源自大麦和麦芽的低DMS水平的饮料

摘要

本发明提供了源自大麦的饮料，其特征在于二甲基硫醚(DMS)和/或其前体S-甲基-L-甲硫氨酸(SMM)的水平均显著降低或者缺乏所述化合物。此外，本发明还涉及用于生产上述饮料的方法以及用于制备此饮料的大麦植物和由所述植物制备的其它植物产品。本发明的应用为进行具有改良风味谱的饮料的改良生产工序排除了障碍，并且还有望显著降低啤酒生产的热能输入。

说明书

本申请中引用的所有专利和非专利文献都通过引用全文并入本文。

技术领域

本发明涉及源自大麦的饮料，其特征在于二甲基硫醚(DMS)和/或其前体 S-甲基-L-甲硫氨酸(SMM)的水平均显著降低或者缺乏所述化合物中的一种 或优选缺乏所述两种化合物。此外，本发明还涉及用于生产上述饮料的方法 以及用于制备此饮料的大麦植物和由所述植物制备的其它植物产品。本发明 不但能够产生特征在于具有改良风味谱的饮料，还促成了热能输入(特别是煮 沸麦芽汁的热能输入)显著降低的新式生产方法。

背景技术

饮料，特别是啤酒可以以大麦(Hordeum vulgare，L)为基础生产，大麦是 栽培于世界许多地方的单子叶植物。大麦具有非常重要的经济地位，其不仅 作为用于包括啤酒在内的工业产品的原材料，还作为动物饲料的来源。

在啤酒以及包括茶、可可、乳、葡萄酒、蒸馏酒(例如朗姆酒)、甜玉米 和多种烹饪蔬菜在内的许多蔬菜和食品中，DMS给产品添加了突出且通常是 有益的气味和风味韵调(flavor note)。然而，高水平的DMS产生可能是不期 望的风味，其通常被描述为“熟甜玉米(cooked sweet corn)”或者有时被描述为 “黑醋栗样”的风味。

根据啤酒的类型，DMS水平通常可达到144μg/L并且有时可高达150 ppb(150μg/L)，其中所述DMS化合物通常产生不期望的“熟蔬菜”或“甘蓝样” 风味。然而，有时期望在储藏啤酒(lager beer)中具有低水平的所述化合物， 原因是其可有利于口感醇厚(palate fullness)和整体的啤酒芳香；感觉阈值为 ～25-50ppb，例如约30-45μg/L(Meilgaard，1982)。当DMS水平为＜10ppb时， 通常感觉不到DMS风味。

SMM在本文也称为DMS前体(DMSP)，它是通过SMM循环(图1A)功 能性组件的作用而在萌芽的大麦粒中合成的。其中，甲硫氨酸(Met)-S-甲基转 移酶(MMT)催化S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)的甲基转移至Met，形成SMM。 化合物SMM可进而作为由高半胱氨酸(Hcy)合成Met的甲基供体(由Hcy-S- 甲基转移酶(HMT)催化的反应)。虽然对于MMT的明确作用存在争议，但最 初提出其作用是防止用于蛋白合成的Met池被AdoMet的过度合成而耗尽 (Mudd and Datko，1990)。还提出SMM循环在植物的长距离硫传输中发挥作 用，其涉及叶中从Met至SMM的主流动(major flux)、SMM的韧皮部传输以 及在发育籽粒或其它储存组织(sink tissues)中SMM恢复为Met(Bourgis et al.， 1999)。但稍后的放射性示踪剂试验表明，所述循环操纵用于控制AdoMet水 平而不是用于防止Met耗尽(Ranocha et al.，2001)。SMM在植物中的生理学 作用的另一种解释涉及乙烯合成的调节(Ko et al.，2004)，其主要涉及通过使 用来自比赤酵母的重组1-氨基环丙烷-1-羧酸酯合成酶的研究而揭示的观点。

McElroy和Jacobsen(1995)指出，可通过利用例如反义技术调节SMM合 成，然而其没有提供有关待反义处理的相关靶基因的指导，但是预期获得阳 性结果的可能性值得怀疑，原因是SMM水平的大幅降低可能对大麦生长和 发育有害。McElroy和Jacobsen(见上)并没有讨论获得较低水平SMM的其它 方案。此外，如下文将详细讨论的，用以完全消除基因表达的反义技术还没 有成功地应用在大麦中。

