始 甲硫氨酸的LTP蛋白质。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质， 原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离 纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为 分离纯化的。

如本文所用，“分离的LTP蛋白或多肽”是指LTP多肽基本上不含天然与其相关 的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术 纯化LTP蛋白质。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明 的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核 宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方 案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽 还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括LTP蛋白质的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、 “衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然LTP蛋白质相同的生物学功能 或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非 保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残 基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代 基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基 酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的 序列)。根据本文所述，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范 围。

在本发明中，术语“LTP多肽”指具有脂质转运活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。 该术语还包括具有与LTP蛋白质相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变 异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个， 最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个 或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如， 在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。 又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。 该术语还包括LTP蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、 诱导突变体、在高或低的严谨程度条件下能与ltp DNA杂交的DNA所编码的蛋白。本 发明还提供了其他多肽，如包含LTP多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽 外，本发明还包括了LTP多肽的可溶性片段。通常，该片段具有LTP多肽序列的至少 约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸， 更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供LTP蛋白质或多肽的类似物。这些类似物与天然LTP多肽的差别可以 是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。 这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到。

在本发明中，“LTP蛋白质保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相 比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似 或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换 而产生。

表1

  最初的残基  代表性的取代   优选的取代   Ala(A)  Val；Leu；Ile   Val   Arg(R)  Lys；Gln；Asn   Lys   Asn(N)  Gln；His；Lys；Arg   Gln   Asp(D)  Glu   Glu   Cys(C)  Ser   Ser   Gln(Q)  Asn   Asn   Glu(E)  Asp   Asp   Gly(G)  Pro；Ala   Ala   His(H)  Asn；Gln；Lys；Arg   Arg   Ile(I)  Leu；Val；Met；Ala；Phe   Leu   Leu(L)  Ile；Val；Met；Ala；Phe   Ile   Lys(K)  Arg；Gln；Asn   Arg   Met(M)  Leu；Phe；Ile   Leu   Phe(F)  Leu；Val；Ile；Ala；Tyr   Leu   Pro(P)  Ala   Ala   Ser(S)  Thr   Thr   Thr(T)  Ser   Ser   Trp(W)  Tyr；Phe   Tyr   Tyr(Y)  Trp；Phe；Thr；Ser   Phe   Val(V)  Ile；Leu；Met；Phe；Ala   Leu

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA 或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编 码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变 异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白 质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成 熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列) 以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包 括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多 肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异 体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变 异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多 个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％， 更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核 苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高 温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如 50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相 同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的 多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度 至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少 100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码LTP 蛋白质的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的LTP核苷酸全长序列或其片段通常可以用人工合成、PCR扩增法、或重组 法的方法获得。例如首先根据SEQ ID NO：1的序列进行全序列合成。

对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序 列来设计引物，并用人工合成的LTP核苷酸全长序列或其片段作为模板，扩增而得有关 序列。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将 其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关 序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常， 通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段和衍生物)的 DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体) 和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或ltp基因编 码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核 苷酸序列可用来表达或生产重组的LTP1多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码LTP多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重 组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，LTP蛋白质多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载 体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或 其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以使用。表达载体 的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含ltp基因编码DNA序列和合适的转录/翻 译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术 等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达 载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿 主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白 (GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当 的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高 等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵 母；植物细胞；昆虫细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会 使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用 于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核 生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理， 所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔 的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机 械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化 等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从 而获得脂质转运蛋白抗性提高的植物。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的 宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进 行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导) 诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如 果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。 这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、 用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过 滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方 法的结合。

另一方面，本发明还包括对ltp基因的DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多 克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。较佳地，指那些能与LTP蛋白质基因产物或 片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合 并抑制LTP蛋白质的分子，也包括那些并不影响LTP蛋白质功能的抗体。本发明还包括那 些能与修饰或未经修饰形式的LTP蛋白质基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段、 或嵌合抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的 LTP蛋白质基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。 与之相似的，表达LTP蛋白质或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。 此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的各类抗体可以利用LTP蛋白质基因 产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备 或利用多肽合成仪合成。与LTP蛋白质基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞 (例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖 基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物 来免疫动物而获得。抗LTP蛋白质的抗体可用于检测样品中的LTP蛋白质。

多克隆抗体的生产可用LTP蛋白质或多肽免疫动物，如家兔、小鼠、大鼠等。多种 佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

