法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2014-05-14
授权
授权
2012-03-14
实质审查的生效 IPC(主分类):C07D453/02 申请日:20100125
实质审查的生效
2011-12-21
公开
公开
发明领域
本发明涉及结合并且调节神经元烟碱乙酰胆碱受体活性的化合 物、这些化合物的制备方法、含有这些化合物的组合物和使用这些化 合物治疗各种病症和障碍的方法，包括与中枢神经系统(CNS)功能障碍 相关的那些病症和障碍。
发明背景
靶向神经元烟碱受体(NNRs)、也称作烟碱乙酰胆碱受体(nAChRs) 的化合物的治疗潜能已经成为几个综述的主题(例如，参见Breining 等人，Ann.Rep.Med.Chem.40：3(2005)，Hogg和Bertrand，Curr. Drug Targets：CNS Neurol.Disord.3：123(2004)，Suto and Zacharias，Expert Opin.Ther.Targets 8：61(2004)，Dani等人， Bioorg.Med.Chem.Lett.14：1837(2004)，Bencherif和Schmitt， Curr.Drug Targets：CNS Neurol.Disord.1：349(2002))。在提 出NNR配体为疗法的适应征类型中有认识病，包括阿尔茨海默病、注 意缺陷障碍和精神分裂症(Newhouse等人，Curr.Opin.Pharmacol.4： 36(2004)，Levin和Rezvani，Curr.Drug Targets：CNS Neurol. Disord.1：423(2002)，Graham等人，Curr.Drug Targets：CNS Neurol.Disord.1：387(2002)，Ripoll等人，Curr.Med.Res.Opin. 20(7)：1057(2004)；和McEvoy和Allen，Curr.Drug Targets：CNS Neurol.Disord.1：433(2002))；疼痛和炎症(Decker等人，Curr. Top.Med.Chem.4(3)：369(2004)，Vincler，Expert Opin.Invest. Drugs 14(10)：1191(2005)，Jain，Curr.Opin.Inv.Drugs 5：76 (2004)，Miao等人，Neuroscience 123：777(2004))；抑郁症和焦 虑(Shytle等人，Mol.Psychiatry 7：525(2002)，Damaj等人，Mol. Pharmacol.66：675(2004)，Shytle等人，Depress.Anxiety16：89 (2002))；神经变性(O’Neill等人，Curr.Drug Targets：CNS Neurol. Disord.1：399(2002)，Takata等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.306： 772(2003)，Marrero等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.309：16 (2004))；帕金森病(Jonnala和Buccafusco，J.Neurosci.Res.66： 565(2001))；成瘾(Dwoskin和Crooks，Biochem.Pharmacol.63：89 (2002)，Coe等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.15(22)：4889(2005))； 肥胖(Li等人，Curr.Top.Med.Chem.3：899(2003))；和图雷特 综合征(Sacco等人，J.Psychopharmacol.18(4)：457(2004)，Young 等人，Clin.Ther.23(4)：532(2001))。
在中枢和外周神经系统中都存在nAChR亚型的非纯一分布。例如， 主要在脊椎动物脑中的nAChR亚型是α4β2、α7和α3β2，而在自主神 经节中占主要的那些是α3β4且神经肌肉连接的那些是α1β1δγ和 α1β1δε(参见Dwoskin等人，Exp.Opin.Ther.Patents 10：1561 (2000)和Holliday等人J.Med.Chem.40(26)，4169(1997))。
一些烟碱化合物的局限在于它们因非特异性结合多种nAChR亚型 而与不期望的副作用相关。例如，结合并且刺激肌肉和神经节nAChR 亚型可以导致副作用，这些副作用可以限制特定烟碱结合化合物作为 治疗剂的应用。
本发明的化合物显示高度特异性结合α7 nAChR亚型并且对α4β2 亚型和神经节和肌肉nAChR亚型具有低亲和力。因此，这些化合物可 以用作有这种治疗需要的患者中的α7 nAChRs治疗调节剂，而不会产 生因非特异性nAChR亚型结合导致的副作用。
发明概述
本发明包括(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2] 辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺(式I)或其药学可接受的盐。
本发明的化合物以高度亲和力结合α7亚型的NNRs并且显示对 这种亚型的选择性超过α4β2 NNR亚型和神经节和肌肉亚型。
本发明包括包含本发明化合物或其药学可接受的盐的药物组合 物。本发明的药物组合物可以用于治疗或预防各种病症或障碍，包括 特征在于烟碱胆碱能神经传递功能障碍或烟碱胆碱能神经元变性的那 些障碍。
本发明包括治疗或预防障碍和功能障碍的方法，例如CNS障碍和 功能障碍、炎症、与细菌和/或病毒感染相关的炎症应答、疼痛、代谢 综合征、自体免疫疾病或其他本文进一步详细描述的障碍。本发明包 括调节新生血管形成的方法。这些方法包括对受试者给予治疗有效量 的本发明化合物，包括其盐，或包括这种化合物的药物组合物。
另外，本发明包括具有作为诊断试剂应用和在本文所述受体结合 研究中具有应用的化合物。
本发明的上述和其他方面在如下举出的详细描述和实施例中进 一步详细解释。
附图简述
图1描述了(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2] 辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺或其药学可接受的盐的新目标识别(NOR) 与剂量的关系。对低至0.1mg/kg的剂量观察到具有统计学显著性的 效果。
图2描述了用于测定在给予(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1- 氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺或其药学可接受的盐时 用于新目标识别(NOR)的最小有效剂量的数据。对低至0.03mg/kg的 剂量观察到具有统计学显著性的效果。
图3描述了第3次给予0.1mg/kg(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲 基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺或其药学可接受 的盐后的新目标识别(NOR)与时间的关系。对给药后至6h的剂量观察 到具有统计学显著性的效果。
图4描述了第3次给予0.3mg/kg(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲 基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺或其药学可接受 的盐后的新目标识别(NOR)与时间的关系。对给药后至18h的剂量观 察到具有统计学显著性的效果。
图5描述了对化合物A和化合物B各自与α7烟碱受体的剂量响 应。
图6描述了对与乙酰胆碱(Ach)共同施用化合物A和化合物B各 自的电生理响应。
图7A、7B和7C描述了在活化烟碱α7受体方面化合物A与Ach 相互作用的电生理响应。
图8A、8B和C描述了在活化烟碱α7受体方面化合物B与Ach 相互作用的电生理响应。
图9是化合物A一盐酸盐的x-射线衍射图案。
图10是化合物A一盐酸盐的晶体结构。
图11是化合物A半-半乳糖二酸盐的x-射线衍射图案。
图12示例来自化合物A的盐筛选的盐的六(6)个不同x-射线衍射 图案的覆盖。
图13示例(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2] 辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺在CFA-诱导的热痛觉过敏中的评价结 果。在CFA注射后24小时对8只SD大鼠的组各自皮下给予测试物质、 吗啡和媒介物。在CFA注射前(预-CFA)、治疗前和SC注射后1小时进 行热痛觉过敏。施加一种方式ANOVA，然后进行Dunnett检验，以比 较治疗组与媒介物对照组。将在*P＜0.05水平视为显著性差异。
图14示例Von Frey评价结果，其显示(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基) 甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺在1mg/kg和 10mg/kg剂量下比媒介物治疗组有效减轻了糖尿病神经痛的疼痛。
图15示例(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2] 辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺-治疗的肥胖小鼠(“db-试验品”)中的对 比体重增长为显著较低。值得注意的是，共同给予MLA与 (2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5- 二氟苯甲酰胺的动物未显示因单独给予(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲 基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺的肥胖大鼠显示 的体重增长减低。
图16示例(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2] 辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺-治疗的肥胖(“db-测试制品”)小鼠中的 平均食物消耗量比肥胖对照组中的显著较低。(2S，3R)-N-2-((3-吡啶 基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺(“Db-测试 制品”)未影响瘦型小鼠的食物消耗量。共同给予MLA与 (2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5- 二氟苯甲酰胺的动物未显示因单独给予(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲 基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺的肥胖大鼠显示 的每日平均食物消耗量的减少。
图17示例(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2] 辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺显著抑制肥胖小鼠(“db-试验品”)的空 腹血糖水平。然而，这种效果不会因共同给予MLA而得到逆转。
图18示例(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2] 辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺显著抑制肥胖小鼠(“db-试验品”)的糖 基化HbAlc水平。通过共同给予MLA可以减弱(2S，3R)-N-2-((3-吡啶 基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺导致的糖 基化HbAlc下降。
图19示例(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2] 辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺显著减少了肥胖小鼠(“db-试验品”)中 的促炎细胞因子TNFα。这些效果因共同给予α7拮抗剂MLA而受到抑 制。
图20示例与媒介物治疗的对照组(“db”)相比(2S，3R)-N-2-((3- 吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺导致 肥胖小鼠(“db-试验品”)的甘油三酯水平显著降低。共同给予MLA 未减弱(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3- 基)-3，5-二氟苯甲酰胺导致的甘油三酯下降。
图21示例(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2] 辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺对醋甲胆碱在卵白蛋白-致敏小鼠中的攻 击的Penh响应改变％的效果。在OVA攻击前30min，从第21天至第 25天的连续6天bid皮下给予或qd气管内给予(2S，3R)-N-2-((3-吡 啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺和媒介 物，且在第26天的MCh刺激前30min给予最后一次给药。测定Penh 值。施加一种方式ANOVA，然后进行Dunnett检验以比较OVA免疫接 种媒介物和其他治疗组。*与OVA-媒介物对照组相比P＜0.05。
图22示例(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2] 辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺对卵白蛋白-致敏小鼠中白血细胞计数和 细胞分类计数的效果。在OVA攻击前30min，从第21天至第25天的 连续6天bid皮下给予或qd气管内给予(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲 基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺和媒介物，且在 第26天的支气管肺泡灌洗液采集前30min给予最后一次给药。测定 总白血细胞计数和细胞分类计数。施加一种方式ANOVA，然后进行 Dunnett检验以比较OVA免疫接种媒介物和其他治疗组。*与OVA-媒介 物对照组相比P＜0.05。
图23示例(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2] 辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺对卵白蛋白-致敏小鼠中％白血细胞计数 和细胞分类计数的效果。在OVA攻击前30min，从第21天至第25天 的连续6天bid皮下给予或qd气管内给予(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基) 甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺和媒介物，且 在第26天的支气管肺泡灌洗液采集前30min给予最后一次给药。测 定总白血细胞计数和细胞分类计数。施加一种方式ANOVA，然后进行 Dunnett检验以比较OVA免疫接种媒介物和其他治疗组。*与OVA-媒介 物对照组相比P＜0.05。
详细描述
定义
下列定义的含义在于使定义的术语清楚、但不是限制。如果本文 所用的具体术语没有具体定义，则这种术语不应被视为不明确的。而 是在其可接受的含义内使用术语。