遗憾的是，还没有用于制备指定蛋白表达完全缺失的转基因大麦植物的 方法。对于大麦，应用反义技术产生的转基因植物通常仍然表达一些指定蛋 白(参见，例如Robbins et al.1998；Stahl et al.，2004；Hansen et al.，2007)。此外， 还没有开发出应用于大麦植物的利用嵌合RNA/DNA或定点突变而制备特异 突变体的有效方法。与此相符，尽管进行了大量工作，本申请的发明人还是 没有获知成功地在大麦中进行由寡核苷酸引导的基因靶向的任何公开实例。 虽然没有在大麦中继续进行，但Iida和Terada(2005)发现已经在玉米、烟草 和水稻中测试了由寡核苷酸引导的基因靶向，只是在所有情况下都使用除草 剂抗性基因乙酰乳酸合成酶(ALS)作为靶标。根据Iida和Terada(见上)的结论， 仍未确定对上述策略的适当改进是否可应用于除可直接选择的那些基因(例 如ALS)以外的基因。利用锌指核酶的靶向突变代表了可潜在地用于基础植物 生物学或农作物改进的未来研究的另一类工具(Durai et al.，2005；Tzfira and  White，2005；Kumar et al.，2006)。即便在这种情况下，突变也没有在大麦中继 续进行或者成功地应用于大麦。

虽然如此，仍可以利用辐射或化学处理，例如利用叠氮化钠(NaN₃)处理， 通过随机诱变法制备大麦突变体。一个实例涉及致力于通过利用NaN₃诱变 大麦粒(kernel)，随后筛选高水平游离磷酸盐(phosphate)，来鉴定低肌醇六磷 酸盐(phytate)突变体(Rasmussen and Hatzack，1998)；从2,000个筛选的大麦粒 中总共鉴定出10个突变体。虽然并非总是如此，但在NaN₃处理后的发现特 定突变依赖于持续和有效的筛选方法，因此，远远不能总是成功。

在传统植物育种中，与鉴定有希望的分子靶标相关的难点在于难以确定 应当干扰指定生物化学通路中的何种成分才能产生系统读数的期望变化，以 及由此建立有用筛选方法的能力。

与啤酒生产相关的高温温育，例如麦芽的烘干(kiln drying)，或麦芽汁的 加热和煮沸可能诱导SMM至DMS的化学转化。由于DMS本身的性质，特 别是其沸点仅为37℃-38℃，在烘干和麦芽汁煮沸过程中形成的大部分DMS 可能流失至空气中。在高于～70℃的温度下，DMS的挥发性降低至非常低的 水平(Scheuren and Sommer，2008)，但这也是用于进一步氧化成二甲基亚砜 (DMSO)的条件。当煮沸麦芽汁的持续时间或者效力不足以转化残余SMM 时，DMS可在麦芽汁冷却过程中继续形成，随后被传送至啤酒中。

已经开发出了用于降低啤酒中的DMS水平的技术方法。例如，AU  38578/93描述了用于降低麦芽中DMS水平的方法，其包括对所述麦芽进行 蒸汽处理。在Bisgaard-Frantzen，H.et al.的专利申请US 2006/0057684中描述 了包括在70℃以上的温度下对醪液(mash)进行热处理的酿造方法。而在 Reuther，H.的美国专利No.5,242,694中描述了用于制备低碳水化合物的啤酒 的方法，其中所述方法包括全面煮沸麦芽汁，然后用二氧化碳洗涤所述麦芽 汁。然而，上述所有处理都消耗大量能量，并且还可能改变麦芽或麦芽汁的 特征。

发明概述

本发明公开了由大麦或其部分制备的饮料，特别是具有改良风味的啤酒。 本文公开的饮料具有非常低的DMS水平或者完全没有DMS，特别是DMS 水平低于感觉阈值的饮料，因此，其特征在于没有DMS的味道。

此外，本发明的饮料具有上好的味道性质。因此，本发明饮料的特征在 于特别均衡、可饮用、高度新鲜且芬芳的植物风味。

因此，本发明提供了由于不存在DMS或者DMS水平低而具有显著风味 性质的饮料。本发明人发现，DMS显著影响了人对啤酒中酯味(estery)化合物 的感知(参见图1B)，这符合本发明人提出的DMS掩盖所述化合物味道的模 型。

特别重要的是，本发明提供了具有特异阻断DMS前体形成的缺陷的大 麦或麦芽粒。由此，可以避免上文所述的DMS对酯味道的掩盖，其为大麦 和麦芽的工业应用提供了新机会。此外，具有特异阻碍DMS前体形成的缺 陷的大麦或麦芽粒还具有由DMS本身的缺乏引起的味道性质。特别地，所 述大麦或麦芽类型可被开发为实际工业应用中的原料，这有助于建立远远超 过当前性能的定制生产设置。具体而言，改良涉及到啤酒质量和啤酒生产的 环境可持续性，特别是：

