核酸浓缩回收盒及其制造方法、和核酸浓缩回收方法

摘要

本发明涉及核酸浓缩回收盒及其制造方法、和核酸浓缩回收方法。更具体地，本发明涉及一种核酸浓缩回收盒，包括：基板、设置在该基板上且其中能够引入液体的通道、布置在通道的预定位置处的高分子凝胶、以及分别布置在通道的相对端的正极和负极。本发明提供了一种操作简便且能够在短时间内高效地浓缩和回收核酸的核酸浓缩回收盒。

说明书

技术领域

本发明涉及一种核酸浓缩回收盒(核酸浓缩回收筒，nucleic acid  concentration recovery cartridge)、一种核酸浓缩回收方法、以及该一种该 盒的制造方法。更具体地，本发明涉及通过在通道中的电泳浓缩核酸并回 收核酸的盒。

背景技术

已发现核酸扩增反应如PCR(聚合酶链反应)方法和LAMP(环介 导等温扩增)方法可以用于各种技术领域。在医学领域，例如，基于DNA (脱氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)碱基序列进行诊断，而在农业领 域，应用DNA鉴定以进行遗传改性农作物的确定等。

根据核酸扩增反应，微量样品中的核酸能够以高效率扩增并检测。然 而，当样品中包含的核酸的浓度处于极微量时，核酸的含量可以低于其检 测下限。此外，当样品中的核酸的浓度极低时，就有可能不能检测到核酸， 因为待扩增的核酸没有以能够引入反应部位的量包含在样品中。在这些情 形下，在预先浓缩样品中的核酸之后，将样品引入反应部位是有效的。

在过去，利用苯酚、氯仿或乙醇的方法，利用吸附核酸的柱子、过滤 器等的方法，利用磁性硅珠的方法等作为核酸浓缩方法是已知的。例如， 日本专利临时公开No.2005-080555披露了一种核酸的浓缩方法，其利用 具有核酸吸附能力的多孔载体。而且，在“On-line sample preconcentration  in capillary electrophoresis：Fundamentals and applications，”Journal of  Chromatography A.，Vol.1184，Pages 504 to 541(2008)中披露了一种通过毛 细电泳来浓缩核酸的方法。

发明内容

利用苯酚、氯仿或乙醇的相关方法必须利用有害的有机溶剂，并且浓 缩操作等很艰苦。利用能够吸附核酸的柱子、过滤器等的方法从操作简单 和方便角度看存在问题，因为柱子、过滤器等易于堵塞。

因此，期望提供一种操作简单方便且能够以高效率在短时间内浓缩和 回收核酸的核酸浓缩回收盒。

根据本发明的一个实施方式，提供了一种核酸浓缩回收盒，包括：

基板(衬底，substrate)，

通道，设置在基板上，其中能够引入液体，

布置在通道的预定位置处的高分子凝胶，以及

分别布置在通道的相对端(两端，opposing ends)的正极(阳极，anode) 和负极(阴极，cathode)。

在该核酸浓缩回收盒中，高分子凝胶可以优选地包含阴离子官能团， 并且该高分子凝胶可以优选地构造成具有从负极侧向正极侧的凹入形状。

在该核酸浓缩回收盒中，通道的至少一部分可以优选形成有将高分子 凝胶保持在适当位置(in place)的凝胶保持部(gel-holding portion)。凝 胶保持部可以在其中该凝胶保持部与高分子凝胶接触的位置(部位， position)处经受亲水化处理。凝胶保持部可以优选地在其中该凝胶保持部 与高分子凝胶接触的位置处用硅土(二氧化硅，silica)涂覆。而且，凝胶 保持部可以优选地具有以使高分子凝胶与该凝胶保持部嵌合(装配或啮 合，fit)并保持在适当位置的预定形状。