本文所用的术语“化合物”可以用于指(2S，3R)-N-2-((3-吡啶 基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺的游离碱 形式或盐形式，视上下文而定，这将是显而易见的。本领域技术人员 能够区分这种差异。
为便于参照，(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环 [2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺(式I)或其药学可接受的盐也称 作化合物A。另外，本文所用的结构类似物用于对比目的。 (2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-4-氟 苯甲酰胺或其药学可接受的盐称作化合物B。化合物B是WO 04/76449 中公布的外消旋混合物的单一异构体，将该文献引入本文参考。
本文所用的术语“药学可接受的”意指与制剂的其他成分相容且 对药物组合物的接受者而言无害的载体、稀释剂、赋形剂或本发明化 合物的盐形式。
本文所用的术语“药物组合物”意指任选与一种或多种药学可 接受的载体、稀释剂或赋形剂混合的本发明化合物。药物组合物优选 显示对环境条件的稳定程度，以便它们适合于制备和商业化目的。
本文所用的术语“有效量”、″治疗有效量″、″治疗量″或″有效 剂量″意指足以引起期望的药理学或治疗效果的化合物用量，由此导致 对障碍的有效预防或治疗。预防障碍可以通过延缓或防止该障碍进展 和延缓或防止与该障碍相关的症状发作表现出来。可以通过症状减少 或消除、障碍进程抑制或逆转和任何其他促成患者好转来表现治疗障 碍。
正如下文更详细且在参照图1、2、3和4时所讨论的，对式I的 化合物或其药学可接受的盐低至0.03μM/kg的剂量观察到具有统计 学显著性的效果，包括给药后18小时以上观察到的效果。有效剂量可 以根据例如患者病情、障碍症状的严重性和给予药物组合物的方式这 样因素的不同而改变。因此，本文所用的有效剂量可以低于100mg， 优选低于50mg，更优选低于10mg且最优选低于1mg。这些有效剂量 代表了作为单剂量给予的用量或在24小时期限内作为一次或多次剂 量给予的用量。
化合物
本发明的一个方面包括化合物(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲 基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺(式I)或其药学 可接受的盐。
在一个实施方案中，该化合物基本上不含一种或多种 (2R，3S)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5- 二氟苯甲酰胺、(2R，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2] 辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺和(2S，3S)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮 杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺。
在一个实施方案中，是酸加成的盐或其水合物或溶剂合物，其中 所述的酸选自盐酸、甲磺酸、马来酸、磷酸、1-羟基-2-萘甲酸、丙二 酸、L-酒石酸、富马酸、柠檬酸、L-苹果酸、R-扁桃酸、S-扁桃酸、 琥珀酸、4-乙酰氨基苯甲酸、己二酸、半乳糖二酸、二-对-甲苯酰基 -D-酒石酸、草酸、D-葡糖醛酸、4-羟基苯甲酸、4-甲氧基苯甲酸、 (1S)-(+)-10-樟脑磺酸、(1R，3S)-(+)-樟脑酸和对-甲苯磺酸。在另一 个实施方案中，酸与(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环 [2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺的摩尔比为1∶2或1∶1。
本发明的另一个方面包括选自如下的化合物：
(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3- 基)-3，5-二氟苯甲酰胺一盐酸盐或其水合物或溶剂合物；
(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3- 基)-3，5-二氟苯甲酰胺一-磷酸盐或其水合物或溶剂合物；
(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3- 基)-3，5-二氟苯甲酰胺一-4-羟基苯甲酸盐或其水合物或溶剂合物；和
(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3- 基)-3，5-二氟苯甲酰胺半-4-羟基苯甲酸盐或其水合物或溶剂合物。
本发明的另一个方面包括化合物(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲 基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺或其药学可接受 的盐，其包含低于25％、优选包含低于15％、优选包含低于5％、优选 包含低于2％、优选包含低于1％的(2R，3R)-，(2S，3S)-或 (2R，3S)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5- 二氟苯甲酰胺重量，它们可以是单独的，也可以是组合方式的。
本发明的另一个方面包括化合物(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲 基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺(式I)或其药学 可接受的盐，其基本上为结晶。另一个方面包括化合物 (2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5- 二氟苯甲酰胺盐酸盐的多晶型，其特征在于包含如下峰的±0.5度2θ 内的一个或多个峰的x-射线衍射图案：
本发明的另一个方面是化合物(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲 基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺盐酸盐的多晶型 物，其特征在于基本上相当于图9的x-射线粉末衍射图案。
本发明的另一个方面包括本发明的化合物在制备治疗或预防α7- 介导的疾病或功能障碍的药物中的应用。本发明的另一个方面包括治 疗或预防α7-介导的疾病或功能障碍的方法，包含给予治疗有效量的 本发明化合物。本发明的另一个方面包括用于治疗或预防α7-介导的 疾病或功能障碍的本发明化合物。在一个实施方案中，所述的疾病或 功能障碍选自：
i)疼痛，包括一种或多种急性痛、神经性疼痛、炎症性疼痛、 神经病性疼痛、慢性痛、严重慢性痛、手术后疼痛、与癌症相关的疼 痛、心绞痛、肾或胆绞痛、月经痛、偏头痛、痛风、关节炎、类风湿 病、腱鞘炎、脉管炎、三叉神经或疱疹性神经痛、糖尿病神经病变疼 痛、皮肤灼痛、腰痛、传入神经阻滞综合征和臂丛撕脱伤；
ii)代谢综合征、体重增长、I型糖尿病、II型糖尿病或糖尿病 神经病变；
iii)炎症，包括一种或多种银屑病、哮喘、动脉粥样硬化、特 发性肺纤维化、慢性和急性炎症、银屑病、内毒素血症、痛风、急性 假痛风、急性痛风性关节炎、关节炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、 同种异体移植排斥、慢性移植物排斥、哮喘、动脉粥样硬化、单核吞 噬细胞依赖性肺损伤、特应性皮炎、慢性阻塞性肺疾病、成人呼吸窘 迫综合征、镰刀形细胞病中的急性胸部综合征、炎性肠病、克罗恩病、 溃疡性结肠炎、急性胆管炎、阿弗他口炎(aphteous stomatitis)、隐 窝炎、肾小球肾炎、狼疮肾炎、血栓形成和移植物抗宿主反应；和
iv)认知，包括一种或多种与年龄相关的记忆缺陷、轻度认知缺 损、早老痴呆症、早发阿尔茨海默病、老年性痴呆、阿尔茨海默型痴 呆、轻度至中度阿尔茨海默型痴呆、Lewy体痴呆、血管性痴呆、阿尔 茨海默病、中风、艾滋病痴呆复合征、注意缺陷障碍、注意力缺陷伴 多动障碍、诵读困难、精神分裂症、精神分裂症样精神障碍、情感性 分裂症、精神分裂症中的认知缺陷和精神分裂症中的认知功能障碍。
本发明的另一个方面包括药物组合物，其包含本发明的化合物和 一种或多种药学可接受的载体。
本发明的另一个方面包括促进乙酰胆碱-诱导的电流的方法，包 含给予有效量的本发明化合物。
本发明的另一个实施方案包括任一实施例所涉及的 (2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5- 二氟苯甲酰胺或其药学可接受的盐。
本发明的另一个实施方案包括用作活性治疗物质的 (2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5- 二氟苯甲酰胺或其药学可接受的盐。
本发明的另一个实施方案包括调节有此需要的受试者NNR的方 法，通过给予(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛 -3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺或其药学可接受的盐来进行。
本发明的范围包括各方面和实施方案的组合。
除非另作陈述，否则本文所述的结构还指包括仅在一种或多种富 含同位素的原子的存在下不同的化合物。例如，具有本发明结构除外 氢原子被氘或氚替代或碳原子被13C或4C替代或氮原子被15N替代或氧 原子被17O或18O替代的化合物属于本发明的范围。这种同位素标记的 化合物用作研究或诊断工具。
本发明包括(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2] 辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺的盐或溶剂合物，包括其组合，例如盐的 溶剂合物。本发明的化合物可以以溶剂化形式存在，例如水化形式， 以及非溶剂化形式，且本发明包括所有这种形式。
典型地，本发明的盐是药学可接受的盐，但并非完全如此。术语 ″药学可接受的盐″范围内包括的盐意指本发明化合物的无毒性盐。
适合的药学可接受的盐的实例包括无机酸加成盐，例如氯化物、 溴化物、硫酸盐、磷酸盐和硝酸盐；有机酸加成盐，例如乙酸盐、半 乳糖二酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、羟乙酸盐、苹果酸盐、酒 石酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、甲磺酸盐、对-甲苯磺酸盐 和抗坏血酸盐；与酸性氨基酸形成的盐，例如天冬氨酸盐和谷氨酸盐； 碱金属盐，例如钠盐和钾盐；碱土金属盐，例如镁盐和钙盐；铵盐； 有机碱盐，例如三甲胺盐、三乙胺盐、吡啶盐、甲基吡啶盐、二环己 基胺盐和N，N′-二苄基乙二胺盐；和与碱性氨基酸形成的盐，例如赖 氨酸盐和精氨酸盐。在一些情况中，所述的盐可以是水合物或乙醇溶 剂合物。
正如本文所注意到的，本发明包括特定的化合物，其在本文中被 鉴定为具有特异性。本发明的化合物可以通过各种方法制备，包括众 所周知的标准合成方法。示例性一般合成方法如下举出且然后在制备 实施例中制备本发明的特定化合物。
在下文所述的所有实施例中，如果必要，根据合成化学的一般原 理使用敏感性或反应性基团的保护基。根据有机合成的标准方法操作 保护基(例如，参见T.W.Green和P.G.M.Wuts，Protecting Groups in Organic Synthesis，第3版，John Wiley & Sons，New York (1999))。使用本领域技术人员易于显而易见的方法在化合物合成的便 利的阶段除去这些基团。方法的选择和反应条件及其执行次序应与本 发明化合物的制备一致。
本发明还提供了用作制备本发明化合物中间体的化合物合成方 法及其制备方法。
根据下列方法、使用易于得到的原料和试剂制备这些化合物。在 这些反应中，可以使用变化形式，其自身是本领域技术人员已知的， 但未更详细地举出。
盐形式
本发明的一个方面涉及(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂 双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺的新的盐形式。
游离碱形式的(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环 [2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺是具有有限水溶性的固体。然而， 该游离碱将与无机酸和有机酸反应形成一些酸加成的盐，其具有有利 于制备药物组合物的物理特性，例如结晶性、水溶性和对化学降解的 稳定性。典型地，这些盐形式是药学可接受的盐。
本发明包括(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2] 辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺的药学可接受的盐。适合的药学可接受的 盐的实例包括无机酸加成盐，例如氯化物、溴化物、硫酸盐、磷酸盐 和硝酸盐；有机酸加成盐，例如乙酸盐、半乳糖二酸盐、丙酸盐、琥 珀酸盐、乳酸盐、羟乙酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、马来 酸盐、富马酸盐、甲磺酸盐、对-甲苯磺酸盐和抗坏血酸盐；与酸性氨 基酸形成的盐，例如天冬氨酸盐和谷氨酸盐；碱金属盐，例如钠盐和 钾盐；碱土金属盐，例如镁盐和钙盐；铵盐；有机碱盐，例如三甲胺 盐、三乙胺盐、吡啶盐、甲基吡啶盐、二环己基胺盐和N，N′-二苄基 乙二胺盐；和与碱性氨基酸形成的盐，例如赖氨酸盐和精氨酸盐。在 一些情况中，所述的盐可以是水合物或溶剂合物，例如乙醇溶剂合物。
本发明的一个方面包括(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂 双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺的酸加成的盐，其中所述的 酸选自盐酸、甲磺酸、马来酸、磷酸、1-羟基-2-萘甲酸、丙二酸、L- 酒石酸、富马酸、柠檬酸、L-苹果酸、R-扁桃酸、S-扁桃酸、琥珀酸、 4-乙酰氨基苯甲酸、己二酸、半乳糖二酸、二-对-甲苯酰基-D-酒石酸、 草酸、D-葡糖醛酸、4-羟基苯甲酸、4-甲氧基苯甲醛、(1S)-(+)-10- 樟脑磺酸、(1R，3S)-(+)-樟脑酸和对-甲苯磺酸。本发明还包括这些盐 形式的水合物和溶剂合物。
盐在本发明所占的化学计算量可变。例如，典型地，酸与 (2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5- 二氟苯甲酰胺的摩尔比为1∶2或1∶1，但其他比例，例如3∶1、1∶3、 2∶3、3∶2和2∶1是可能的。
在本发明的一个实施方案中，所述的盐具有的酸与 (2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5- 二氟苯甲酰胺的化学计算量为1∶2。在另一个实施方案中，所述的盐 具有的酸与(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛 -3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺的化学计算量为1∶1。
正如本文所注意到的，根据本文所述的盐的形成方式的不同，这 些盐可以具有封闭成盐过程中存在的溶剂的晶体结构。因此，盐可以 作为相对于(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛 -3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺可变溶剂化学计算量的水合物和其他溶剂 合物形式存在。