(i)具有低水平的DMS特异性味道的啤酒；

(ii)具有改良的酯味道谱的啤酒；

(iii)用于啤酒生产的能量输入降低；和

(iv)在麦芽汁生产中的能量消耗降低。

本发明提供了实现所述改良的大麦植物和大麦粒。

因此，不受有关SMM代谢如何能与其它生物过程交互的理论因素的束 缚，本申请提供了用于开发和探究SMM合成缺陷型大麦植物的酿酒和工业 应用的机会，这在此前从未被提出过。

本发明公开了由携带了引起MMT活性完全丧失的MMT编码基因突变 的大麦植物或者其部分制备的特征在于低水平DMS特异性味道和改良的酯 味道谱的饮料，和/或特别均衡且可饮用，即高度新鲜且具有芬芳的植物风味 的饮料。此类植物在本文中称为“MMT无效(无效MMT)”大麦。

因此，本发明在一方面涉及由大麦植物或其部分制备的饮料，其中，所 述饮料含有的DMS水平低于30bbp(例如小于30ppb DMS)，并且其中所述 大麦植物携带引起MMT活性完全丧失的MMT编码基因突变。

另一方面，本发明提供了用于制备所述饮料的大麦植物。因此，本发明 的目的还在于提供大麦植物或其部分，其中，所述大麦植物携带引起MMT 活性完全丧失的MMT编码基因突变。

此外，本发明涉及由所述MMT无效大麦植物产生的植物产品，包括例 如麦芽和麦芽汁组合物，或基于大麦的糖浆或提取物，或者基于麦芽的糖浆 或提取物，或者辅料。在本发明中，所述辅料可以为未发芽的大麦，其可以 单独使用或者与发芽大麦组合用于制备麦芽汁。此外，本发明还提供了制备 所述大麦植物的方法以及制备所述饮料和其它植物产品的方法。

另外，在当今世界，环境破坏已提上国际议程，社会和工业应该致力于 降低全球温室气体排放和环境效益。因此，本发明的目的是提供用于利用低 能耗方法的啤酒生产的大麦植物。因此，本发明的大麦植物可用于利用与常 规的酿造方法相比，其加热步骤的时间跨度缩短，或者加热步骤的温度降低 的方法进行啤酒生产。本发明的重要意义在于，在烘干和麦芽汁煮沸工序的 步骤中的受益，与标准的酿造和啤酒生产方案相比，这些步骤可以被显著缩 短或者在较低的温度进行，由此降低能量消耗，从而提供更可持续的啤酒生 产方法。

序列表

根据以下详细描述和构成本申请一部分的附属序列表(总结在表10中)能 够更全面地理解本发明。表10列出了本文描述的核酸和多肽，所述寡核苷 酸引物和cDNA以及gDNA克隆的命名，其包括编码代表这些多肽的全部或 者大部分的多肽的核酸片段和相应的标识符(SEQ ID NO：)。所附序列描述和 序列表符合专利申请中核苷酸和/或氨基酸序列公开的管理标准。

附图说明

图1显示了SMM循环的所选成分和平均风味分值。(A)SMM循环的所 选成分，其中通过由Met-S-甲基转移酶(MMT)催化的从S-腺苷甲硫氨酸 (SAM)至甲硫氨酸(Met)的甲基转移而合成SMM。SMM可以进而在由Hcy-S- 甲基转移酶(HMT)催化的反应中作为由高半胱氨酸(Hcy)合成Met的甲基供 体。该图显示了本质上可逆的反应是如何相关连的。所述循环的每一轮都是 无益的，原因是其在消耗并随后重新产生两个Met的同时将ATP转化为腺苷、 PPi和Pi(未显示)。(B)显示的是专业啤酒品尝小组在所列性质(主味(body)、 酯味和DMS)方面对啤酒样品给出的平均风味打分±标准偏差。标准啤酒的对 照样本仅搀入啤酒(标记为“0”的柱)，或者搀入酯混合物，以在啤酒中产生以 下浓度：5ppm乙酸乙酯、1.5ppm乙酸异戊酯、0.05ppm己酸乙酯、0.13ppm 辛酸乙酯(标记为“1”的柱)，和包含100ppb DMS的上述酯混合物(标记为“2” 的柱)。