另外，相比于正极端和高分子凝胶之间的通道，在高分子凝胶和负极 端之间的通道可以优选地具有更大的容积。

正极和负极可以优选地通过溅射或蒸镀(vapor deposition)形成。而 且，正极和负极可以预选地包含金或铂。

根据本发明的另一个实施方式，提供了一种核酸浓缩回收方法，包括 用缓冲液填充通道，该通道在其预定位置处设置有高分子凝胶并且在该通 道的相对端分别布置有正极和负极，将核酸引入到高分子凝胶和负极端之 间的通道中，在正极和负极之间施加电压以使核酸经历电泳，以及通过高 分子凝胶阻挡(阻止，block)朝向正极端移动的核酸。根据这种核酸浓缩 回收方法，核酸能够通过用高分子凝胶阻挡移动的核酸而浓缩在高分子凝 胶附近。

在核酸浓缩回收方法中，高分子凝胶可以优选地包含阴离子官能团。 而且，高分子凝胶可以优选地以在核酸电泳的方向上具有凹入形状布置在 通道中。

优选地，该核酸浓缩回收方法可以进一步包括在电泳之后在正极和负 极之间施加反向电压。

根据本发明的一个进一步实施方式，还提供了一种上述核酸浓缩回收 盒的制造方法，包括通过光聚合使引入到设置在基板上的通道中的单体溶 液凝胶化成预定形状，从而形成高分子凝胶。

在该制造方法中，单体溶液可以优选地包含阴离子官能团。高分子凝 胶可以可选地凝胶化成具有从负极侧朝向正极侧的凹入形状。

根据本发明实施方式的核酸浓缩回收盒操作简单方便，并且能够以高 效率在短时间内浓缩和回收核酸。

附图说明

图1A至图1D是根据本发明第一实施方式的核酸浓缩回收盒以及利 用该盒的核酸浓缩回收方法的程序的示意图；

图2A和图2B是根据第一实施方式的核酸浓缩回收盒的变形例的示 意图；

图3是根据第一实施方式的核酸浓缩回收盒的进一步变形例的示意 图；

图4是根据第一实施方式的核酸浓缩回收盒的进一步变形例的示意 图；

图5是根据第一实施方式的核酸浓缩回收盒的进一步变形例的示意 图；

图6是根据第一实施方式的核酸浓缩回收盒的进一步变形例的示意 图；

图7是根据第一实施方式的核酸浓缩回收盒的进一步变形例的示意 图；

图8A至图8D根据本发明第二实施方式的核酸浓缩回收盒以及利用 该盒的核酸浓缩回收方法的程序的示意图；

图9A和图9B示出了作为附图替代的照片，其示出了在高分子凝胶 附近观察到的荧光图像(实施例2)；

图10是示出了在启动电泳之后在凝胶界面处的荧光强度随时间的变 化的图示(实施例2)；

图11示出了作为附图替代的照片，其示出了作为高分子凝胶中包含 的阴离子官能团的酸残基基团的变化pKa下，在核酸浓缩回收盒中的高分 子凝胶附近观察到的通道的荧光图像(实施例3)；以及

图12A和图12B示出了作为附图替代的照片，其示出了在高分子凝 胶附近观察到的通道荧光图像(实施例4)。

具体实施方式

下文将描述关于实现本发明的优选实施方式。应当注意，下文将要描 述的实施方式仅仅是本发明的代表性实施例并且绝不应解释为限制本发 明的范围。将以以下顺序进行描述：

1、根据本发明第一实施方式的核酸浓缩回收盒和利用该盒的核酸浓缩回 收方法

(1)核酸浓缩回收盒

(2)核酸浓缩回收方法

2、根据本发明第一实施方式的核酸浓缩回收盒的制造方法以及核酸浓缩 回收盒的变形例

(1)核酸浓缩回收盒的制造方法

(2)核酸浓缩回收盒的变形例

(3)核酸浓缩回收盒的其他变形例

3、根据本发明第二实施方式的核酸浓缩回收盒以及利用该盒的核酸浓缩 回收方法

(1)核酸浓缩回收盒

(2)核酸浓缩回收方法

4、根据本发明第二实施方式的核酸浓缩回收盒的制造方法

1、根据本发明第一实施方式的核酸浓缩回收盒以及利用该盒的核酸浓缩 回收方法

(1)核酸浓缩回收盒

参考图1A至图1D，将描述根据本发明第一实施方式的核酸浓缩回 收盒的构造以及利用该盒的核酸浓缩回收方法的程序。

在图1A中，标明标号1的核酸浓缩回收盒具有基板、形成在基板上 的通道11、以及分别布置在通道11的相对端的正极12和负极13。形成 通道11以允许向其内引入液体，并且高分子凝胶14在通道11中布置在 正极12和负极13之间。而且，电源V连接至正极12和负极13以能够横 跨(跨越，cross)引入通道11中的液体施加电压或从引入通道11中的液 体移除电压。