本发明的另一个实施方案包括(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲 基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺或其水合物或溶 剂合物。
本发明的另一个实施方案包括(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲 基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺一盐酸盐或其水 合物或溶剂合物。
本发明的另一个实施方案包括(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲 基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺一-磷酸盐或其 水合物或溶剂合物。
本发明的另一个实施方案包括(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲 基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺一-4-羟基苯甲 酸盐或其水合物或溶剂合物。
本发明的另一个实施方案包括(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲 基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺半-4-羟基苯甲 酸盐或其水合物或溶剂合物。
本发明的另一个方面包括所述盐的制备方法。形成盐的精确条件 可以通过经验确定、可以通过在受控条件下结晶得到盐。
本发明的一个实施方案包括(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1- 氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺或其药学可接受的盐的 制备方法，所述化合物包含低于25％、优选低于15％、更优选低于5％、 甚至更优选低于2％且最优选低于1％的(2R，3R)-、(2S，3S)-或(2R，3S)- N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲 酰胺重量，它们可以是单独的或组合的形式。
盐形式的制备方法可以改变。(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲 基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺盐形式的制备方 法典型地包括：
(i)混合游离碱或适当纯(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮 杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺游离碱在适合溶剂中的溶 液与任意纯形式的酸或作为任意酸在适合溶剂中的溶液，典型地0.5 -1当量的酸；
(ii)(a)如果必要，冷却得到的盐溶液，产生沉淀；或
(ii)(b)加入适合的抗溶剂，产生沉淀；或
(ii)(c)蒸发第一种溶剂，加入新溶剂，重复步骤(ii)(a)或 步骤(ii)(b)；
(iii)过滤并且收集盐。
所用化学计算量、溶剂混合物、溶质浓度和温度可变。可以用于 制备或重结晶盐形式的有代表性的溶剂包括、但不限于乙醇、甲醇、 丙醇、异丙醇、乙酸异丙酯、丙酮、乙酸乙酯、甲苯、水、甲基乙基 酮、甲基异丁基酮、叔丁基甲基醚、四氢呋喃、二氯甲烷、正庚烷和 乙腈。
几种这些盐显示足以在生产药物制剂中建立起希望的稳定性。这 种稳定性可以以各种方式显示。可以通过动态水蒸气吸附(DVS)评价得 到和释放大气湿度的特性。
一般合成方法
通过O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N，1-四亚甲基脲六氟磷酸盐(HBTU) 为介体的如合成路线1示例的(2S，3R)-3-氨基-2-((3-吡啶基)甲 基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷(如PCT/US08/71872中所述得到，将该文 献有关这种合成的内容引入本文参考)和3，5-二氟苯甲酸偶合合成 (2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5- 二氟苯甲酰胺。
合成路线1
可以类似地通过使用其他试剂活化羧酸合成(2S，3R)-N-2-((3- 吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺。例 如，活化剂例如N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、(苯并三唑-1-基氧 基)三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP)、(苯并三唑-1-基氧基)三吡 咯烷磷鎓六氟磷酸(PyBOP)、O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-双(四亚 甲基)脲六氟磷酸盐(HBPyU)、O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四亚甲 基脲六氟磷酸盐(HBTU)、O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四亚甲基脲 四氟硼酸盐(TBTU)和(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺) (EDCI)与1-羟基苯并三唑(HOBt)以及例如Kiso和Yajima在 Peptides，pp 39-91，Academic Press，San Diego，CA(1995)中所 述的那些试剂的应用是本领域技术人员众所周知的。
治疗方法
本发明的化合物具有选择性结合和调节α7活性的能力。因此， 这些化合物可以用于预防或治疗已经提出或显示用作治疗剂的其他类 型烟碱化合物所应用于的不同病症或障碍，例如CNS障碍、炎症、与 细菌和/或病毒感染相关的炎症应答、疼痛、代谢综合征、自体免疫疾 病或其他本文进一步详细描述的障碍。这些化合物可以用于调节新生 血管形成和用作受体结合研究中的诊断试剂(体外和体内)。这种治疗 和其他教导描述在下列文献中，例如：Williams等人，Drug News Perspec.7(4)：205(1994)，Arneric等人，CNS Drug Rev.1(1)：1-26 (1995)，Arneric等人，Exp.Opin.Invest.Drugs 5(1)：79-100 (1996)，Bencherif等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.279：1413 (1996)，Lippiello等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.279：1422 (1996)，Damaj等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.291：390(1999)； Chiari等人，Anesthesiology 91：1447(1999)，Lavand’ homme and Eisenbach，Anesthesiology 91：1455(1999)，Holladay等人，J.Med. Chem.40(28)：4169-94(1997)，Bannon等人，Science 279：77 (1998)，Bencherif等人的PCT WO 94/08992、PCT WO 96/31475、PCT WO 96/40682和美国专利US 5,583,140、Dull等人的美国专利US 5,597,919、Smith等人的美国专利US 5,604,231和Cosford等人的美 国专利US 5,852,041和本文上述举出的其他参考文献。
CNS障碍
化合物及其药物组合物用于治疗或预防各种CNS障碍，包括神经 变性障碍、神经精神病、神经病学障碍和成瘾。所述化合物及其药物 组合物可以用于：治疗或预防认知缺陷和功能障碍，它们与年龄相关， 也可以不相关；注意力障碍和痴呆，包括因病原体或代谢紊乱导致的 那些；提供神经保护；治疗惊厥和多发性脑梗死；治疗情绪障碍、强 迫和成瘾行为；提供止痛；控制炎症例如细胞因子和核因子K B介导； 治疗炎症性障碍；提供疼痛缓解；和作为治疗细菌、真菌和病毒感染 的抗感染药治疗感染。在本发明化合物和药物组合物可以用于治疗或 预防的障碍、疾病和病症中有：与年龄相关的记忆缺陷(AAMI)、轻度 认知损害(MCI)、与年龄相关的认知下降(ARCD)、早老痴呆症、早发阿 尔茨海默病、老年性痴呆、阿尔茨海默型痴呆、阿尔茨海默病、无痴 呆的认知损害(CIND)、Lewy体痴呆、HIV-痴呆、艾滋病痴呆复合征、 血管性痴呆、唐氏综合征、头创伤、外伤性脑损伤(TBI)、拳击员痴呆、 海绵状脑病和朊病毒病、中风、局部缺血、注意缺陷障碍、注意力缺 陷伴多动障碍、诵读困难、精神分裂症、精神分裂症样精神障碍、情 感性分裂症、精神分裂症中的认知功能障碍、精神分裂症中的认知缺 陷、帕金森综合病包括帕金森病、脑炎后帕金森病、Gaum帕金森痴呆、 帕金森型额颞叶痴呆症(FTDP)、皮克病、尼曼-皮克二氏病、亨廷顿病、 亨廷顿舞蹈病、迟发性运动障碍、运动过度、进行性核上麻痹、进行 性核上轻瘫、腿多动综合征、库杰二氏病、多发性硬化、肌萎缩侧索 硬化(ALS)、运动神经元病(MND)、多系统萎缩(MSA)、皮质基底性变 性、格-巴二氏综合征(GBS)和慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病 (CIDP)、癫痫症、常染色体显性遗传夜间发作性额叶癫痫、躁狂、焦 虑、抑郁症、月经前烦躁不安、惊恐障碍、食欲亢进、食欲减退、发 作性睡病、白天睡眠过多、双相情感障碍、一般焦虑症、强迫性障碍、 愤怒性情感爆发、对立违抗性障碍、图雷特综合征、孤独症、药物和 酒精成瘾、烟草成瘾、肥胖、恶病质、银屑病、狼疮、急性胆管炎、 阿弗他口炎、溃疡、哮喘、溃疡性结肠炎、炎性肠病、克罗恩病、痉 挛性张力失常、腹泻、便秘、隐窝炎、病毒性肺炎、关节炎(包括类风 湿性关节炎和骨关节炎)、内毒素血症、脓毒症、动脉粥样硬化、特发 性肺纤维化、急性痛、慢性痛、神经病、尿失禁、糖尿病和瘤形成。
认知损害或功能障碍可以与精神疾病或病症相关，例如精神分裂 症和其他精神病包括、但不限于精神障碍、精神分裂症样精神障碍、 情感性分裂症、妄想症、短时精神障碍、感应性精神疾患和因一般医 学病症导致的精神病、痴呆和其他认识病包括、但不限于轻度认知损 害、早老痴呆症、阿尔茨海默病、老年性痴呆、阿尔茨海默型痴呆、 与年龄相关的记忆缺陷、Lewy体痴呆、血管性痴呆、艾滋病痴呆复合 征、诵读困难、帕金森综合病包括帕金森病、认知损害和帕金森病痴 呆、多发性硬化的认知损害、因外伤性脑损伤导致的认知损害、因其 他医学病症导致的痴呆、焦虑症包括、但不限于无广场恐怖症的惊恐 障碍、恐怖性障碍伴广场恐怖、广场恐怖不伴恐怖性病症史、特异恐 怖、社会恐怖症、强迫性障碍、创伤后精神紧张性障碍、急性应激障 碍、一般焦虑症和因一般医学病症导致的一般焦虑症、情绪障碍包括、 但不限于严重抑郁障碍、心境恶劣障碍、双相抑郁症、双极躁狂、I 型双相情感障碍、与躁狂、抑郁相关的抑郁症或混合发作、II型双相 情感障碍、循环型情感障碍和因一般医学病症导致的情绪障碍、睡眠 障碍包括、但不限于睡眠障碍、原发性失眠、原发性嗜睡症、发作性 睡病、深眠障碍、恶梦障碍、夜惊症和梦行症、精神发育迟滞、学习 障碍、运动技能障碍、交流障碍、综合性精神发育障碍、注意缺陷和 分裂行为病、注意缺陷障碍、注意力缺陷伴多动障碍、婴儿、儿童或 成年人摄食和进食障碍、抽搐性运动障碍、排除障碍、物质相关性障 碍包括、但不限于物质依赖、物质滥用、物质中毒、物质戒断、酒精 有关的病症、苯丙胺或苯丙胺样相关病症、咖啡因有关的障碍、大麻 有关的障碍、可卡因有关的障碍、致幻剂有关的障碍、吸入剂有关的 障碍、尼古丁有关的障碍、阿片有关的障碍、苯环利定或苯环利定样 相关障碍和镇静药-、催眠药-或抗焦虑药-相关障碍、人格障碍包括、 但不限于强迫型人格障碍和冲动控制障碍。
可以使用经验证的认知衡量标准评价认识性能，例如阿尔茨海默 病评价标准(ADAS-cog)的认知亚标准。本发明化合物有效性在改善认 知中的一种措施可以包括根据这种衡量标准测定患者的改变度。
上述病症和障碍进一步在如下文献中详细讨论，例如：American Psychiatric Association：Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，第4版，修订版，Washington，DC，American Psychiatric Association，2000。该手册还更详细描述了与物质应用、 滥用和依赖相关的症状和诊断特征。
炎症
已知主要通过迷走神经的神经系统通过抑制巨噬细胞肿瘤坏死因 子(TNF)释放调节先天免疫应答强度。这种生理学机制称作“胆碱能抗 炎途径”(例如，参见Tracey，“The inflammatory reflex，”Nature 420：853-9(2002))。过度炎症和肿瘤坏死因子合成导致病态且甚至 导致各种疾病的死亡率。这些疾病包括、但不限于内毒素血症、类风 湿性关节炎、骨关节炎、银屑病、哮喘、动脉粥样硬化、特发性肺纤 维化和炎性肠病。
可以通过给予本文所述的化合物治疗或预防的炎性病症包括、但 不限于慢性和急性炎症、银屑病、内毒素血症、痛风、急性假痛风、 急性痛风性关节炎、关节炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、同种异体 移植排斥、慢性移植物排斥、哮喘、动脉粥样硬化、单核吞噬细胞依 赖性肺损伤、特发性肺纤维化、特应性皮炎、慢性阻塞性肺疾病、成 人呼吸窘迫综合征、镰刀形细胞病中的急性胸部综合征、炎性肠病、 克罗恩病、溃疡性结肠炎、急性胆管炎、阿弗他口炎、隐窝炎、肾小 球肾炎、狼疮肾炎、血栓形成和移植物抗宿主反应。
与细菌和/或病毒感染相关的炎症应答
许多细菌和/或病毒感染与毒素形成引起的副作用和身体对细菌 或病毒和/或毒素的天然应答相关。身体对感染的应答通常涉及产生大 量TNF和/或其他细胞因子。这些细胞因子的超表达可以导致明显损 伤，例如脓毒性休克(当细菌是脓毒症时)、内毒素性休克、尿脓毒病 和中毒性休克综合征。
细胞因子表达由NNRs介导并且可以通过给予这些受体的激动剂 或部分激动剂抑制。本文所述的是这些受体的激动剂或部分激动剂的 那些化合物由此可以用于将与细菌感染以及病毒和真菌感染相关的炎 症应答降至最低限度。这种细菌感染的实例包括炭疽、食物中毒和脓 毒症。这些化合物的一些还可以具有抗微生物特性。
这些化合物还可以用作与现存疗法的辅助疗法，以处置细菌、病 毒和真菌感染，例如抗生素、抗病毒药和抗真菌药。抗毒素类还可以 用于结合传染原产生的毒素并且能够结合毒素以通过身体，但不产生 炎症应答。抗毒素类的实例公开在例如Bundle等人的美国专利 US6,310,043中。对细菌和其他毒素有效的其他活性剂可以是有效的 并且其治疗效果可以通过共同给予本文所述的化合物补充。
疼痛
可以给予所述化合物以治疗和/或预防疼痛，包括急性痛、神经性 疼痛、炎症性疼痛、神经病性疼痛和慢性痛。本文所述化合物的止痛 活性可以在持续性炎症性疼痛和神经病性疼痛的模型中得以证实，如 美国公布专利申请号US20010056084 A1(Allgeier等人)中所述进行 (例如炎症性疼痛的弗氏完全佐剂大鼠模型中的机械性痛觉过敏和神 经病性疼痛的小鼠部分坐骨神经结扎模型中的机械性痛觉过敏)。
止痛效果适合于治疗不同起源或病因的疼痛，特别是治疗炎症性 疼痛和相关痛觉过敏、神经病性疼痛和相关痛觉过敏、慢性痛(例如严 重慢性痛、手术后疼痛和与各种病症相关的疼痛包括癌症、肾或胆绞 痛、月经痛、偏头痛和痛风)。炎症性疼痛可以具有不同起源，包括关 节炎和类风湿病、腱鞘炎和脉管炎。神经病性疼痛包括三叉神经或疱 疹性神经痛、糖尿病神经病变疼痛、皮肤灼痛、腰痛和传入神经阻滞 综合征例如臂丛撕脱伤。
