海岛棉纤维发育EST表达谱分析及脂转移蛋白基因的结构特征分析

摘要

棉花纤维是纺织工业的重要原料,在国民经济中占有重要地位.棉花纤维的发育从胚珠表皮细胞的分化和突起开始,并决定纤维的最终品质和产量,在受精后约16天,棉纤维细胞可延伸至2.5-3.0cm,是迄今为止发现的最长的植物细胞.本研究构建了海岛棉海71240-24DPA胚珠/纤维的cDNA文库,通过大规模随机测序后进行了系统的表达特征分析.
　　 1.用clonetech公司的SMART技术构建了海岛棉海7124-3-6DPA(days postanthesis)胚珠/纤维cDNA文库(GBI)和6-24DPA纤维cDNA文库(GB2),库容量分别为1.01×l06 pfu/ml和7.65×106 pfu/ml,平均插入片段在500bp以上.通过随机挑取单克隆测序并对序列预处理,获得21,073条高质量EST序列.进一步拼接获得8,653 unigenes,包括3,715 contigs(42.9％)和4,938 singletons(57.1%).
　　 2.对unigenes进行功能注释,7,786 unigenes发现同源序列,其中562条为推测性或假想蛋白,其余867条未发现显著的同源序列( no hits).利用BLAST2GO在线软件功能注释,发现7.316条unigenes定位有GO信息,占总体的84.55%.其中,细胞组分类中主要为cell part(28.80%),organdie(22.71%),cell(28.80%)和macromolecular complex9.38%;分子功能类中binding,catalytic activity,structural molecule activity分别占43.40%,31.63%,12.39%;生物进程类中cellularprocess和metabolic process占32.29%,29.80%,而response to stimulus,establishment of localization和localization各占6.78%,7.35%,7.43%.KEGG分析表明,5,051条tmigenes检测到其相关的代谢途径,其中大多数集中在糖代谢（681条,13.48%）和氨基酸代谢（587条,11.62%）中.其他如脂类代谢、信号转导、细胞生长和死亡类相关基因也被发现.
　　 3.EST差异表达分析显示：在海岛棉GB1与GB2中,两文库共有2,260条unigenes,在GBI文库中特有的序列有1,594条,在GB2中特有的序列有2,617条.GBI和GB2特有及共有unigene的基因本体学GO分类结果基本相似.海陆比较结果发现,408条海岛棉unigenes在陆地棉中未发现任何同源匹配.KEGG分析表明,海岛棉特有的unigcnes的代谢途径主要集中在代谢类35条(46.67%),其中糖代谢占主导为10条(13.3%).
　　 4.基于生物信息学分析和基因的结构、功能研究,获得9个编码120个氨基酸序列的LTP基因,分别命名为LTPI-LTP9.通过设计基因组专化引物进行基因组扩增及进化分析发现,LTPI、LTP3、LTP6、LTP7来源于棉花染色体A组；LTP2、LTP4、LTP5、LTP8、LTP9来源于棉花染色体D组.进化分析进一步推测LTP1与LTP4,LTP2与LTP3,LTP6与LTP8,LTP7与LTP9在异源四倍体棉种中分别属于部分同源重复基因.
　　 5.根据LTPI-LTP9在海7124和TM-I基因组测序结果的差异,利用本实验室陆地棉遗传标准系TM-I和海岛棉海7124培育的140个BC1作图群体,将LTP1、LTP2、LTP8和LTP9基因定位在棉花染色体10、染色体20,染色体23和染色体20上.并推测,LTP3、LTP4,LTP5.LTP7和LTP6基因分别位于染色体10、染色体20、染色体20、染色体9上和染色体10上.
　　 6.利用荧光定量PCR技术分别在海岛棉和陆地棉中对本文克隆的LTP家族基因进行不同组织、器官表达水平分析,以阐明编码120aa的LTP家族基因在棉花不同组织,棉纤维不同发育时期以及海陆不同棉种表达水平上的差异.在整个棉纤维发育过程中,LTP家族中各基因表达趋势是LTP4/1>LTP3/2>LTP7/9>LTP5>LTP6/8.各类LTP基因在不同组织和不同发育时期其表达水平不完全一致,LTP1与LTP4在纤维中明显优势表达,纤维发育过程中,LTP7/9在0DPA时的表达量远远大于其它时期,各类LTP基因在根中的表达量都很低或是不表达,通过比较海7124与TM-1不同组织、器官转录水平的差异,发现LTP1基因在根、茎,0DPA胚珠、12DPA和24DPA的纤维中,海陆差异明显；LTP4基因在叶、0DPA胚珠和6DPA纤维中,海陆差异明显；LTP2基因在叶、6DPA、12DPA和18DPA的纤维中,海陆差异明显；LTP3基因在茎和18DPA的纤维中,海陆差异明显；LTP5基因在茎、0 DPA胚珠、6 DPA和24DPA的纤维中,海陆差异明显；LTP6/8基因在根、茎和叶中,海陆差异明显：LTP7/9基因在叶、6 DPA、12 DPA、18 DPA和24 DPA的纤维中,海陆差异明显.