作为基板的材料，可以采用玻璃或各种塑料(聚丙烯、聚碳酸酯、环 烯烃聚合物、聚二甲基硅氧烷)中的一种。

作为正极12和负极13，可以适当采用包括通过溅射或蒸镀施加的金 (Au)或铂(Pt)的那些材料。

作为高分子凝胶14，可以合适地采用聚丙烯酰胺。更优选地，可以 使用其中包含阴离子官能团的聚丙烯酰胺，更优选利用其中包含作为具有 酸离解常数(pKa)为1至5的酸或其衍生物的残基基团的阴离子官能团 的聚丙烯酰胺。应当注意，如本发明使用的，术语“丙烯酰胺”是指丙烯 酰胺或甲基丙烯酰胺。

阴离子官能团的实例包括但不具体限于羧酸如乙酸、丙酸和丁酸的残 基基团；多元酸如草酸和邻苯二甲酸的残基基团；羟酸如柠檬酸、乙醇酸 和乳酸的残基基团；不饱和酸或不饱和多元酸如丙烯酸和甲基丙烯酸的残 基基团；以及氨基酸如甘氨酸、磷酸的部分酯、硫酸的部分酯、膦酸、磺 酸等的残基基团。

酸或其衍生物的具体实例包括，作为羧酸的脂族单羧酸如甲酸(pKa： 3.55)、乙酸(pKa：4.56)、丙酸(pKa：4.67)、丁酸(pKa：4.63)、戊酸(pKa： 4.68)、己酸(pKa：4.63)、庚酸(pKa：4.66)、棕榈酸(pKa：4.64)和硬脂 酸(pKa：4.69)；脂族或芳族二羧酸如琥珀酸(pKa₁：4.00，pKa₂：5.24)、 戊二酸(pKa₁：4.13，pKa₂：5.03)、己二酸(pKa₁：4.26，pKa₂：5.03)、庚二 酸(pKa₁：4.31，pKa₂：5.08)、辛二酸(pKa₁：4.35，pKa₂：5.10)、壬二酸(pKa₁： 4.39，pKa₂：5.12)、苹果酸(pKa₁：3.24，pKa₂：4.71)和对苯二甲酸(pKa₁： 3.54，pKa₂：4.46)；不饱和羧酸如巴豆酸(pKa：4.69)、丙烯酸(pKa：4.26) 和甲基丙烯酸(pKa：4.66)；取代苯甲酸如茴香酸(pKa：4.09)、间-氨基苯 甲酸(pKa₁：3.12，pKa₂：4.74)、间-或对-氯苯甲酸(pKa₁：3.82，pKa₂：3.99) 和羟基苯甲酸(pKa₁：4.08，pKa₂：9.96)；多羧酸如柠檬酸(pKa₁：2.87， pKa₂：4.35，pKa₃：5.69)以及它们的衍生物。

作为包含阴离子官能团的丙烯酰胺单体，可以优选丙烯酰烷磺酸 (acrylamidoalkanesulfonic acid)。该磺酸的实例包括含可聚合不饱和基团 的磺酸如苯乙烯磺酸(pKa：-2.8)、间-苯胺磺酸(pKa：3.74)、对-苯胺磺 酸(pKa：3.23)和2-(甲基)丙烯酰基-2-烷基(碳数：1至4)丙磺酸，更 具体地2-丙烯酰基-2-甲基丙磺酸(pKa：-1.7)。