新生血管形成
α7 NNR与新生血管形成相关。例如，通过给予α7 NNR拮抗剂(或 在一定剂量下，部分激动剂)抑制新生血管形成可以治疗或预防特征在 于不期望的新生血管形成或血管发生的病症。这种病症可以包括特征 在于炎症性血管发生和/或局部缺血-诱发的血管发生的那些病症。还 可以通过给予本文所述的那些作为α7 NNR拮抗剂或部分激动剂起作 用的化合物抑制与肿瘤生长相关的新生血管形成。
α7 NNR-特异性活性的特异性拮抗作用减少了对炎症、局部缺血 和瘤形成的生成血管响应。有关用于评价本文所述化合物的适合的动 物模型系统的指导原则可以在例如Heeschen，C.等人的“A novel angiogenic pathway mediated by non-neuronal nicotinic acetylcholine acceptors，”J.Clin.Invest.110(4)：527-36(2002) 中找到。
可以使用本文所述化合物治疗的有代表性的肿瘤类型包括 NSCLC、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、口咽癌、 下咽癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、胆囊癌、胆管癌、小肠癌、 泌尿道癌、肾癌、膀胱癌、尿路上皮癌、女性生殖道癌、宫颈癌、子 宫癌、卵巢癌、绒毛膜癌、妊娠滋养细胞疾病、男性生殖道癌、前列 腺癌、精囊癌、睾丸癌、生殖细胞肿瘤、内分泌腺癌、甲状腺癌、肾 上腺癌、垂体腺癌、皮肤癌、血管瘤、黑素瘤、肉瘤、骨和软组织肉 瘤、卡波西肉瘤、脑肿瘤、神经肿瘤、眼肿瘤、脑膜肿瘤、星形细胞 瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经瘤、神经母 细胞瘤、许旺细胞瘤、脑膜瘤、来源于血液恶性肿瘤的实体瘤(例如白 血病、绿色瘤、浆细胞瘤和真菌斑和瘤和皮肤T-细胞淋巴瘤/白血病 的斑块和肿瘤)和来源于淋巴瘤的实体瘤。
还可以将所述化合物与抗癌疗法的其他形式结合给予，包括与抗 肿瘤药共同给予，例如顺铂、阿霉素、道诺霉素等和/或例如本领域公 知的抗-VEGF(血管内皮生长因子)药。
可以按照靶向至肿瘤部位这样的方式给予所述化合物。例如，可 以以与使微粒定向于肿瘤的不同抗体缀合的微球、微粒或脂质体形式 给予所述化合物。另外，化合物可以存在于微球、微粒或脂质体中， 它们以适当的大小通过动脉和静脉，但临时居于肿瘤周围的毛细血管 床中并且将化合物具备施用于肿瘤。这种递药装置是本领域公知的。
其他障碍
除治疗CNS障碍、炎症和不期望的新生血管形成外，本发明的化 合物还可以用于预防或治疗一些其他病症、疾病和障碍，其中NNRs 起作用。实例包括：自体免疫疾病，例如狼疮；与细胞因子释放相关 的障碍；感染继发性恶病质(例如作为AIDS中出现的、艾滋病相关复 合症和瘤形成)、肥胖、pemphitis、尿失禁、视网膜疾病、感染性疾 病、肌无力、伊顿-兰伯特综合征、高血压、骨质疏松症、血管收缩、 血管扩张、心律失常、I型糖尿病、食欲亢进、食欲减退和公布的PCT 申请WO 98/25619中举出的那些适应征。还可以给予本发明的化合物 以治疗惊厥，例如是癫痫症症状的那些，和治疗例如梅毒和库杰二氏 病这样的病症。
诊断应用
化合物可以以诊断组合物的形式使用，例如探针，特别是在修饰 它们以包括适合标记时。探针可以用于例如测定特异性受体的相对数 量和/或功能，特别是α7受体亚型。为了这一目的，最优选用放射性 同位素部分例如11C、18F、76Br、123I或125I标记本发明的化合物。
可以使用公知的适合于所用标记的检测方法检测给予的化合物。 检测方法的实例包括正电子发射体层摄影(PET)和单光子发射型计算 机体层摄影(SPECT)。上述放射性标记用于PET(例如11C、18F或76Br) 和SPECT(例如123I)成像，其中半衰期11C约20.4分钟、18F约109 分钟、123I约13小时且76Br约16小时。高度特异性活性是在不饱和 浓度下使选择的受体亚型显现所需的。给药剂量典型地低于毒性范围 且提供高对比度高影像。预期化合物能够以非毒性水平给药。以放射 性成像领域普通技术人员公知的方式进行剂量测定。例如，参见 London等人的美国专利US5,969,144。
使用已知技术给予化合物。例如，参见London等人的美国专利 US5,969,144。可以以掺入其他成分的制剂组合物形式给予化合物，例 如用于配制诊断组合物的那些类型的成分。最优选以高纯度形式使用 根据实施本发明所用的化合物。参见Elmalch等人的美国专利 US5,853,696。
在对受试者(例如人体受试者)给予化合物后，可以通过适当的技 术使受试者体内存在的该化合物成像和定量，以显示选择的NNR亚型 的存在、量和功能性。除人以外，还可以对动物给予化合物，例如小 鼠、大鼠、狗和猴子。可以使用任意适合的技术和仪器进行SPECT和 PET成像。参见Villemagne等人的：Arneric等人(Eds.)Neuronal Nicotinic Acid Receptors：Pharmacology and Therapeutic Opportunities，235-250(1998)和Elmalch等人的美国专利 US5,853,696。
放射性标记的化合物以高度亲和力结合选择的NNR亚型(例如α7) 且优选显示可忽略不计的与其他烟碱胆碱能受体亚型(例如α4β2和 与肌肉和神经节相关的那些受体亚型)的非特异性结合。照此，所述化 合物可以用作受试者体内、特别是脑内的烟碱胆碱能受体亚型的非侵 害性成像，以便进行与各种CNS疾病和障碍相关的诊断。
在一个方面中，诊断组合物可以用于诊断受试者例如人体患者疾 病的方法中。该方法包括对该患者给予如本文所述的可检测标记的化 合物和检测该化合物与选择的NNR亚型(例如α7受体亚型)的结合。 使用诊断工具例如PET和SPECT的本领域技术人员可以使用本文所述 的放射性标记的化合物诊断各种病症和障碍，包括与中枢和自主神经 系统功能障碍相关的病症和障碍。这种障碍包括各种CNS疾病和障碍， 包括阿尔茨海默病、帕金森病和精神分裂症。可以评价的这些和其他 有代表性的疾病和障碍在Bencherif等人的美国专利US5,952,339中 举出。
在另一个方面中，诊断组合物可以用于监测受试者例如人体患者 选择性烟碱受体亚型的方法。该方法包括对该患者给予如本文所述的 可检测标记的化合物和检测该化合物与选择的烟碱受体亚型即α7受 体亚型的结合。
受体结合
本发明的化合物可以用作结合NNR亚型、特别是α7受体亚型的 化合物的结合试验中的参比配体。就该目的而言，优选用放射性同位 素部分例如3H或14C标记本发明的化合物。这种结合试验的实例在下 文中详细描述。
药物组合物
尽管能够以散装活性化学物质的形式给予本发明的化合物，但是 优选以药物组合物或制剂的形式给予化合物。因此，本发明的一个方 面包括药物组合物，其包含本发明的化合物和一种或多种药学可接受 的载体、稀释剂或赋形剂。本发明的另一个方面提供了药物组合物的 制备方法，包括将本发明的化合物与一种或多种药学可接受的载体、 稀释剂或赋形剂混合。
本发明化合物的给药方式可变。优选通过口服给予本发明的化合 物。用于口服给药的优选药物组合物包括片剂、胶囊、小药囊、糖浆 剂、溶液和混悬剂。可以以改进释放剂型例如定时释放片剂和胶囊剂 的形式提供本发明的药物组合物。
还可以通过注射即静脉内、肌内、皮下、腹膜内、动脉内、鞘内 和脑室内注射给予药物组合物。静脉给药是优选的注射方法。用于注 射剂的适合的载体是本领域技术人员众所周知的且包括5％葡萄糖溶 液、盐水和磷酸缓冲盐水。
还可以使用其他方式例如直肠给药给与所述的制剂。用于直肠给 药的制剂例如栓剂是本领域技术人员众所周知的。还可以通过如下方 式给予所述化合物：以吸入形式，例如，以气雾剂的形式；通过局部， 例如以洗剂形式；通过透皮，例如使用透皮贴剂(例如通过使用商购自 Novartis和Alza Corporation的技术)；通过粉末注射；或通过口含、 舌下或鼻内吸入。
可以将药物组合物配制成单位剂型或多或亚剂量形式。
本文所述的药物组合物的给药可以间断或以逐步、连续、恒定或 受控速率进行。可以将药物组合物给予温血动物，例如哺乳动物，例 如小鼠、大鼠、猫、兔子、狗、猪、牛或猴子；但有利的是对人给药。 此外，药物组合物的给药天数和每天给药次数可变。
本发明的化合物可以用于治疗各种障碍和病症，照此，可以用于 与各种其他用于治疗或预防那些障碍或病症的适合的治疗剂联用。因 此，本发明的一个实施方案包括给予本发明的化合物与其他治疗性化 合物的组合。例如，本发明的化合物可以与如下治疗剂联用：其他NNR 配体(例如伐尼克兰)、抗氧化剂(例如自由基清除剂)、抗菌剂(例如青 霉素抗生素类)、抗病毒药(例如核苷类似物如齐多夫定和阿昔洛韦)、 抗凝血药(例如华法林)、抗炎药(例如NSAIDs)、解热药、镇痛药、麻 醉药(例如用于手术)、乙酰胆碱酯酶抑制剂(例如多奈哌齐和加兰他 敏)、抗精神病药(例如氟哌啶醇、氯氮平、奥氮平和喹硫平)、免疫抑 制剂(例如环孢素和甲氨蝶呤)、神经保护药、类固醇(例如类固醇激 素)、皮质类固醇(例如地塞米松、泼尼松(predisone)和氢化可的松)、 维生素类、矿物、营养制品、抗抑郁药(例如丙米嗪、氟西汀、帕罗西 汀、依地普仑、舍曲林、文拉法辛和度洛西汀)、抗焦虑剂(例如阿普 唑仑和丁螺环酮)、抗惊厥药(例如苯妥英和加巴喷丁)、血管扩张剂(例 如哌唑嗪和西地那非)、情绪稳定剂(例如丙戊酸盐和阿立哌唑)、抗癌 药物(例如抗增殖药)、抗高血压药(例如阿替洛尔、可乐定、氨氯地平、 维拉帕米和奥美沙坦)、轻泻药、湿润性泻药、利尿药(例如呋塞米)、 解痉药(anti-spasmotics)(例如双环维林)、抗运动障碍药和抗溃疡 药(例如埃索美拉唑)。可以将这种药物活性剂的组合同时或以任意次 序依次给予。选择化合物或活性剂的量和给药相对定时，以达到期望 的治疗效果。本发明化合物与其他治疗剂的联合给药可以通过同时给 药以如下方式组合进行：(1)包括两种化合物的单一药物组合物；或 (2)各自包括化合物之一的单独的药物组合物。或者，可以以依次方 式分别给予所述组合，其中首先给予一种治疗剂，然而给予第二种治 疗剂。这种依次的给药可以在相近的时间或间隔较长时间进行。
本发明的另一个方面包括联合疗法，其包含对受试者给予治疗或 预防有效量的本发明化合物和一种和多种其他疗法，包括化疗、放疗、 基因疗法或免疫疗法。
实施例
提供下列实施例是为了示例本发明，但不应将其视为对本发明的 限制。在这些实施例中，除非另有注解，否则所有份数和百分比均按 重量计。
核磁共振(NMR)光谱法
使用安装自动采样器并且被DRX400操作台控制的Varian Unity 300MHz仪器或Bruker 400MHz仪器采集NMR光谱。使用以Topspin v 1.3(补片水平8)运行的ICONNMR v4.0.4(构件1)、使用标准Bruker 负荷实验获取自动化实验。就非常规光谱法而言，通过使用单独的 Topspin获取数据。
熔点
使用设定在相当于约5℃/min加热速率的环境的Fisher-Johns 台式加热熔点仪。
示差扫描量热法(DSC)
使用安装50位自动采样器的TA Instruments Q1000或Mettler DSC 823e采集Dsc数据。使用经过检验的铟校准仪器的能量和温度校 准。典型地，将在针孔铝盘中的0.5-1.5mg样品各自以10℃/min从 25℃加热至300℃。将氮气净化以30mL/min维持在样品上。使用stare v 9.10软件包进行仪器控制和数据分析。
X-射线粉末衍射(XRPD)
方法1
使用Siemens D5000衍射计、应用Cu Kα射线(40kV，40mA)、θ-θ 测角计、V20发散和接收狭缝、石墨二次单色器和闪烁计数器采集X- 射线粉末衍射图案。使用经校验的金刚砂标准品(NIST 1976)检验仪器 性能。用于数据采集的软件是Diffrac Plus XRD Commander v2.3.1 且使用Diffrac Plus EVA v 11，0.0.2或v 13.0.0.2分析和提供数 据。
样品在环境条件下作为平板样品使用接收的粉末运行。将约30mg 样品缓慢充入切成抛光的、零背景(510)硅晶片的腔中。在分析过程中 使样品以其自身平面旋转。数据采集的详细内容为：
角方位：2-42°2θ
步长：0.05°2θ或0.1°2θ
采集时间：4 s.步长-1
方法2
使用Bruker AXS C2 GADDS衍射计、应用Cu Kα射线(40kV，40mA)、 自动化XYZ stage、用于自动样品定位的激光视频显微镜和HiStar 2- 维平面检测器采集X-射线粉末衍射图案。X-线光学器具由偶合了0.3 mm的针孔型准直器的单一多层反光镜组成。
束流发散度即样品上的X-射线束的有效大小约为4mm。使用θ-θ 连续扫描模式与样品-检测器距离为20cm的样品，得到3.2° 29.7°的有效2θ范围。典型地，可以使样品接触X-射线束120秒。 用于数据采集的软件是WNT 4.1.16的GADDS且使用Diffrac Plus EVA v 9.0.0.2或v 13.0.0.2分析和提供数据。
使用无需研磨接收的粉末将在环境下运行的样品制备成平板样 本。将约1-2mg样品轻压在载玻片上以得到平坦面。将在非环境条件 下运行的样品固定在带有热导性化合物的硅晶片上。然后以约 10℃.min-1将样品加热至约适合温度，然后等温保持约1分钟，然后 开始数据采集。
单晶X-射线衍射(SCXD)
使用安装Oxford Cryosystems Cryostream冷却装置的Bruker AXS 1K SMART CCD衍射计采集数据。使用SHELXS或SHELXD程序解析 结构，用SHELXL程序精制为Bruker AXS SHELXTL组件的部分。除非 另作陈述，否则与碳连接的氢原子以几何方式定位，允许用搭乘等向 性替代参数精制。与杂原子连接的氢原子在差别傅里叶合成中定位， 允许用等向性替代参数自由精制。
实施例1.(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2] 辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺的合成
在室温向(2S，3R)-3-氨基-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环 [2.2.2]辛烷(20mg，0.092mmol，如PCT WO 09/018505中所述制备， 将该文献有关这种合成的方面引入本文参考)、o-(苯并三唑-1- 基)-N，N，N，1-四亚甲基脲六氟磷酸盐(HBTU，41.7mg，0.110mmol) 和3，5-二氟苯甲酸(17.4mg，0.110mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(DMF， 2ml)中的混悬液中加入三乙胺(28mg，0.28mmol)。将该反应混合物 在室温搅拌过夜，用乙酸乙酯(200ml)稀释，用20％碳酸钾水溶液洗 涤。通过硅胶色谱法纯化残余物，使用的洗脱剂为甲醇∶三乙胺＝ 300∶1。除去溶剂，得到(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环 [2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺(30mg，76％)，通过HPLC纯化： 100％(214nm)，98.2％(254nm)；1H NMR(400MHz，CDCl3)d 8.48 (d，j＝2.0Hz，1H)，8.36(dd，j＝1.7Hz，j＝4.9Hz，1H)， 7.56-7.60(m，1H)，7.14-7.20(m，1H)，7.05-7.14(m，2H)， 6.87-6.96(m，1H)，6.23(d，j＝7.8Hz，1H)，3.88-3.96(m，1H)， 3.02-3.13(m，1H)，2.82-3.00(m，4H)，2.65-2.82(m，2H)， 1.97-2.05(m，1H)，1.58-1.84(m，3H)，1.43-1.55(m，1H)；ESI-MS 358.1(MH)+.