本发明还涉及定量和定位检测LTP蛋白质水平的测试方法。这些试验是本领域所熟 知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。

一种检测检测样品中是否存在LTP蛋白质的方法是利用LTP蛋白质的特异性抗体进 行检测，它包括：将样品与LTP蛋白质特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成 了抗体复合物就表示样品中存在LTP蛋白质。

本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯 片(又称为“基因芯片”)上，用于基因的表达分析。用LTP蛋白质特异的引物进行RNA- 聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测LTP蛋白质的转录产物。

本发明的研究发现，棉花胚特异表达的脂质转运蛋白LTP在棉花纤维快速伸长优 势表达，并在胚表皮和植物的表皮毛细胞中特异表达，LTP参与运输C20以上的脂类 化合物，在棉花胚中增强表达ltp基因能够提高棉花纤维长度。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ ID NO：2所示 氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从采用原位杂交技术从构建的海岛棉cDNA文 库库中分离的。其序列如SEQ ID NO：1所示，它包含的多核苷酸序列全长为400个碱基， 其开放读框位于1-363位，编码全长为120个氨基酸的LTP蛋白质(SEQ ID NO：2)。

本发明的LTP蛋白质具有如下特性：A)LTP蛋白在棉花伸长纤维中特异表达，能够 转运长碳链的脂肪酸(≥C20)；B)脂质转运蛋白纤维改良功能明确，在棉花纤维中超量 表达该基因能够显著促进纤维伸长。

经实验证实，转ltp基因的棉花植株与对照相比，转基因植株的棉花纤维质量得到 了明显改进，纤维长度增加2.7-3.5mm；纤维强度与对照相比增加0.3-3.3CN/tex。

LTP蛋白质为促进植物纤维伸长提供了新的途径，因而具有巨大的应用前景。通过将 ltp基因导入农作物品种(例如棉花)，改变现有棉花品种的纤维长度，可获得脂质转运 蛋白的棉花农作物品种，解决农业生产中存在的实际问题。

附图说明

图1是lpt基因遗传转化载体的构建示意图。图中，LB、RB分别为T-DNA的左右边界 序列。CaMV35S为烟草花叶病毒35S启动子。NOS为终止子。NPTII为卡那霉素抗性基因。 fbp为矮牵牛胚特异表达启动子(见实施例3)。

图2是转lpt基因棉花幼苗(T0)叶片PCR检测图。M为DL2000分子量标记。标记的 分子量分别为2000、1000、750、500、250和100bp；P为阳性对照(lpt质粒)；1-7 为经过转化lpt基因的转基因棉花幼苗(见实施例4)。

图3是转lpt基因的棉花植株的Southern杂交分析情况。(P：lpt基因质粒DNA；1-6： 转基因植株(见实施例5)。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的 技术人员而言是显而易见的。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人， 分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的 条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1脂质转运蛋白的CDNA片段克隆

(1)海岛棉胚组织特异cDNA的合成

海岛棉胚组织特异表达cDNA合成采用Clontech公司的cDNA文库构建试剂盒的方法 实施，该方法的具体步骤如下。

选取海岛棉品种Pima-90开花后2天的胚组织用于抽提棉花的总RNA。称取0.5g海 岛棉胚，用液氮研磨成细粉，分装于两个1.5ml的eppendorf管中。每管加入1ml TRIZOL 用力摇动使混合均匀，室温下放置5min。然后在4℃，12,000g的条件下离心10min，将 上清液吸入干净的1.5ml的eppendorf管中。每管加0.2ml氯仿，用力振荡15s，室温放 置2～3min。然后在4℃、12,000g的条件下离心15min。将上清液转移到干净的1.5ml 的eppendorf管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min。在4℃，12,000g 的条件下离心10min。弃上清，加入1ml 75％乙醇洗涤，在4℃，7,500g离心5min。弃 上清，室温干燥15-20min后溶于适量RNA-free water中(55～60℃水浴10min使RNA充 分溶解)。所获得的RNA用于cDNA合成反应。

按照QIAGEN公司的mRNA纯化试剂盒的方法将总RNA纯化为mRNA，然后立刻按照 ClonTECHTM试剂盒中所提供的方法进行单链cDNA合成和双链cDNA合成。