聚丙烯酰胺凝胶中阴离子官能团的浓度(wt％)可以优选为0至30％。

(2)核酸浓缩回收方法

参考图1B至图1D，将描述利用核酸浓缩回收盒1的核酸浓缩回收 方法的程序。

首先，将其中包含核酸的样品引入到通道11中的高分子凝胶14和负 极13之间的区域中(参见，图1B)。这时，通道11已用电泳缓冲液填充。

接着，在正极12和负极13之间施加电压以横跨缓冲液施加电压，由 此使核酸经历电泳。带负电荷的核酸在通道11中经电泳朝向正极12。在 这种情形下，高分子凝胶14阻挡核酸的移动并阻挡核酸，使得核酸在高 分子凝胶14的界面处和附近浓缩(参见图1C)。电泳时间可以根据需要 设置，取决于通道11的尺寸，并且能够例如为大约10秒至10分钟。应 当注意，术语高分子凝胶的“界面”是指高分子凝胶14和填充在区域113 侧上的缓冲液之间的接触平面。

最后，区域113中的高分子凝胶14附近的缓冲液通过微管2等吸取 以回收浓缩的核酸(参见图1D)。

这时，高分子凝胶14中包含阴离子官能团使得可以防止由于带负电 荷核酸和阴离子官能团之间的电排斥力而移动到高分子凝胶14内部。如 果核酸移动到高分子凝胶14内部或穿过高分子凝胶14内部并进一步移到 正极12侧上的区域112，则核酸将以较少的量被回收。阴离子官能团可以 优选地为酸或其衍生物的残基基团，其酸离解常数(pKa)为1至5。由 于该酸或其衍生物具有较低的pKa并且官能团具有较大的负电荷，所以它 们对于核酸由于电排斥力而移动到高分子凝胶14中的阻碍更有效。

为了以较大的量回收核酸，在吸取区域113中的高分子凝胶14附近 的缓冲液之后，在正极12和负极13之间短时间施加反向电压也是有效的。 在回收核酸时短时间施加反向电压可以使凝胶界面处存在的核酸以及凝 胶内部和界面附近存在的核酸移动到区域113中的高分子凝胶14附近， 并且可以通过微管2吸取并回收核酸。施加反向电压的时间根据需要设置， 取决于通道11的尺寸，并且能够例如为大约1秒至10秒。

2、核酸浓缩回收盒的制造方法以及核酸浓缩回收盒的变形例

(1)核酸浓缩回收盒的制造方法

根据本发明第一实施方式的核酸浓缩回收盒能够制造如下：通过光聚 合使已引入到形成在基板上的通道11中的单体溶液凝胶化成预定形状， 从而形成高分子凝胶14。

基板上通道11的形成能够例如通过使玻璃制成的基板层经受湿蚀刻 或干蚀刻、通过使塑料制成的基板层经历纳米压印光刻(nanoimprint  lithography)、或通过使塑料制成的基板层注塑成型接着使其经受切割加工 而完成。应当注意，作为通道11，在盒1上能够形成一个或多个通道。

在单体溶液中，可以适当采用丙烯酰胺单体。更优选地，可以使用包 含一个或多个阴离子官能团的丙烯酰胺单体，其中更优选利用包含一个或 多个作为酸离解常数(pKa)为1至5的酸或其衍生物的一个残基基团或 多个残基基团的阴离子官能团的丙烯酰胺单体。具体地，在单体溶液中优 选采用丙烯酰烷磺酸。

正极12和负极13可以通过溅射或蒸镀金(Au)或铂(Pt)而形成。 在这方面，根据相关技术的盒包括利用铂线(铂丝，platinum wire)作为 电极的那些。在这种情况下，无论什么时候进行试验，都需要将铂线布置 在核酸浓缩回收盒中。此外，鉴于铂线的高价格，这些盒不能作为可抛弃 (一次性处理)的盒提供。在在另一方面，根据这个实施方式的核酸浓缩 回收盒1中，正极12和负极13如上所述通过溅射或蒸镀金(Au)或铂(Pt) 制造，并且这些电极已预先形成在盒1中。因此，该盒能够易于处理。与 根据相关技术的核酸浓缩回收盒相反，这样的核酸浓缩回收盒1可抛弃。 因此，利用核酸浓缩回收盒1，可以避免样品在其浓缩之后的污染。