实施例2.(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2] 辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺富马酸盐的合成
在25℃向3，5-二氟苯甲酸(9.36g，59.2mmol)、氯仿(200mL) 和三乙胺(16.34g，161.5mmol)的溶液中加入HBTU(22.5g，59.2 mmol)。将该混合物加热至40-42℃ 45min，导致形成白色混悬液。 将该混悬液冷却至10℃，在15-20min期限内加入(2S，3R)-3-氨基 -2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷(11.7g，53.8mmoles) 的氯仿(50mL)溶液，搅拌1.5h。将该反应混合物加热至40-42℃， 再加入3，5-二氟苯甲酸(2.0g，13mmol)和HBTU(4g，11mmol)， 然后在40-42℃搅拌2h，然后在室温搅拌16h。用水(200mL)使该 反应混合物快速猝灭，在搅拌下用10wt％氢氧化钠水溶液将水层的 pH调节至pH＝10-11。分离各层，用水(100mL)将有机层洗涤两次。 真空除去溶剂，得到22.9g粘性橙色固体。通过定量HPLC对相比标 准品测定粗油状物中的产物浓度66.0wt％；它相当于15.1g(78％) 的收率。将该油状物溶于甲基乙基酮(50mL)，然后真空蒸馏出来；将 该过程重复总计3次。给安装顶端搅拌器、温度探头、滴液漏斗和冷 凝器的500mL三颈圆底烧瓶中加入富马酸(4.9g，42mmol)和甲基乙 基酮(150mL)。将该混悬液加热至78℃，导致酸完全溶解。缓慢加入 (2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5- 二氟苯甲酰胺在甲基乙基酮(50mL)中的溶液，保持内部温度高于 75℃。添加完成后，将该混悬液在78℃搅拌30-45min，关闭热源。 将该混悬液搅拌过夜，过滤，在50℃真空干燥滤饼16h，得到 (2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5- 二氟苯甲酰胺富马酸盐，为淡黄色结晶固体(通过HPLC测定99.6％纯 度)，mp 208-210℃。2步收率：65％。1H NMR(D2O，400MHz)：δ8.30 (d，J＝5.6Hz，1H)；8.06(d，J＝7.5Hz，1H)；7.48(dd，J＝ 8.7Hz，J＝5.6Hz，1H)；6.97-7.06(m，1H)；6.75-6.85(m，2 H)；6.49(s，2H)；4.15(d，J＝7.5Hz，1H)；3.69-3.81(m，1H)； 3.40-3.59(m，2H)；3.17-3.40(m，4H)；2.03-2.18(m，2H)； 1.91-2.03(m，2H)，1.78-1.91(m，1H).
实施例3.(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2] 辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺一盐酸盐的合成
方法A：向250mg(0.7mmol)of(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基) 甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺在10mL乙酸 异丙酯中的溶液中加入盐酸水溶液(65μL的37％(w/w)，0.78 mmol)。将该溶液加热至50℃，在4h期限内冷却至0℃。一盐酸盐样 品在0℃是树胶状物和白色粉末的混合物。然后将该样品加热至20℃， 再冷却至0℃(冷却变速5℃/min)。收集得到的固体，在25℃真空 干燥24h。mp(DSC)＝274.8℃.
方法B：在冰浴冷却下向四氢呋喃(THF，～4mL)中滴加浓盐酸 (0.54mL的37％(w/w)，6.6mmol)，用THF稀释至5mL体积。将该 溶液滴加(5min期限内)道温热(45-50℃)的(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基) 甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺(2.43g的 96.8％纯度，6.58mmol)在丙酮(20mL)中的溶液中。固体开始沉淀。 将该混合物在近沸腾状态下加热15min，冷却至环境温度，使其静置 16h。通过在氮气气氛中抽滤收集固体，用丙酮洗涤，真空烘箱内干 燥(85℃，3h)。得到2.26g物质，通过LCMS测定纯度为93％。用热 (近沸腾)2-丙醇(25mL)将完整样品消化10min。将该混合物冷却 至环境温度，使其静置3h。通过在氮气气氛中抽滤收集固体，真空 烘箱内干燥(85℃，2.5h)。通过HPLC测定得到的白色结晶为＞99％纯 度，称重为2.03g(78.4％收率)，在273-276℃熔化。1H NMR(400MHz， DMSO-d6)δ10.45(宽峰s，1H)，8.66(d，1H)，8.54(s，1H)，8.28 (d，1H)，7.76(d，1H)，7.41(m，1H)，7.24(m，3H)，4.14(m，1H)， 4.07(m，1H)，3.46(m，2H)，3.10-3.35(m，4H)，2.06(m，3H)， 1.90(m，1H)，1.69(m，1H)。元素分析：C20H21ON3F2·HCl计算值(C， 60.99％；H，5.63％，N，10.67％)；测定值(C，60.94％，60.91％；H， 5.64％，5.66％；N，10.63％，10.67％)。
实施例4.(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2] 辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺一-磷酸盐的合成
向250mg(0.7mmol)的(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂 双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺在5mL异丙醇中的溶液中加 入780μL(0.78mmol，1.1eq)的1M磷酸的THF溶液。将该溶液加 热至50℃，在4小时期限内冷却至0℃。在0℃形成白色不流动的淤 浆，将样品温热至室温后保留。蒸发溶剂，得到结晶物质，收集，在 25℃真空干燥24h。mp(DSC)＝219.2℃.
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.48(s，1H)，8.34(d，1H)，8.28 (d，1H)，7.68(d，1H)，7.43(m，1H)，7.24(m，3H)，5.04(br s)， 3.84(m，1H)，2.70-3.35(m，7H)，1.60-1.90(m，4H)，1.40(m， 1H).
实施例5.(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2] 辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺一-4-羟基苯甲酸盐的合成
向250mg(0.70mmol)的(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮 杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺在5mL乙酸异丙酯中的溶 液中加入780μL(0.78mmol，1.1eq)的1M 4-羟基苯甲酸的THF溶 液。将该溶液加热至50℃，在4小时期限内冷却至0℃。得到一-4- 羟基苯甲酸盐，为树胶状物。接种半-4-羟基苯甲酸盐和48小时的50℃ -室温熟化(4小时周期)树胶状物和溶剂的蒸发混合物(近剩余原始 体积的四分之一)后得到结晶。然后通过在氮气气氛中蒸发溶剂分离固 体。收集得到的固体，在25℃真空干燥24h。mp(DSC)＝144.0℃.
实施例6.(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2] 辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺半-4-羟基苯甲酸盐的合成
向71.5mg(0.20mmol)的(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1- 氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺在3.5mL乙酸异丙酯中 的溶液中加入100μL(0.1mmol，0.5eq)的1M 4-羟基苯甲酸的THF 溶液。蒸发乙酸异丙酯，得到(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂 双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺一-4-羟基苯甲酸盐，为固 体，收集，在25℃真空干燥24h。mp(DSC)＝106.0℃.1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ10.23(br s)，8.43(s，1H)，8.29(s，1H)，8.28 (s，1H)，7.78(d，1H)，7.61(m，1H)，7.41(m，3H)，7.22(m，1H)， 6.80(d，1H)，3.66(m，1H)，2.70-3.20(m，7H)，1.50-1.90(m， 4H)，1.20(m，1H).
实施例7.(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2] 辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺一水合物的合成
向(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3- 基)-3，5-二氟苯甲酰胺(993mg，2.80mmol)的水(5mL)溶液中加入两 氯仿(15mL)。用10重量％的氢氧化钠将水层的pH调节至pH＝10-11。 剧烈振摇该双相混合物，使各层分离。分离氯仿层，用氯仿(9mL)将 水层再萃取一次。用水(7mL)将合并的氯仿层洗涤一次，用无水硫酸 镁床过滤，真空浓缩，得到具有发泡倾向的无色澄清油状物。用甲基 叔丁基醚(MTBE，10-15mL)处理该物质，然后真空蒸馏溶剂；将该过 程再重复一次。将该物质溶于MTBE(10-15mL)，加入庚烷，直到出 现白色混浊为止。此时，开始在50-55℃在环境压力下缓慢蒸馏挥发 性物质，固体物质再次析出。停止蒸馏，通过过滤收集物质，用少量 庚烷洗涤。在55℃真空/氮气流干燥该物质60h，在70-85℃干燥40h， 得到400mg的(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2] 辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺一-水合物，为白色脆性固体：αD26.6℃＝ 40°；元素分析，计算值：C(63.99)；H(6.18)；N(11.19)，H2O(4.8 重量％)，测定值：C(64.23)；H(6.27)；N(11.18)；H2O(4.48).1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ8.46(d，J＝2Hz，1H)；8.35(dd，J＝ 4.8Hz，J＝2Hz，1H)；7.56-7.61(m，1H)；7.08-7.19(m，3H)； 6.87-6.95(m，1H)，6.32(d，J＝8.1Hz，1H)；3.89-3.95(m，1H)； 3.00-3.12(m，1H)，2.84-2.99(m，4H)；2.68-2.84(m，2H)； 1.98-2.04(m，1H)；1.83(s，2H)；1.58-1.79(m，3H)；1.44-1.54 (m，1H).在240℃分解。
实施例8.(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2] 辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺半-半乳糖二酸盐的合成
在70-72℃向搅拌的(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双 环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺(357mg，1.00mmol)在无水 乙醇(10mL)中的溶液中加入小部分半乳糖二酸(净)(105mg，0.50 mmol)。酸添加完成后再持续加热15min。将该溶液缓慢冷却至环境 温度。静置2h后，通过真空过滤收集固体，用乙醇洗涤，在氮气锥 形筒中干燥30min。将得到的物质在75℃、在真空烘箱内干燥3h 以除去残留的乙醇。XRPD的分析结果如图11中所示。
实施例9.(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2] 辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺的盐筛选
如下制备(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛 -3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺游离碱的储备溶液：
·20mg/ml的IPA溶液，25mg/ml的i-ProAc-抗衡离子1-12 的溶液
·25mg/ml的i-ProAc-抗衡离子13-20的溶液
在环境条件下给每支小瓶中加入2ml游离碱储备溶液(40-50mg 游离碱/小瓶)。然后在环境条件下以1.1或2.2当量向每支小瓶中加 入适合体积的储备酸溶液(1M的THF溶液，除非另有说明)。由此加入 作为固体的不溶性酸。将全部样品温热至50℃，然后在10小时内冷 却至0℃。将全部无定形固体包括树胶状物和油状物置于熟化条件中 (环境-50℃，4小时周期内，2天内)，然后进行XRPD再分析。向那些 熟化后保持无定形的样品中加入2ml的甲基乙基酮，将样品再熟化3 天。在50℃依次蒸发澄清溶液至约一半，然后至四分之一体积。再将 剩余的溶液冷却至5℃，然后真空完全除去溶剂。通过XRPD分析全 部得到的固体，再通过1HNMR/离子色谱法分析具有独特XRPD图案的 任意结晶样品，在40℃/75％RH 1周的固态稳定性和水溶性(在25℃目 标10mg/ml，未缓冲)。
为盐筛选研究所选择的酸抗衡离子
实施例10.盐酸盐的晶体结构
通过(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3- 基)-3，5-二氟苯甲酰胺一盐酸盐的甲醇溶液的室温-50℃的熟化得到 盐酸盐结晶。单晶结构数据如下表中所示。检查样品为散装物质的代 表。
一盐酸盐的单晶结构
通过直接方法得到结构解析，使用对F2进行全-矩阵最小二乘法 精制与加权
绝对结构参数值能够确定手性中心的构型。该构型如图10中所 示。
实施例11.生物学试验
在CNS nAChRs α4β2 NNR亚型上的放射性配体结合
由大鼠皮质制备膜：将体重为150-250g的大鼠(雌性， Sprague-Dawley)维持12h光照/黑暗循环，使其自由饮水和食用PMI Nutrition International，Inc.提供的食物。用70％ CO2麻醉动物， 然后断头处死。取出脑，置于冰冷平台上。取出大脑皮质，放入20 个体积(重量：体积)的冰冷制备缓冲液(137mM NaCl，10.7mM KCl， 5.8mM KH2PO4，8mM Na2HPO4，20mM HEPES(游离酸)，5mM碘乙酰 胺，1.6mM EDTA，pH 7.4)；加入溶于甲醇的终浓度为100μM的PMSF， 通过Polytron匀化该混悬液。将匀化物在4℃以18,000x g离心20 min，将得到的沉淀重新混悬于20个体积的冰冷水。在冰上60min 温育后，通过在4℃以18,000x g离心20min收集新沉淀。将最终 沉淀重新混悬于10个体积的缓冲液，贮存在-20℃。
由SH-EP1/人α4β2克隆细胞制备膜：收集来自40 150mm培 养皿的细胞沉淀，通过Polytron(Kinematica GmbH，Switzerland) 在20毫升冰冷制备缓冲液中匀化。将匀化物在4℃以48,000x g离 心20min。将得到的沉淀重新混悬于20mL的冰冷制备缓冲液，贮存 在-20℃。
在测定当天，融化冷冻的膜，以48,000x g旋转20min。滗析 上清液，弃去。将沉淀重新混悬于pH 7.4的Dulbecco磷酸缓冲盐水 (PBS，Life Technologies)，用Polytron匀化6秒。使用Pierce BCA Protein Assay Kit测定蛋白质浓度，将牛血清白蛋白用作标准品 (Pierce Chemical Company，Rockford，IL)。
将膜制备物(就人而言约为50μg，就大鼠α4β2而言约为 200-300μg)在PBS(分别50μL和100μL)中在竞争剂化合物 (0.01nM-100μM)和5nM[3H]烟碱的存在下在冰上温育2-3h。通 过用使用预浸入0.33％聚乙烯亚胺(w/v)的GF/B滤膜的多歧管组织采 集器(Brandel，Gaithersburg，MD)快速过滤终止温育，以减少非特 异性结合。用pH 7.4的PBS将组织冲洗3次。向包含洗涤组织的滤膜 上加入闪烁液，使其平衡。然后对滤膜计数以通过液体闪烁计数 (2200CA Tri-Carb LSC，Packard Instruments，50％效率或Wallac Trilux 1450 MicroBeta，40％效率，Perkin Elmer)测定与膜结合的 放射性。