(2)采用PCR方法分离脂质转运蛋白基因

设计PCR扩增引物2条，分别为P1和P2，利用在2条引物以步骤(1)所获得的cDNA 为模板扩增ltp全长基因。PCR的反应体系为：10×PCR buffer，3μL；dNTPs(dATP，dTTP， dGTP)2μL；MgCl₂，2μL；引物P1和P2各2μL；Taq酶，2个单位；棉纤维组织cDNA， 100ng，加入无菌水补足30μL体系，迅速混匀后离心。

PCR扩增条件按照以下程序完成：

94℃，3min，1cycle；

94℃，1min；50℃，1min，72℃，1min，36cycles；

72℃，3min，1cycle。

反应结束后，PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳分离。按照Invitrogen公司的 PCR产物回收试剂和回收PCR片段。

(3)脂质转运蛋白基因的cDNA片段的测序验证

PCR片段与Takara公司PGEM-18T载体相连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α。按照 步骤(2)的PCR方法鉴定阳性克隆。抽提阳性的大肠杆菌质粒并进行序列测定。

实施例2脂质转运蛋白的LTP蛋白质基因的人工合成

根据已完成的含400bp编码区的核苷酸序列，首先分8个区段分别根据正链和副链 序列，分别合成出长度约150-200bp、具有粘性末端的单链寡核苷酸片段。将正链和副链 各一一对应的8个互补的单链寡核苷酸片段分别退火，形成8个带有粘性末端的双链寡核 苷酸片段。混合双链寡核苷酸片段，经T₄DNA连接酶催化组装成一个完整的ltp基因。该 合成的DNA片段含有SEQ ID NO：1中1-363位的核苷酸序列，并且合成基因的两端含XbaI 和SacI位点。

将上述人工合成的5’和3’端酶切位点为XbaI和SacI位点ltp基因，用于下面脂 质转运蛋白的LTP蛋白质基因植物表达载体的构建。

实施例3脂质转运蛋白的LTP蛋白质基因植物表达载体的构建

脂质转运蛋白的LTP蛋白质基因植物表达载体构建的具体方法如下：

A.pBI121和pCAMBIA2301用HindIII和EcoRI双酶切，将pBI121带有 p35S-GUS-Nos-ter的片段连入pCAMBIA2301，形成中间载体p35S-2301-GUS；

B.用XbaI和SacI双切p35S-2301-GUS和上述人工合成的ltp基因，用ltp置换 p35S-2301-GUS相应酶切位点的GUS，从而获得脂质转运蛋白的ltp基因植物表达载体(图 1)。再将其转入农杆菌系LBA4404中，用于转化棉花。

实施例4利用农杆菌介导转化构建获得脂质转运蛋白基因的转基因棉花

把含有目的基因的农杆菌在合适抗性的LB培养基上划线，28℃下培养2天，挑取单 菌落接种于50ml(浓度为50mg/L卡那霉素)的LB液体培养基中。培养基在200rpm，28 度条件下摇床上培养42-48小时。当OD600达到0.3-0.8之间时，3000g离心收集菌体。 利用1/2MS液体培养基将收集的菌体稀释至OD600＝0.2-0.4之间。

(1)外植体与农杆菌的共培养：取上述5-6天苗龄的下胚轴，切成长约0.5-0.8cm长的 小段，于1/2MS液体培养基稀释的农杆菌菌液中浸泡15分钟，取出，用滤纸吸干下胚轴 表面的菌液后，转入不加任何抗生素的固体CB2.1培养基中，每皿30-40块下胚轴，于 25℃下共培养50-60小时。

(2)愈伤组织(callus)的诱导：用含有cef 250mg/l的无菌水洗共培养的下胚轴3-4次， 把下胚轴用无菌滤纸吸干下胚轴表面的水后，把下胚轴转入CB3.1培养基上 28℃-30℃(16h光/8h暗循环光照培养)培养3-4周。小的愈伤组织大约在3周时可以被看 到，然后，每隔一个月继代培养，直到愈伤组织达到合适的数量。

(3)胚性愈伤组织和体细胞胚的诱导：将一定数量的愈伤组织转入到CB4培养基中， 28℃-30℃(16h光/8h暗循环光照培养)培养，每隔一个月继代培养，直到体细胞胚出现。