(2)核酸浓缩回收盒的变形例

参考图2A至图4，将描述根据本发明第一实施方式的核酸浓缩回收 盒的变形例的构造。

在根据本发明第一实施方式的核酸浓缩回收盒中，高分子凝胶14可 以优选地布置在通道11中从而在核酸电泳的方向上具有凹入形状。具体 地描述，高分子凝胶14能够布置成这样的构造，从上面看，从负极13侧 朝向正极12侧以三角形(图2A)或半圆形形状(图2B)凹入。

当在正极12和负极13之间施加电压以使带负电荷的核酸电泳朝向正 极12时，移动的核酸被高分子凝胶14阻挡并在高分子凝胶14附近浓缩 (参见图1C)。通过将高分子凝胶14布置成从负极13侧朝向正极12侧 凹入的构造，要浓缩的核酸能够在这时被收集在凹入部中，由此使得可以 增大核酸的浓缩速率以及有效地回收核酸。

为了将高分子凝胶14构造成在核酸电泳的方向上凹入的形状，在通 过光聚合引入到通道11中的单体溶液发生凝胶化之后，通过光掩膜暴露、 激光束扫描等方法依照所述形状进行光照射。

在根据本发明第一实施方式的核酸浓缩回收盒中，相比于正极端和高 分子凝胶14之间的区域112的通道容积，引入包含核酸的样品的区域113 (通道11的区域，其位于高分子凝胶14和负极13之间)的通道容积可 以形成为更大(参见图3)。在这种情况下，优选将区域113的负极侧形成 为圆弧形状以及将负极13布置在相同圆弧形状中(参见图4)。当核酸浓 缩回收盒形成为图4所示的构造时，圆弧的中心角可以优选设置在0至30 度。而且，还适合将中心角设置在30度至60度。此外，还适合将中心角 设置在60度至90度。此外，还适合将中心角设置在90度至120度。

以更大尺寸形成区域113使得可以以增大的容积引入样品溶液，并因 此可以获得更大量的浓缩核酸。在这种变形例中，区域113的负极侧和负 极13形成为圆弧形状，使得可以形成更均匀的电场，因此可以增加核酸 的浓缩效率。

(3)核酸浓缩回收盒的其他变形例

接下来参考图5至图7，将描述根据本发明第一实施方式的核酸浓缩 回收盒的其他变形例。在下文将参考图5至图7描述的变形例中，通道11 分别设置有凝胶保持部15，以示例性方式基于图3中所示的核酸浓缩回收 盒1，但本发明不应限于这样的例举变形例。这些凝胶保持部15的每一个 例如也可以布置在参考图1A至图1D、图2A、图2B和图3描述的各种 核酸浓缩回收盒中。

在根据本发明第一实施方式的核酸浓缩回收盒中，通道11的至少一 部分可以优选地形成有将高分子凝胶14保持在适当位置(在原位，in  place)的凝胶保持部15(参见图5)。凝胶保持部15可以经受亲水化处理， 例如在凝胶保持部15接触高分子凝胶14的位置(或部位)处。在这种情 况下，凝胶保持部15可以优选地在该凝胶保持部15接触高分子凝胶14 的位置处用硅土涂覆。

当如上所述的凝胶保持部15在其中该凝胶保持部接触高分子凝胶14 的位置处经受亲水化处理时，接触位置和高分子凝胶14之间的相容性被 改善，由此使得可以防止高分子凝胶14在通过电泳进行核酸浓缩之后移 动到位置外。利用根据这种变形例的核酸浓缩回收盒1，核酸能够因此由 于布置凝胶保持部15而更稳定地被浓缩和回收。

在根据本发明第一实施方式的每一种变形例的核酸浓缩回收盒1中， 凝胶保持部15可以具有预定形状以使高分子凝胶14填充在该凝胶保持部 15中。如图6中所示，例如，凝胶保持部15具有在垂直于核酸电泳方向 的方向上凹入的形状，使得用于高分子凝胶14的容纳区域被放大，因此 能够以嵌合(fitting engagement)方式保持该高分子凝胶14。如通过示例 方式在图7中示出的，在另一方面，凝胶保持部15可以具有形成了多个 细刻痕的形状，并因此也能够以嵌合啮合地保持高分子凝胶14。