将数据表示为每分衰变数(DPMs)。在每次测定中，各点具有2-3 次重复试验。对各点的重复试验取平均值，对药物浓度的log作图。 通过最小二乘法非线性回归测定产生50％结合抑制的浓度的IC50。使用 Cheng-Prussof方程(1973)计算Ki值：
Ki＝IC50/(1+N/Kd)
其中N是[3H]烟碱浓度，Kd是烟碱的亲和力(3nM，在单独实验 中测定)。
α7 NNR亚型
将体重为150-250g的大鼠(雌性，Sprague-Dawley)维持12h 光照/黑暗循环，使其自由饮水和食用PMI Nutrition International， Inc.提供的食物。用70％ CO2麻醉动物，然后断头处死。取出脑，置 于冰冷平台上。取出海马，放入10个体积(重量∶体积)的冰冷制备缓 冲液(137mM NaCl，10.7mM KCl，5.8mM KH2PO4，8mM Na2HPO4，20 mM HEPES(游离酸)，5mM碘乙酰胺，1.6mM EDTA，pH 7.4)；加入 溶于甲醇的终浓度为100μM的PMSF，通过Polytron匀化该混悬液。 将匀化物在4℃以18,000x g离心20min，将得到的沉淀重新混悬于 10个体积的冰冷水。在冰上60min温育后，通过在4℃以18,000x g 离心20min收集新沉淀。将最终沉淀重新混悬于10个体积的缓冲液， 贮存在-20℃。在测定当天，融化组织，以18,000x g离心20min， 然后重新混悬于冰冷PBS(Dulbecco磷酸缓冲盐水，138mM NaCl， 2.67mM KCl，1.47mM KH2PO4，8.1mM Na2HPO4，0.9mM CaCl2，0.5mM MgCl2，Invitrogen/Gibco，pH 7.4)至终浓度约为2mg蛋白质/mL。 通过Lowry等人在J.Biol.Chem.193：265(1951)中的方法、使用 牛血清白蛋白作为标准品测定蛋白质。
使用Davies等人在Neuropharmacol.38：679(1999)中的方法 测定[3H]MLA结合。[3H]MLA(比活性＝25-35 Ci/mmol)获自Tocris。 使用在21℃的2h温育测定[3H]MLA结合。在48-孔微量培养板上进行 温育，包含约200μg蛋白质/孔的最终温育体积300μL。温育缓冲 液是PBS，[3H]MLA终浓度为5nM。在环境温度通过使用Brandel Tissue Harvester过滤玻璃纤维滤膜(GF/B，Brandel)上包含结合配体的蛋白 质终止结合反应。将滤膜浸入包含0.33％聚乙烯亚胺的去离子水以减 少非特异性结合。在环境温度用PBS(3x 1mL)洗涤各滤膜。通过在 选择的孔中包含50μM非放射性MLA测定非特异性结合。
通过在选择的孔中包含7种不同浓度的测试化合物测定测试化合 物对[3H]MLA结合的抑制。每一浓度一式三份重复试验。将IC50值估计 为抑制50％特异性[3H]MLA结合的化合物浓度。以nM报道的抑制常数 (Ki值)根据IC50值、使用Cheng等人，Biochem.Pharmacol.22： 3099-3108(1973)的方法计算。
显著性与外周nAChRs的关系
对人肌肉nAChR亚型的相互作用
使用衍生自胚胎型横纹肌肉瘤的人克隆品系TE671/RD建立肌肉 型nAChRs的活化(Stratton等人，Carcinogen 10：899(1989))。这 些细胞表达具有与肌肉型nAChR类似的药理学(Lukas，J.Pharmacol. Exp.Ther.251：175(1989))、电生理学(Oswald等人，Neurosci. Lett.96：207(1989))和分子生物学特性(Luther等人，J.Neurosci. 9：1082(1989))的受体。
根据常规方案将TE671/RD细胞维持在增殖生长期(Bencherif等 人，Mol.Cell.Neurosci.2：52(1991)和Bencherif等人，J. Pharmacol.Exp.Ther.257：946(1991))。在含有10％马血清 (Gibco/BRL)、5％胎牛血清(HyClone，Logan UT)、1mM丙酮酸钠、4mM L-谷氨酰胺和50,000单位青霉素-链霉素(Irvine Scientific)的 Dulbecco改进Eagle培养基(Gibco/BRL)中培养细胞。当细胞达到80％ 融合率时，将它们铺板至12孔聚苯乙烯培养板(Costar)。当细胞达到 100％融合率时，进行实验。
使用86Rb+流量、根据Lukas等人，Anal.Biochem.175：212(1988) 所述的方法测定烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)功能。在实验当天，从孔中 缓慢取出生长培养基，向各孔中加入包含氯化86铷(106μCi/mL)的生 长培养基。将细胞在37℃温育最少3h。加载期后，除去过量86Rb+， 用不含标记的Dulbecco磷酸缓冲盐水(138mM NaCl，2.67mM KCl， 1.47mM KH2PO4，8.1mM Na2HPO4，0.9mM CaCl2，0.5mM MgCl2， Invitrogen/Gibco，pH.7.4)将细胞洗涤两次，谨慎不要破坏细胞。 然后使细胞接触100μM测试化合物、100μM L-烟碱(Acros Organics) 或单独的缓冲液4min。在接触期后，取出包含释放的86Rb+的上清液， 转入闪烁瓶。加入闪烁液，通过液体闪烁计数测定释放的放射性。
在每次测定中，每个点做2次重复试验，取平均值。将86Rb+释放 量与阳性对照(100μM L-烟碱)和阴性对照(单独的缓冲液)对比，以 确定相对于L-烟碱的释放百分比。
如果适合，则确定测试化合物的剂量响应曲线。将各化合物的最 大活化(Emax)测定为L-烟碱诱导的最大活化百分比。还测定了产生特 异性离子流量最大活化一半的化合物浓度(EC50)。
对人神经节nAChR亚型的相互作用
在嗜铬细胞瘤克隆品系PC12上建立大鼠神经节nAChRs的活化， 所述嗜铬细胞瘤克隆品系PC12是来源于大鼠肾上腺髓质肿瘤的神经 嵴来源的连续克隆细胞系。这些细胞表达神经节-样nAChR s(参见 Whiting等人，Nature 327：515(1987)；Lukas，J.Pharmacol.Exp. Ther.251：175(1989)；Whiting等人，Mol.Brain Res.10：61 (1990))。
根据常规方案将大鼠PC12细胞维持在增殖生长期(Bencherif等 人，Mol.Cell.Neurosci.2：52(1991)和Bencherif等人，J. Pharmacol.Exp.Ther.257：946(1991))。在含有10％马血清 (Gibco/BRL)、5％胎牛血清(HyClone，Logan UT)、1mM丙酮酸钠、4mM L-谷氨酰胺和50,000单位青霉素-氯霉素(Irvine Scientific)的 Dulbecco改进Eagle培养基(Gibco/BRL)中培养细胞。当细胞达到80％ 融合率时，将它们铺板至12孔Nunc板(Nunclon)，用0.03％聚-L-赖 氨酸(Sigma，溶于100mM硼酸)包被。当细胞达到80％融合率时，进行 实验。
使用86Rb+流量、根据Lukas等人，Anal.Biochem.175：212(1988) 所述的方法测定烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)功能。在实验当天，从孔中 缓慢取出生长培养基，向各孔中加入包含氯化86铷(106μCi/mL)的生 长培养基。将细胞在37℃温育最少3h。加载期后，除去过量86Rb+， 用不含标记的Dulbecco磷酸缓冲盐水(138mM NaCl，2.67mM KCl， 1.47mM KH2PO4，8.1mM Na2HPO4，0.9mM CaCl2，0.5mM MgCl2， Invitrogen/Gibco，pH.7.4)将细胞洗涤两次，谨慎不要破坏细胞。 然后使细胞接触100μM测试化合物、100μM L-烟碱(Acros Organics) 或单独的缓冲液4min。在接触期后，取出包含释放的86Rb+的上清液， 转入闪烁瓶。加入闪烁液，通过液体闪烁计数测定释放的放射性。
在每次测定中，每个点做2次重复试验，取平均值。将86Rb+释放 量与阳性对照(100μM L-烟碱)和阴性对照(单独的缓冲液)对比，以 确定相对于L-烟碱的释放百分比。
如果适合，则确定测试化合物的剂量响应曲线。将各化合物的最 大活化(Emax)测定为L-烟碱诱导的最大活化百分比。还测定了产生特 异性离子流量最大活化一半的化合物浓度(EC50)。
新目标识别
通过使用三试验新目标识别试验评价记忆。在第一天(探查试验)， 使大鼠探查开放的试验台(44.5x 44.5x 30.5em)6min。在第二 天(获取试验)，使大鼠在两个相同目标(均为目标A)的存在下探查同 一试验台3分钟。在第三天(保留或回忆试验)，通过在两个不同目标 的存在下使同一动物再探查试验台3分钟评价行为：熟悉的目标A和 新目标B。在三次NOR试验之间附加24小时试验间隔。通过在回忆试 验过程中比较花费在探查新(目标B)与熟悉目标(目标A)上的时间评 价识别记忆。对每一动物评价识别指数并且表示为比例((时间B/时 间A+时间B)x 100)。
生物学数据概述
体外药理学
表1中提供了(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环 [2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺或其药学可接受的盐的体外主要 药理学数据概述并且在下文中详细讨论。
初步药理学和选择性：(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂 双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺以100nM的Ki抑制[3H]甲基 牛扁碱(MLA)与大鼠海马膜中大鼠天然α7受体结合。
(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3- 基)-3，5-二氟苯甲酰胺以1470nM的Ki抑制[3H]-烟碱与人重组α4β2 烟碱受体结合并且以4120nM的Ki抑制[3H]地棘蛙素与大鼠天然α4β2 受体结合。(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛 -3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺还显示对人天然神经节-类烟碱受体(可能 是α3β4)的亲和力下降，从而以48μM的Ki抑制[3H]地棘蛙素与 SH-SY5Y膜中的受体结合，并且降低对人天然肌肉-型烟碱受体(可能 是α1β1γδ)的亲和力受体，从而以136μM的Ki抑制[3H]地棘蛙素与 膜TE-671中的受体结合。(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双 环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺以19μM的Ki抑制[3H]地棘蛙 素与SH-EPl膜中的人重组α4β4烟碱受体结合。
表1.(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛 -3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺体外药理学概述
体内药理学
表2中提供了(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环 [2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺或其药学可接受的盐的体内药理 学数据概述并且在下文中详细讨论。
表2
(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3- 基)-3，5-二氟苯甲酰胺或其药学可接受的盐的NOR结果概述
(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3- 基)-3，5-二氟苯甲酰胺改善了长期视觉片段/陈述记忆，正如通过在正 常大鼠口服给药后新目标识别(NOR)任务所评价的。这些研究结果如图 1中所示。获取试验后24h媒介物治疗组的识别指数是54±1％，显示 该组不能识别这一延迟后的熟悉目标。相反，用(2S，3R)-N-2-((3-吡 啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺治疗的 动物在0.84μmol/kg剂量水平下显示70±4％的识别指数并且在0.28 μmo l/kg剂量水平下显示74±3％的识别指数。
在随访NOR研究中(图2)，将(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1- 氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺的最小有效剂量(MED) 水平测定为0.084μmol/kg，从而启示大鼠能够在全部测试剂量水平 下识别熟悉的目标。在“仅回忆”期中；在第1天(即探查期)和第2 天(即获取期)对一小组动物口服给予水，然后在第3天(即回忆期)口 服给予0.28μmol/kg(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环 [2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺。甚至在单一口服给药后， (2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5- 二氟苯甲酰胺仍然在该剂量水平下显示提高认知效果。 (2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5- 二氟苯甲酰胺显示明显高于对照组的识别指数，从而证实了急性给药 后的熟悉目标识别。在65％的虚线表示我们的生物识别促进活性的标 准。*P＜0.05。
评价(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3- 基)-3，5-二氟苯甲酰胺在正常大鼠NOR任务中的效果期限。这些研究 结果如图3中所示。在回忆试验时给药后0.5h和24h媒介物治疗组 的识别指数分别为51±1％和53±4％，从而显示该组在这种延迟后不能 识别熟悉的目标。相反，用(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双 环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺(0.28μmol/kg：口服)治疗的 动物在0.5h、2h和6h显示的识别指数分别为68±4％、71±2％和62 ±2％，从而启示大鼠能够在给药后高至6h识别熟悉的目标。
此外，用(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛 -3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺(0.84μmol/kg：口服)治疗的动物在0.5h、 2h、6h和18h显示的识别指数分别为59±2％、63±2％、68±3％和 68±3％，从而启示大鼠能够在该剂量水平下给药后高至18h识别熟悉 的目标(图4)。在65％的虚线表示我们的生物识别促进活性的标准(*P＜ 0.05)。
电生理学
化合物A即(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2] 辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺和化合物B即(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基) 甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-4-氟苯甲酰胺均为对α7 NNR的 部分激动剂。然而，两种化合物之间在其诱导所谓的峰值电流方面存 在显著性差异。将峰值电流定义为除去激动剂后与内源性Ach共同施 用过程中的尾电流。如本文所示，化合物A在例如精神病这样的病症 中提供了改善的特性和调节α7功能的更大潜能，在所述的病症中这 种神经传递受到损害。
分析化合物A和B对α7烟碱ACh受体的剂量响应。化合物B和 化合物A是α7烟碱受体的部分激动剂(EC50＝664nM，1.6μM；和 EMAX＝46.6％，54.4％)，正如图5中所示，EC50和EMAX在这些配体之间 相差无几。
然而，共同施用化合物与Ach揭示出这两种配体之间的巨大差异， 正如图6所示例的。化合物B抑制ACh产生的电流，推断是因竞争性 抑制所致，而化合物A促进ACh-诱导的电流。对这种促进的一种推定 是化合物A原位空间立体调节的能力。
另外，当共同施用Ach与纳摩尔的化合物B或化合物A时，发现 了巨大差异，正如图7和8中所示的。
图7A表示负载Dynaflow芯片以测定配体(化合物A，200nM)与 乙酰胆碱(100μM)在烟碱α7受体活化中的相互作用的实验设计。预 置通道如下：对照组溶液(通道#2)、施用配体自身(通道#3)、施用乙 酰胆碱自身(通道#1)和施用乙酰胆碱和配体混合物(通道#4)。