(4)体细胞胚的萌发：把体细胞胚转到CB5培养基中，让它们萌发并长成小苗。

(5)转基因植株的获得：转移幼苗(2-4cm长，具有叶子的嫩枝)转到CB6培养基中(需 要更大的容器)，28℃-30℃(16h光/8h暗循环光照培养)生长4个月。将具有较好根系的 转基因植株直接转到含有湿土的小盆中，并在培养室中28℃-30℃(16h光/8h暗，循环光 照培养)培养2周，然后，转移这些小盆到温室中。每天对转基因植株进行浇水，对之进 行施肥等直到棉铃成熟。然后，收集种子，4℃保存种子。

(7)转基因的PCR鉴定：

用小量抽提植物总DNA的方法得到植物总DNA，以1.5μl总DNA为模板以引物(P1/P2) 进行PCR扩增，共检测了36棵无菌棉花苗，其中有17棵被检测到有特异性条带的阳性植 株(T0)，部分植株PCR产物电泳结果如图2所示。

实施例5利用Southern杂交方法鉴定棉花脂质转运蛋白基因的转基因植株；

利用Southern blot分析目标基因在海岛棉基因组中整合情况，

(1)对照和转基因植株基因DNA组的酶切和电泳

对照和转基因植株基因DNA组按照表2的酶切体系于37℃、BamHI酶切24-48h后，取5 μL产物电泳，于UV灯下检测是否酶切完全，酶切完全的在泳道上为均匀弥散状条带，然 后将酶切产物在冷冻干燥离心机上浓缩至50μL，加6μL Loading buffer后，在1％琼脂 糖凝胶电泳。先用120V电泳20min，当DNA全部跑出点样孔后，将电压调为2V/cm，电泳 5h。

表2棉花DNA限制性内切酶体系。

  成分   体积   棉花基因组DNA   60μg   10×限制性内切酶Buffer   20μL   限制性内切酶(15U/μL)   5μL   ddH₂O   总体积至200μL

(2)转膜

电泳结束后取出凝胶，切去多余的胶块，测量长和宽，切去右上角作为标记，然后 放入脱嘌呤液10-15min进行脱嘌呤处理，此时溴酚蓝的颜色变黄。

将胶块转移至一新托盘内，用去离子水漂洗2次，然后将样品转移到变性液中至少 50min做DNA变性处理。

变性结束后，将胶块转移至另一新托盘内，用去离子水漂洗2次，然后将样品转移到 中和液中30min。

玻璃平板置于陶瓷方盘上，并铺上两张Whatman 3MM滤纸作为虹吸桥，盘中加入足 量的转移缓冲液10×SSC，用玻璃棒赶出虹吸桥和玻璃板中的气泡。将一长和宽和凝 胶大小一致的硝酸纤维素滤膜，切去一角，在10×SSC溶液浸润3-5min。

将凝胶正面朝下，放置于虹吸桥中央，用玻璃棒赶出滤纸和胶块之间的气泡。将硝 酸纤维膜覆盖于凝胶上，并使切角对齐。用Parafilm封凝胶的四边，以防短路。在膜上 放三层3MM滤纸，并用玻璃棒赶出气泡。将多层吸水纸覆盖于滤纸上，顶部放一合适大 小的玻璃板，并在玻璃板上方放置500g重物，转膜3-5d，期间应不断更换吸水纸。转 膜完成后，取下胶体，用EB染色10min，并进行紫外检测，检查转膜效果。用3MM滤纸 夹住尼龙膜，置于室温30min晾干，然后置于80℃固定2-3h后，将尼龙膜包裹于锡泊 纸中，于4℃保存备用。

(3)探针制备

根据促进纤维伸长基因3’端相对非保守区域设计特异引物，扩增400bp长度的片 段(2800-3200)作为Southern blot检测的探针。

探针标记步骤如下：取20μL Cross-linker用80μL水(试剂盒内提供)稀释成 工作浓度。工作液在2-8℃可保存一个星期。用试剂盒内提供的水将用于标记的DNA稀 释到10ng/μL。核酸中的盐浓度必须尽可能低，不超过50mmol/L。取10μL稀释过 的DNA样品于微量Eppendorf离心管中，在沸水浴中变性5min。立即将样品置于冰上 冷却5min，在微量离心机上轻轻离心，将混合物收集到管底。向冷却的DNA样品中加入 10μL Reaction buffer，轻轻地混匀，置于冰上。