当如上所述的高分子凝胶14能够嵌合到凝胶保持部15中时，核酸浓 缩回收盒1还能够防止高分子凝胶14在通过电泳进行核酸浓缩之后移动 到位置外。利用该核酸浓缩回收盒1，由于凝胶保持部15的布置而能够更 稳定地浓缩和回收核酸。

3、根据本发明第二实施方式的核酸浓缩回收盒以及利用该盒的核酸浓缩 回收方法

(1)核酸浓缩回收盒

参考图8A至图8D，将描述根据本发明第二实施方式的核酸浓缩回 收盒的构造以及利用该盒的核酸浓缩回收方法的程序。

在图8A中，以标号1标明的核酸浓缩回收盒具有基板、穿过基板形 成的通道11、以及分别布置在通道相对端的正极12和负极13。形成通道 11以允许向其中引入液体，并且高分子凝胶14在通道11中布置在正极 12和负极13之间。而且，电源V连接至正极12和负极13以能够横跨引 入到通道11中的液体施加电压或从引入到通道11中的液体移除电压。

通道11包括向其中引入液体的区域113。通过将圆锥形小室作为一 个实例描述这个区域113，但不应限于这样的形状。也可以采用不同的形 状例如椎体形状、棱柱形状和圆柱形形状。

核酸浓缩回收盒的外部形状通过将圆柱形作为一个实例进行描述，但 不应限于这样的形状。也能够采用不同形状例如椎体形状和棱柱形状。

作为高分子凝胶14，可以选取与根据第一实施方式的上述核酸浓缩 回收盒中的类似材料和组成。

尽管未在图8A至图8D示出，布置在根据第一实施方式的核酸浓缩 回收盒中并参考图5至图7描述的凝胶保持部15可以分别布置在根据第 二实施方式的核酸浓缩回收盒中以防止高分子凝胶14移动到位置外。

(2)核酸浓缩回收方法

参考图8B至图8D，将描述利用根据第二实施方式的核酸浓缩回收 盒1的核酸浓缩回收方法的程序。

首先，将其中包含核酸的样品引入到通道11中的高分子凝胶14和负 极13之间的区域113中(参见图8B)。在这时，通道11预先用电泳缓冲 液填充。

接着，将电压施加在正极12和负极13之间以横跨缓冲液施加该电压， 由此使核酸经历电泳。带负电荷的核酸在通道11中电泳朝向正极12。在 这种情况下，高分子凝胶14阻挡核酸的移动并阻挡核酸，使得核酸在高 分子凝胶14的界面处和附近浓缩(参见图8C)。电泳时间可以根据需要 设置，取决于通道11的尺寸，并且能够例如为大约10秒至10分钟。

最后，在区域113中的高分子凝胶14附近的缓冲液通过微管2等吸 取从而回收浓缩的核酸(参见图8D)。

在根据第二实施方式的核酸浓缩回收盒中，相比于在正极端和高分子 凝胶14之间的区域112的通道容积，其中引入包含核酸的样品的区域113 (通道11的区域，其位于高分子凝胶14和负极13之间)的通道容积形 成为非常大。因此核酸能够以大的量被有效浓缩和回收。特别是如在图8A 至图8D中所示的，当区域113构造成在核酸发生电泳的方向上逐渐变得 更窄时，核酸能够以大的量被有效浓缩和回收。

而且，如同在根据第一实施方式的核酸浓缩回收盒中一样，在高分子 凝胶14中包含阴离子官能团，使得可以防止核酸由于带负电荷的核酸和 阴离子官能团之间的电排斥力而移动到高分子凝胶14内部。如果核酸移 动到高分子凝胶14的内部或穿过高分子凝胶14的内部并进一步移动到在 正极12侧上的区域112中，则核酸将以较小的量被回收。阴离子官能团 可以优选地是酸离解常数(pKa)为1至5的酸或其衍生物的残基基团。 由于酸或其衍生物具有较低的pKa并且官能团具有更大的负电荷，所以它 们对于阻碍核酸由于电排斥力而移动到高分子凝胶14中是更有效的。