图7B显示使用不同使用次序得到的4个有代表性的电流曲线：
曲线1，图7B：高于曲线的棒形表示ACh施加时间。曲线表示施 加1秒70μM Ach诱导的电流。曲线示例细胞从通道#2移动至通道#1 1秒施加Ach和返回至通道2(消除)的结果。施加Ach在消除后产生 快速恢复的增强电流活化。
曲线4，图7B：曲线4表示施加配体和ACh/配体混合物(恢复)后 测定结束时的曲线1的重复。
曲线2，图7B：下/上箭头表示施加时间。曲线2表示5秒施加 200nM的化合物A。曲线示例细胞从通道#2移动至通道#35秒的结果。 单独200nM浓度的化合物A不产生增强的大电流。
曲线3，图7B：曲线3表示施加Ach和化合物A的相互作用。曲 线3示例细胞从通道#2移动至#3(2秒)、至#4(1秒)和返回至#3(2 秒)和返回至#2(消除)的结果。因施用ACh后施用化合物A导致生成 显著的“峰值”电流。该电流不是如下情况的结果：Ach，正如在比较 曲线1和4时观察到的；或化合物A，正如在曲线2中观察到的，单 独的α7受体活化。而曲线3示例施用Ach和化合物A的相互作用的 实例。
图7C表示使用不同浓度化合物A(100-500nM范围)得到的峰 值电流的绝对值的平均值(n＝4)。我们观察到在约500nM具有EMAX的 电流浓度依赖性增加(EC50＝120nM)。
类似地，图8A、8B和8C表示对化合物B得到的结果。在比较图 7A-C与图8A-C时，与共同施用化合物B相比，当共同施用Ach与化 合物A时有巨大差异。化合物A促进ACh-诱导的电流。
福尔马林试验
急性痛的大部分临床预测筛选模型之一是小鼠中的福尔马林试验 (LeBars等人，2001)。在这种最初由Dubuisson和Dennis(1977)描 述的模型范例中，将福尔马林稀溶液注入受试者(大鼠或小鼠)后爪的 跖面并且测定感受伤害行为；例如，舔和咬注射的爪。观察反应的两 个阶段。首先是早期，即从注射后即刻开始且持续5-10分钟，然后是 晚期，它可以在注射后持续15-60分钟。感受伤害性响应归因于早期 中的直接化学刺激和晚期中的炎症/持续性疼痛(Dubuisson和Dennis， 1977)。晚期中的响应还依赖于因早期过程中传入阻滞导致的脊髓中的 信息加工改变(Coderre等人，1990)。本试验的优点在于在同一测定 中使用两种不同类型的刺激物以研究药物在试验的两个期限中不同止 痛效果的可能性(和Hole，1997)。
将受试者(成年雄性CD-1小鼠(Charles River，Raleigh，NC)， 体重约为20-25克)从其居住笼中取出并且称重，然后放入透明 Plexiglas 观察箱20-30分钟的适应期。然后从观察室中取出小鼠并 且皮下给予1mL/kg体积的(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂 双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺(作为盐酸盐的0.9％盐水溶 液)(1、3或10mg/kg s.c.(相对于游离碱计算))、吗啡(5mg/kg；s.c.) 或0.9％盐水媒介物。然后将小鼠放回室内预定的30分钟 (2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5- 二氟苯甲酰胺和吗啡预治疗时间期限。
在测试化合物预治疗时间后，给动物注射福尔马林溶液(2.5％作为 10％磷酸盐缓冲福尔马林溶液(Sigma)∶蒸馏水的1∶4稀释液衍生)。轻 握受试者的指定爪并且将福尔马林溶液经背侧中部皮内注入爪。一旦 注射，则将受试者即刻放回到其观察室内并且开启计时器以标记I期 开始。对每一受试者录像整个40-分钟期限。当对磁带评分时，在40- 分钟期限内间隔5-min观察每一受试者1min。记录1min间隔过程 中舔爪所花费的时间并且注意存在或不存在爪依从性。
为了进行数据分析，将试验的I期定义为福尔马林注射后0-5 分钟，而将II期定义为福尔马林注射后20-40分钟。记录那些时间 范围内1min间隔过程中舔爪所花费的时间并且图示为平均值± S.E.M。为了在治疗组中进行比较，对使用作为因变量的治疗对每一期 限进行1中方式变量分析(ANOVAs)。当适合于测定具体组差异时，进 行因果分析。
结果显示，尽管(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环 [2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺在减少I期舔爪所花费时间方面 不存在具有统计学显著性的剂量，但是10mg/kg(2S，3R)-N-2-((3- 吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺在减 少福尔马林试验II期舔爪所花费时间方面具有显著性(P＜0.05)。阳性 对照吗啡(5mg/kg；s.c.)在试验的两期内均有效。这些数据显示 (2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5- 二氟苯甲酰胺在化学诱导炎症/持续性疼痛方面具有止痛潜能。
然后分析原始录像带，其中在整个I期(福尔马林后0-5min)和 II期(20-40min)过程中对每一动物评分，揭示出数据的类似趋势， 但难以达到(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛 -3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺对I期或II期中舔所受侵害的爪花费的时 间减少的效果的统计学显著性。
参考文献涉及：Coderre TJ，Vaccarino AL，Melzack R(1990)， Central nervous system plasticity in the tonic pain response to subcutaneous formalin injection，Brain Res.535：155-158； Dubuisson D和Dennis SG(1977)，The formalin test：A quantitative study of the analgesic effects of morphine， meperidine，and brain stem stimulation in rats and cats，Pain 4：161-174；Malmberg AB和Bannon AW(2002)，Unit 8.9：Models of nociception：hot-plate，tail-flick，and formalin tests in rodents，Current Protocols in Neuroscience；和A和 Hole K(1997)，Animal models of analgesia，In：Handbook of Experimental Pharmacology Volume 130：The Pharmacology of Pain (Eds.A.Dickenson和J.-M.Besson)，Springer Verlag，New York pp.1-20。
完全弗氏佐剂(CFA)-诱导的热痛觉过敏
在大鼠中注射完全弗氏佐剂(CFA)通常用于评价具有用作治疗单 关节炎(骨关节炎)和其他炎症疾病的药物的潜能的化合物。痛觉过敏 体征在24h内发生(Schaible和Grubb，1993)。
使用与Walker和同仁(2003)所述类似的方法评价 (2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5- 二氟苯甲酰胺在大鼠中CFA诱导的热痛觉过敏试验中可能的止痛效 果。简言之，将接收时体重为180±20g的成年雄性Sprague-Dawley 大鼠(BioLasco，Taiwan)随机指定入n＝8/组的治疗组。在实验测试前 24h动物各自接受足底部注射(0.1mL)CFA(DIFCO，264010；0.1％ 溶液)至右后爪。在30℃使用爪/尾刺激镇痛计量器(IITC Model-336G， IITC，USA)与热调节的玻璃地板组测试热痛觉过敏。将受试者放入在 升高的玻璃地板上部的塑料箱内并且使位于玻璃地板下面的光束定向 于右后爪的跖面。自动记录因热刺激而导致动物爪退缩所需的时间。 将光强度调整以引起12-14秒的平均组基线潜伏期(前-CFA)并且强加 20秒的截止潜伏期。对每一大鼠得到爪退缩的潜伏期并且将其定义为 热痛阈。
CFA注射后24小时，预选择受试者(热痛觉过敏的显然存在)用于 实验，唯一条件是退缩的潜伏期低于基线的75％。通过在0时皮下注 射(s.c.)给予测试物质、吗啡和媒介物。然后在治疗后60分钟测定热 痛觉过敏的治疗后水平。对测试物质治疗组与媒介物对照组之间的比 较使用一种方式ANOVA，然后进行Dunnett检验。将P＜0.05水平的活 动视为具有显著性。
总之，与媒介物(0.9％盐水)对照组相比，皮下(s.c.)给予0.1、1 或10mg/kg的(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2] 辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺1小时剂量后与大鼠中CFA-诱导的热痛 觉过敏任何明显的止痛效果无关。相反，同时试验参比标准品吗啡(3 mg/kg s.c.)在给药后1小时时产生显著的止痛活性。参见图13。参 考文献涉及：Schaible H-G和Grubb BD(1993)，Afferent and spinal mechanisms of joint pain，Pain 55：5-54；和Walker KM， Urban L，Medhurst SJ，Patel S，Panesar M，Fox AJ和Mcintyre P (2003)，The VRl antagonist capsazepine reverses mechanical hyperalgesia in models of inflammatory and neuropathic pain， JPET 304：56-62。
链脲霉素(STZ)诱导的糖尿病神经病变(正如异常性疼痛所证实 的)
周围神经病即糖尿病的一种主要并发症通常导致自发性疼痛或因 接触正常无害性刺激物而感觉疼痛。这种神经病性疼痛由20-24％糖尿 病患者所经历，或全世界有约3千万人(Schmader，2002)。链脲霉素 (STZ)诱导的大鼠中糖尿病模型提供了评价测试化合物提供周围神经 病的治疗潜能的功效并理解其推定的作用机制的方式。在这种模型中， 单一注射STZ即通过对胰腺β和α-细胞导致不可逆损害模拟临床糖 尿病的抗生素，导致慢性高血糖、神经功能障碍和疼痛敏感性。最新 的研究使用糖尿病神经病变的STZ大鼠模型以研究(2S，3R)-N-2-((3- 吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺对机 械性异常性疼痛的效果，即评价疼痛。
通过将0.5ml溶于柠檬酸盐缓冲液(pH＝6)的链脲霉素(60mg/kg) 注入每一大鼠的尾静脉诱发糖尿病。通过在研究的第3天对全部动物 测定血糖水平(BGL)证实发生糖尿病(BGL＞300mg/dL)。在研究的第 14天再次测定BGL并且仅在研究的第21天再次测试显示触觉异常性 疼痛的动物的BGL。对在研究的第14天时未显示触觉异常性疼痛的动 物在研究的第16天时测定BGL。在研究的第23天时对这些动物再次 测试其BGL。
在研究的第14天或研究的第16天开始将(2S，3R)-N-2-((3-吡啶 基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺(0.1、1或 10mg/kg p.o.)作为盐酸盐的水溶液每日一次给予并且分别持续至研 究的第21天或第23天。仅在异常性疼痛试验天数时给予对照品加巴 喷丁(在0.9％盐水中，150mg/kg i.p.)。测试物品、媒介物或对照品 给药基于研究第14天时的异常性疼痛评价。如果在研究的第14天时 不存在异常性疼痛，则在研究的第16天时再次评价动物。在研究的第 15天和第21天或第16天和23天、在测试物品给药后30分钟测定疼 痛响应。
为了进行异常性疼痛评价，根据Chaplan和同仁的方法(1994)使 用Von Frey丝。简言之，将大鼠放入箱内并且使其位于金属网表面上， 但可以自由移动。给大鼠舱室覆盖红色玻璃纸以减少环境分布。探究 行为停止后开始试验。
啮齿动物在其爪被突然触及时显示爪撤回反射。当指定长度和直 径的Von Frey纤维顶端以垂直角度压至皮肤时，施加的力增加，条件 是研究人员持续推进探头至纤维弯曲。在纤维弯曲后，推进探头，导 致纤维更加弯曲，但没有另外施加力。动物可以因拉回其爪而显示感 觉。在没有对最初选择的丝的爪退缩响应的存在下，提供更强的刺激； 在爪退缩的情况中，选择下一个较弱的刺激。在这种方式中，得到的 阳性和阴性响应的模式用于测定爪退缩阈值。
Yon Frey单丝组提供了近似对数标度的实际力和线性标度的感觉 强度。下面是显示单丝力(g)及其相应大小的表。
将全部正态分布的数据表示为平均值±SEM和动物的各自值，然 后进行斯氏T-检验(软件：Excel)。p值＜0.05被视为表 示显著性差异。由于异常性疼痛数据的非正态分布，所以将那些数据 的描述提供为平均值(±SEM)和平均值以表示其不精确性和偏态分布。
将Von Frey数据表示为拉动每一后腿所需的最小力(g)。STZ注 射后14/16天记录痛阈下降。将这种下降表示为动物对Von Frey丝敏 感性的增加。STZ注射前媒介物治疗动物在基线的平均和组平均拉力 为57.57±2.43(组平均值＝60g)。在第14/16天研究时，平均爪退 缩力显著下降(20.5-22.14±2.36g；与基线相比＜0.01；平均值 ＝20.5g)，显示(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2] 辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺治疗前的触觉异常性疼痛。在研究结束时 (第21/23天研究)，治疗后仍然观察到触觉异常性疼痛(20.46± 3.31g；与基线相比＜0.01；平均值＝8g)。
总之，与预治疗(p＜0.01)或媒介物对照组(p＜0.05)相比，用1 mg/kg(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3- 基)-3，5-二氟苯甲酰胺治疗在第14/16天研究时其给药后30分钟抑制 异常性疼痛。与预治疗(p＝0.012)相比，用10mg/kg剂量的 (2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5- 二氟苯甲酰胺治疗在第14/16天研究时其给药后30分钟抑制异常性疼 痛。与预治疗(p＝0.012)相比，用1mg/kg剂量的(2S，3R)-N-2-((3- 吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺治疗 在第21/23天研究时其给药后30分钟抑制异常性疼痛。与媒介物对照 组(p＜0.05)相比，用10mg/kg(组11M)剂量的(2S，3R)-N-2-((3-吡 啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺治疗在 第21/23天研究时其给药后30分钟抑制异常性疼痛。与预治疗(第 14/16天研究和第21/23天研究；p＜0.01)或与媒介物对照组(第21/23 天研究；p＜0.01)相比，用阳性对照加巴喷丁治疗显著逆转了触觉异常 性疼痛。在研究结束时(第21/23天研究)，分析血清中的胰岛素水平。 未观察到胰岛素水平的显著性差异。在第14或16天研究开始到第21 或第23天研究时，每天分别给予全部剂量的(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基) 甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺。在试验品注 射(前-TI注射)和试验品给药后30分钟(后-TI注射)进行疼痛试验。 在第14或16天和第21或23天研究时的疼痛测试前2小时给予阳性 对照加巴喷丁。与预治疗和与媒介物相比，用阳性对照加巴喷丁治疗 在全部治疗天数内均显著逆转了触觉异常性疼痛：分别在第14/16天 研究时在治疗前和治疗后22.77±3.77g(平均值＝15g)与45.62± 4.24g(平均值＝60g)，p＜0.01；分别在第21/23天研究时在治疗前 和治疗后28.23±4.91g(平均值＝20.5g)与50.88±4.12g(平均值 ＝60g)，p＜0.01；在第14/16天研究时在治疗前和治疗后在媒介物对照 组中45.62±4.24g(平均值＝60g)与26.61±4.41g(平均值＝15g)， p＜0.01；在第21/23天研究时在媒介物组中50.88±4.12g(平均值 ＝60g)与20.46±3.31g(平均值＝10g)，p＜0.01。
在结束天时Von Frey测试后即刻采集血液。在研究结束时，用氯 胺酮/赛拉嗪溶液(IP)对动物实施安乐死。通过心脏穿刺将约0.5-0.7 ml血液采集入包含抗凝血药(K3 EDTA)的试管。将血样保持在冷却的 冰上并且在采集的30分钟内离心。为了得到血浆，以3000rpm将血 液离心10分钟。将血浆转入标记的试管并且直立贮存和冷冻在约 -20℃，直到装运为止。用化合物序号和动物序号标记每一样品。
在本研究过程中全部动物体重均增长。在组间不存在体重增加的 显著性差异。