加入2μL Labeling reagent，轻轻地混匀。加入10μL Cross-linker工作液，彻 底混匀，在微量离心机上轻轻离心，将混合物收集到管底。反应混合物于37℃温育30min。 标记后的探针可以立即使用，或置于冰上保存2h。长时间保存需要加入50％甘油(v/v)。

(4)杂交：

取所需体积的杂交缓冲液，预热至55℃。Buffer用量一般为0.25mL/cm2杂交膜。 对于大的杂交膜，Buffer用量可以减少到0.125mL/cm2；将膜置于Hybridization buffer 中，在杂交炉中预杂交至少15min；在预杂交Buffer中加入标记好的探针，一般每毫升 Buffer中加入5-10ng探针；在55℃杂交炉中杂交过夜。可通过改变杂交温度(50-75℃) 调控严谨度。

(5)洗膜：

将Primary wash buffer预热至55℃，其用量为2-5mL/cm2；小心地将纤维膜转移 到Primary wash buffer中，55℃漂洗10min；用Primary wash buffer在55℃漂洗10min； 将纤维膜转移至一干净容器，加入过量Secondary wash buffer，在室温下漂洗5min； 用Secondary wash buffer再一次漂洗5min。

(6)检测：

去除膜上多余的Secondary wash buffer，并将膜置于一层平整的SanranWrap上面， 使样品面朝上；将检测试剂滴于膜上(30-40μL/cm2)，放置2-5min，除去多余 检测试剂；

在X光片夹中铺一层干净滤纸，滤纸下面放上增感屏前屏；将膜用保鲜膜包好，正 面向上放在滤纸上，用胶带固定；暗室中取一张X光片放在杂交膜上。再放上增感屏后 屏，合上光片夹，封上胶带，曝光2h左右；在暗室中将显影液倒入大方盘中，取出X 光片，置显影液中，轻轻晃动液体，显影3-5min至黑色曝光条带显现，立即将X光片 转移至定影液中，定影20min左右，取出X光片置流水中冲洗过夜；

转lpt基因棉花植株的Southern杂交分析情况见图3。图3中1-6为转lpt基因植株，P为阳 性质粒对照。图3的实验结果说明lpt基因已经整合到棉花的基因组中，拷贝数为1-2个，转 基因植株可用于基因的功能分析鉴定。

实施例6转ltp基因植株的纤维品质鉴定

为了进一步了解ltp基因在提高棉花纤维品质中的具体应用，我们对所获得的6个不 同转基因棉花株系进行田间试验，比较转基因棉花植株与对照植株(非转基因植株柯-312) 之间纤维品质差异。

2010年5月25日将所获得6个不同的转基因棉花株系播种于上海交通大学试验 场，试验采取完全随机设计，小区面积为10m×2m，行株距为90cm×20cm，4次重 复。田间管理均按高产栽培要求进行。从9月15日开始起收获发育正常的中部棉铃5个 进行棉花的纤维品质分析。

按照GB/T 19617-2004棉花长度试验方法手扯尺量法)进行测量棉花纤维的长度鉴 定。

按照(GB/T13783-1992棉纤维断裂比强度的测定/平束法)进行棉花纤维强度鉴定。 纤维强度的测定是将纤维样品混匀后用棉花纤维引伸器制成棉条，用国产Y162A型束纤 维强力机测定3.2mm隔距比强度，测6次重复平均值作为试样代表值，并用中国纤维 检验局的标准棉样修正。

所获得6个不同的转基因棉花株系与对照的纤维长度、纤维强度进行测量，结果见表 3，表中株系1～株系6是转ltp基因棉花，来自上述实施例4，对照株系是柯-312。

表3转基因植株纤维品质和对照植株的对比

从表3中可以看到，转ltp基因的棉花植株与对照相比，转基因植株的棉花纤维质量 得到了明显改进，纤维长度增加2.7-3.5mm；纤维强度也有所增加，纤维强度与对照相比 增加0.3-3.3CN/tex。上述结果说明表达ltp基因具有提高棉花纤维长度和部分增加纤维 强度的功能。

参照棉花纤维品质的分级方法国家标准《GB 1103-2007棉花细绒棉》，转基因的棉 花的纤维品质已经达到国家优质棉标准。