为了以更大的量回收核酸，在吸取区域113中的高分子凝胶14附近 的缓冲液之后，在正极12和负极13之间短时间施加反向电压也是有效的。 在回收核酸时短时间施加反向电压可以使凝胶界面处存在的核酸以及凝 胶内部和界面附近存在的核酸移动到区域113中的高分子凝胶14附近， 并通过微管2吸取和回收核酸。施加反向电压的时间可以根据需要设置， 取决于通道11的尺寸，并且能够例如为大约1秒至10秒。

4、根据本发明第二实施方式的核酸浓缩回收盒的制造方法

根据本发明第二实施方式的核酸浓缩回收盒1能够制造如下：通过光 聚合将已引入到穿过基板形成的通道11中的单体溶液凝胶化成预定形状， 从而形成高分子凝胶14。

在单体溶液中，可以合适地采用材料丙烯酰胺单体。更优选地，可以 使用包含一个或多个阴离子官能团的丙烯酰胺单体，其中更优选使用包含 作为一个或多个阴离子官能团的酸或其衍生物(其酸离解常数(pKa)为 1至5)的一个残基基团或多个残基基团的丙烯酰胺单体。具体地，在单 体溶液中优选采用丙烯酰烷磺酸。

作为正极12和负极13，可以合适采用包含金(Au)或铂(Pt)的那 些。在这种情况下，正极12和负极13可以通过溅射或蒸镀金或铂而形成。 核酸浓缩回收盒1能够易于处理，因为正极12和负极13通过溅射或蒸镀 金或铂预先形成在盒中。而且，核酸浓缩回收盒1能够作为可抛弃盒提供。 利用该核酸浓缩回收盒1，因此可以避免样品的污染。

关于根据本发明的核酸浓缩回收盒的代表性实施方式的某些实例已 经如上描述了。根据每一个实施方式的核酸浓缩回收盒通过利用高分子凝 胶14的盒作为实例进行了描述。代替高分子凝胶14，可以使用商购多孔 膜如透析膜、反渗透膜、半可渗透膜或离子交换膜，或者纤维素、聚丙烯 腈、陶瓷、沸石、聚砜、聚酰亚胺、钯等的商购膜。

实施例1

1、核酸浓缩回收盒的制造

在PMMA基板上，形成5mm宽、60mm长和2mm深的通道。在该 通道的相对端，分别布置由铂线(直径：0.5mm，长：10mm，The Nilaco  Corporation的产品)形成的正极和负极。通道用依据表1和表2制备的丙 烯酰胺溶液(溶液2)填充。利用共焦激光扫描显微镜(“FV1000”，商标 名；由Olympus Corporation制造)，进行丙烯酰胺的光聚合从而在通道中 形成5mm宽和3mm长的高分子凝胶。接着，将未聚合的丙烯酰胺溶液替 换为电泳缓冲液(1×TBE)。

表1

表2

  溶液1   1mL   核黄素(Riboflavin)   0.02mL   TEMED   0.02mL   溶液2   大约1mL

实施例2

2、核酸的浓缩回收

利用实施例1中制造的核酸浓缩回收盒，执行核酸的浓缩。在通道中 的高分子凝胶和负极端之间，引入样品(Cy3-修饰寡核苷酸，20mer(20 聚体)，1μg；500μl)。在正极和负极之间施加电压从而在75V和1mA下 实施电泳。在共焦激光扫描显微镜下观察移动的样品。

观察到的高分子凝胶周围的通道的荧光图像在图9A和图9B中示出。 观察到的图9A的图像在启动电泳之前取得，而图9B的图像在启动电泳 后3分钟取得。在图9B中，通过来自Cy3的荧光证实，在电泳下从负极 侧移向正极侧的样品被高分子凝胶阻挡并在凝胶界面处和附近浓缩(参见 图9B中的箭头)。

参考图10，将描述实施例2中在启动电泳之后在凝胶界面处的荧光 强度随时间的变化。应当理解，在启动电泳之后，凝胶界面处的荧光的强 度增大，并且在电泳下从负极侧移向正极侧的样品被高分子凝胶阻挡并在 凝胶界面处和附近浓缩。作为基于荧光强度样品浓度倍数的计算结果，证 实在启动电泳后3分钟获得高达44倍的浓度倍数。