在全部动物中平均血糖水平增加。基线为108.86±1.03mg/dl 且在研究第3天时增加至390.99±6.47mg/dl。在组间未发现统计学 差异。基于第14天研究时的异常性疼痛结果，在研究的第14/16天和 第21/23天时还测定了高葡萄糖水平。在本研究结束时(第21和23 天研究时)，平均血糖水平为403.86±8.45mg/dl。
在研究终止时，分析血清中的胰岛素水平。在研究终止时媒介物 对照组中的胰岛素水平为0.79±0.41μg/l。在治疗之间未观察到胰 岛素水平的显著性差异。
与媒介物治疗组相比，Yon Frey评价结果显示(2S，3R)-N-2-((3- 吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺以1 mg/kg和10mg/kg的剂量有效减轻异常性疼痛疼痛。参见图14。
参考文献涉及：Chaplan SR，Bach FW，Pogrel JW，Chung JM， Yaksh TL(1994)，Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw，J.Neurosci.Methods 53：55-63；Schumader KE (2002)，Epidemiology and impact on quality of life of postherpetic neuralgia and painful diabetic neuropathy， Clinical Journal of Pain 18：350-354；和Sommer C(2003). Painful neuropathies，Curr.Opin.Neurol.16：623-628。
2型糖尿病的鼠模型
db/db小鼠，即充分建立的2型糖尿病模型是表达肥胖表型且还 通常表达代谢症状的瘦素-缺乏突变体，所述的症状包括高血糖症、高 脂血症和超高胰岛素血症(Halaas等人，1995；和Lee等人，1996)。 这种糖尿病动物模型用于设计测定(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲 基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺对体重和几种另 外的代谢参数的效果的研究。
在本研究中，从约3周龄开始以1.0mg/kg每日一次反复口服给 予(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3- 基)-3，5-二氟苯甲酰胺(通过管饲法)并且持续7-周研究的自始至终。 非糖尿病杂合子同窝出生的小鼠(db/+；命名为“Db”)用作对照组。每 周测定两次体重和食物摄入量。还通过管饲法对选择的db/db组(命名 为“db”)或db/+小鼠每日同时给予3mg/kg的α7拮抗剂甲基牛扁亭 碱(MLA)。在7-周给药方案结束时，计算总生长(总体重增加)和平均 每日食物摄入量。此外，在禁食过夜小鼠中评价葡萄糖水平。此外， 采集来自禁食过夜的血样分析物以测定肿瘤坏死因子-a(TNF-α)、甘 油三酯和糖基化血红蛋白(HbAlc)。将全部数据表示为平均值±SEM。 对每一研究的参数而言，通过一种方式ANOVA与因果Neuman-Keuls 多重比较检验比较全部组中的差异。
总之，在7周过程中对肥胖db/db小鼠每日给予(2S，3R)-N-2-((3- 吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺导致 比用媒介物治疗的对照组肥胖db/db小鼠测定的全部参数显著下降。 就总体重增加、平均每日食物消耗量、糖基化HbAlc水平和TNF-α血 浆浓度而言，共同给予MLA减弱了效果。尽管血糖和甘油三酯下降未 因共同给予MLA与(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环 [2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺而显著减弱，但是存在向其逆转 的趋向。
正如图15中所示，在7周治疗结束时，3-10周龄的媒介物对照 组治疗的肥胖组(“db”)中的总体重增加显著大于瘦型媒介物对照组 动物(“Db”)。通过比较，在(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂 双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺-治疗的肥胖(“db-试验品”) 小鼠中体重增加显著下降。值得注意的是，共同给予MLA与 (2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5- 二氟苯甲酰胺的动物未显示单独给予(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲 基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺的肥胖小鼠显示 的体重增加下降。
正如图16中所示，媒介物对照肥胖组(“db”)中的每日食物摄入 量显著大于瘦型媒介物对照组(“Db”)。食物消耗量的平均值在 TC-(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3- 基)-3，5-二氟苯甲酰胺-治疗的肥胖小鼠(“db-试验品”)显著低于肥 胖对照组。瘦型小鼠的食物消耗量未受(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲 基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺(“Db-试验品”) 影响。共同给予MLA与(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环 [2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺的动物未能显示单独给予 (2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5- 二氟苯甲酰胺的肥胖大鼠显示的每日食物消耗量平均值下降。
正如图17中所示，(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环 [2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺显著抑制肥胖小鼠(“db-试验品”) 中的空腹血糖水平。然而，这种效果未因共同给予MLA而逆转。
正如图18中所示，(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环 [2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺显著抑制肥胖小鼠(“db-试验品”) 中的糖基化HbAlc水平。共同给予MLA减弱了(2S，3R)-N-2-((3-吡 啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺对糖基 HbAlc化的下降。
正如图19中所示，(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环 [2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺显著减少肥胖小鼠(“db-试验品”) 的促炎细胞因子TNFα。这些效果受到共同给予α7拮抗剂MLA的抑制。
正如图20中所示，(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环 [2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺导致肥胖小鼠(“db-试验品”) 的甘油三酯水平比媒介物治疗组(“db”)的甘油三酯水平显著降低。 (2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5- 二氟苯甲酰胺导致的甘油三酯降低不因共同给予MLA而减弱。
肺气道高反应性、Penh测定
使用Hamelmann等人的方法，评价(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲 基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺对小鼠气道高反 应性的可能的抑制。简言之，通过在第21、23和25天鼻部吸入气雾 化5％ OVA 25min攻击卵白蛋白(OVA)-致敏的动物(12只动物/组)。 用媒介物或(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛 -3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺皮下(s.c.)治疗小鼠，每日两次，从第21 天到第26天，或每日一次气管内(i.t.)给药治疗，预先在第21、23 和25天时用卵白蛋白气雾剂攻击达30min和在第26天用醋甲胆碱攻 击或支气管肺泡灌洗液(BALF)收集。在第21、23和25天OVA攻击前 60min和第26天醋甲胆碱刺激或BALF收集前60min，每日一次口服 (p.o.)给予3mg/kg参比标准品地塞米松。通过使用全身体积描记术 进行气道反应性的无创伤性测量，其中阻止增强增加(Penh)用作气道 阻塞的指标。测定对吸入的醋甲胆碱的响应并且计算为各自基线值的 百分比。未配对S氏t-检验用于比较媒介物对照组与假拟组；对媒介 物对照组与治疗组之间的对比使用一种方式ANOVA和Dunnett因果分 析。将P＜0.05视为具有统计学显著性。
图21示例(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2] 辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺对醋甲胆碱在卵白蛋白-致敏小鼠中的攻 击的Penh响应改变％的效果。与假拟对照组相比，在OVA-致敏的动物 中对醋甲胆碱(10和30mg/mL)的Penh响应显著增强。与媒介物治疗 的OVA动物相比，3mg/kg PO地塞米松导致醋甲胆碱(10和30mg/mL)- 诱导的Penh值在绝对值和％值方面都增加显著抑制，从而显示对气道 高反应性的功效。(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环 [2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺在0.1、1和10mg/kg bid s.c. 导致醋甲胆碱-诱导的Penh值增加显著抑制；10mg/kg IT也以显著 抑制相关。
(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3- 基)-3，5-二氟苯甲酰胺在卵白蛋白致敏的小鼠中对白血细胞计数/细 胞分类计数和％白血血细胞计数/细胞分类计数的效果分别示例在图Y 和Z中。在OVA-致敏动物与假拟对照组中的BALF中注意到总WBC、嗜 中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞和嗜酸细胞显著增加，其受到地塞 米松的显著抑制。(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环 [2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺在0.1和1mg/kg SC显著减少 了BALF中的总WBC和嗜酸细胞、但在10mg/kg SC不会减少； (2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5- 二氟苯甲酰胺在10mg/kg SC减少了单核细胞；在0.1和1mg/kg SC 和在10mg/kg IT减少了淋巴细胞。
这些结果证实多次给予(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂 双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺0.1、1和10mg/kg bid s.c. 和10mg/kg i.t.与地塞米松在OVA致敏的小鼠模型中对气道高反应 性提供了显著预防作用(正如使用小鼠全身体积描记术对醋甲胆碱攻 击的Penh响应减少所证实的)并且与BALF中嗜酸性粒细胞和白血细胞 的显著减少相关(然而，缺乏一致性的剂量响应相关性)。
图21示例(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2] 辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺对醋甲胆碱在卵白蛋白-致敏小鼠中的攻 击的Penh响应改变％的效果。在OVA攻击前30min，从第21天至第 25天的连续6天bid皮下给予或qd气管内给予(2S，3R)-N-2-((3-吡 啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺和媒介 物，且在第26天的MCh刺激前30min给予最后一次给药。测定Penh 值。施加一种方式ANOVA，然后进行Dunnett检验以比较OVA免疫接 种媒介物和其他治疗组。*与OVA-媒介物对照组相比P＜0.05。
图22示例(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2] 辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺对卵白蛋白-致敏小鼠中白血细胞计数和 细胞分类计数的效果。在OVA攻击前30min，从第21天至第25天的 连续6天bid皮下给予或qd气管内给予(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲 基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺和媒介物，且在 第26天的支气管肺泡灌洗液采集前30min给予最后一次给药。测定 总白血细胞计数和细胞分类计数。施加一种方式ANOVA，然后进行 Dunnett检验以比较OVA免疫接种媒介物和其他治疗组。*与OVA-媒介 物对照组相比P＜0.05。
图23示例(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1-氮杂双环[2.2.2] 辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺对卵白蛋白-致敏小鼠中％白血细胞计数 和细胞分类计数的效果。在OVA攻击前30min，从第21天至第25天 的连续6天bid皮下给予或qd气管内给予(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基) 甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺和媒介物，且 在第26天的支气管肺泡灌洗液采集前30min给予最后一次给药。测 定总白血细胞计数和细胞分类计数。施加一种方式ANOVA，然后进行 Dunnett检验以比较OVA免疫接种媒介物和其他治疗组。*与OVA-媒介 物对照组相比P＜0.05。
对如下文献进行参考：Hamelmann E，Schwarze J，Takeda K， Oshiba A，Larsen GL，Irvin CG和Gelfand EW，Noninvasive measurement of airway responsiveness in allergic mice using barometric plethysmography，Am J Respir Crit Care Med，156：766 775，1997。
本文所述实验的测试化合物以游离或盐形式使用。除非另有指定， 否则为体内测试提供的化合物是(2S，3R)-N-2-((3-吡啶基)甲基)-1- 氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-3，5-二氟苯甲酰胺盐酸盐，其中根据给出 的剂量推定游离碱形式。
所观察到的特异性药理学响应可以根据所选择的具体活性化合物 或是否存在药用载体以及所用制剂类型和给药方式的不同而改变并且 按照本发明实施预计这些结果中的这种预期的变化形式或差异。
尽管本文示例和详细描述了本发明的具体实施方案，但是本发明 并不限于此。提供上述详细描述作为本发明的典型，但不应将其视为 构成对本发明的任何限制。变型对本领域技术人员而言显而易见，且 不脱离本发明精神的所有变型均被指定为包括在待批权利要求范围 内。
机译： （2S，3R）-N-2（3-吡啶基）甲基）-1-氮杂双环[2.2.2] OCT-3-YL）-3,5-二氟苯甲酰胺及其治疗应用（2） -（2（（3-吡啶基）甲基）-1-氮杂双环（2.2.2] OCT-3-YL）-3,5-二氟苯甲酰胺及其治疗应用
机译： （2s，3r）-n-2-（（3-吡啶基）甲基）-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基）-3,5-二氟苯甲酰胺的制备和治疗应用。
机译： （2S，3R）-N-2-（（3-吡啶基）甲基）-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基）-3,5-二氟苯甲酰胺的制备和治疗应用