在完成电泳之后，在正极和负极之间施加10秒的反向电压(75V，1 mA)以从凝胶界面释放浓缩的样品。通过使内部被控制处于负压下的微 管尖端接触凝胶界面，能够回收高达10μl的浓缩样品。

实施例3

3、关于高分子凝胶的酸离解常数(pKa)的研究

在这个实施例中，研究了要包含在高分子凝胶中的其残基基团是阴离 子官能团的酸的pKa和核酸浓缩效率之间的关系。分别用丙烯酰甲基丙烷 羧酸(pKa：3.6)和丙烯酰甲基羧酸(pKa：4.6)代替实施例1中采用的丙 烯酰胺溶液(溶液2)中的丙烯酰甲基丙磺酸(pKa：1.0)，形成高分子凝 胶，并制造核酸浓缩回收盒。单独利用各种核酸浓缩回收盒，通过实施例 2中的方法实施核酸的浓缩。

观察到的高分子凝胶周围的各种核酸浓缩回收盒的通道的荧光图像 在图11中示出。利用其中形成包含丙烯酰甲基丙烷羧酸(pKa：3.6)或丙 烯酰甲基羧酸(pKa：4.6)的残基基团作为阴离子官能团的高分子凝胶的 核酸浓缩回收盒，在大范围内检测到荧光，并且样品的一部分移动到超过 高分子凝胶的界面的高分子凝胶中。在另一方面，利用其中形成包含丙烯 酰甲基丙磺酸(pKa：1.0)的残基基团作为阴离子官能团的高分子凝胶的 核酸浓缩回收盒，在较窄范围内以条状检测到荧光。因此，可以理解，样 品在凝胶界面处和附近以高效率浓缩。

实施例4

4、关于通道容量的研究

在这个实施例中，在与实施例1类似的条件下进行核酸的浓缩，只是 利用图4所示形状的核酸浓缩回收盒。相对于作为边界的高分子凝胶，位 于负极侧的扇形通道形成为具有40mm半径和90度中心角并且具有2mm 深度的扇形形状。因此，通道的容量设置为2,512(＝[40×40×3.14×2]/4) μl。作为正极和负极，使用溅射有金(Au)的那些电极。现在假定其中核 酸被高分子凝胶14阻挡的区域为2mm宽、0.1mm长和2mm深，则核酸 理论上能够浓缩至高达6300倍。

样品实际电泳的结果在图12A和图12B以及表3中示出。观察到的 高分子凝胶周围的通道的荧光图像在图12A和图12B中示出。观察到的 图12A的荧光图像在启动电泳之前取得，而图12B的荧光图像在启动电 泳后30秒取得。而且，启动电泳之前和启动电泳之后30秒的荧光强度检 测结果在表3中示出。

表3

  时间(秒)   荧光强度   浓缩率(倍)   0   2.76   -   30   3,382   1,230

如根据前述理解的，利用图4所示形状的核酸浓缩回收盒可以在启动 电泳之后30秒实现1230倍的浓缩率。已经证实，相比于图10中示出的 结果，图4所示形状的核酸浓缩回收盒能够在启动电泳之后30秒时显著 地提高浓缩倍数。

根据本发明的核酸浓缩回收方法操作简单方便，并且能够以高效率在 短时间内浓缩和回收核酸。因此，该核酸浓缩回收方法能够应用于用于核 酸扩增反应如PCR(聚合酶链反应)方法或LAMP(环介导等温扩增)方 法的核酸的浓缩处理，并且能够用来检测样品中即使以痕量或以极低浓度 包含的核酸。

本发明包含与于2011年1月31日向日本专利局提交的日本在先专利 申请JP 2011-017757和于2010年7月7日向日本专利局提交的日本在先 专利申请JP 2010-154692中公开的主题相关的主题，将它们的全部内容结 合于此供参考。

本领域技术人员应当理解，根据设计需要和其他因素，可以出现各种 变形、组合、子组合和改变，只要它们属于所附权利要求或其等同替换的 范围。