图2显示了参与荧光化合物SMM-OPA的碱性形成的分子。

图3显示了用以证明突变体8063和突变体14018的MMT无效表型的 HPLC和western印迹试验的结果。(A)基于HPLC分离cv.Prestige(其中cv. 是栽培品种culti(vated)var(iety)的缩写)的嫩芽提取物的实例，其中显示了天 冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、天冬酰胺(Asn)、丝氨酸(Ser)和SMM的洗脱。 在340nm激发OPA衍生化的大麦嫩芽提取物的荧光，并测定450nm处的发 光。(B)基于HPLC分离指定突变体和野生型cv.Sebastian的提取物。由突 变体提取物中成分的分离产生了没有SMM特异性峰的色谱图。(C)根据大 小从野生型Prestige(泳道2)、突变体8063(泳道3)、野生型Sebastian(泳道 5)和突变体14018(泳道6)的嫩芽提取物中分离的蛋白的western印迹结果。 在泳道1、4和7中分离了具有所示质量(kDa)的参考蛋白，同时使用来自大 肠杆菌细胞的重组MMT作为对照并在泳道8中分离。如实施例12中的详细 描述，120-kDa的蛋白染色条带代表MMT，但大肠杆菌提取物中的80-kDa 条带不是源自MMT，原因是该条带还存在于用载体pET19b转化的阴性对照 细胞的提取物中(参见图14B、C)。

图4显示了突变体8063的4日龄嫩芽中不存在MMT活性，但在类似萌 芽长度的野生型嫩芽中具有突出的活性。利用[³H]SAM作为底物测定MMT 活性。在利用活性炭除去残留的[³H]SAM后，通过闪烁计数监测MMT催化 的甲基由[³H]SAM转移至Met形成SMM。其与底物结合，但不与新合成的 标记产物SMM结合。该图示还显示SMM不存在于突变体的嫩芽中，但存 在于野生型的嫩芽中。分析了突变体和野生型植物的共30个嫩芽(突变体和 野生型植物各15个嫩芽)。

图5显示了野生型和MMT无效型的麦芽、麦芽汁和啤酒中游离DMSP 和游离DMS含量的比较。(A)突变体8063的绿色麦芽和烘干麦芽的DMSP 和游离DMS水平均显著降低。(B)突变体8063的甜麦芽汁和煮沸麦芽汁几乎 都缺乏DMSP和游离DMS，并且利用突变体8063的麦芽制备的啤酒的游离 DMS也非常低。

图6显示了由10人啤酒品尝小组建立的风味谱的比较；试验包括用野 生型cv.Power的麦芽和突变体8063(MMT无效)的麦芽酿造的啤酒。这种类 型的分析利用了图中所示的可以在0-5的分值上计量的多个预定的风味特 征。只有当其性质被认为在所分析的啤酒类型中是最高的时，才将该风味评 判为“极高”(分值对应于5)。(A)啤酒品尝小组对搀有酯和醇的啤酒的评价总 结列于表1。(B)详述品尝小组对无搀加啤酒的评价总结。

图7显示了繁殖NaN₃-诱变的大麦粒的方式的图示。M0代的大麦粒生长 为形成M1代大麦粒的植物。可以播种这些M1大麦粒，并生长为产生M2 代新大麦粒的M1植物。接下来，培育M2代植物并产生M3代大麦粒。也 可以使M3代大麦粒萌芽，并利用其样本例如胚芽鞘进行分析。还可以播种 M3种子并利用对应植物的花进行杂交获取M4代植物。

图8显示了优选的啤酒生长工艺的简单图示概要，其包括浸泡大麦谷粒 (1)、萌芽(2)、烘干(3)、研磨干燥的麦芽(4)、糖化(5)、过滤(6)、在添加酒花 的情况下煮沸麦芽汁(7)、在存在酵母的情况下发酵(8)、啤酒熟化(9)、啤酒过 滤(10)、包装到如瓶、罐等中(11)和贴标签(12)。这些独立的步骤可以集合成 包括生产麦芽(1-3)、生产麦芽汁(4-7)、发酵(8-9)和制备成品啤酒(10-12)的部 分。虽然图示的是优选的方法，但可以包括省略一些所述步骤(例如可以省略 过滤或者可以不加入酒花)的可选方式，或者可加入一些额外步骤(例如添加 辅料或碳酸盐/酯)。还可以利用发芽和未发芽大麦的混合物，或者仅用未发 芽大麦产生啤酒，在后一情况下通常在糖化过程中加入外源酶。

图9以图示形式显示了编码MMT的大麦基因的构造。所图示的是跨越 翻译起始密码子和终止密码子的长度为6368-bp的基因组序列(SEQ ID  NO：3)。外显子和内含子分别以编号的盒和未编号的线表示。外显子12用箭 头表示以显示转录和翻译的整体方向。核苷酸编号是指相对于翻译起始密码 子第一碱基的所示外显子的5′和3′末端。还图示了对应于使用表2所示引物 对的扩增的PCR延伸段的大致位置。

图10显示了与翻译序列(SEQ ID NO：6，利用单字母代码表示氨基酸)并 行排列的cv.Prestige大麦MMT的cDNA序列，其跨越了翻译起始密码子和 终止密码子，即编码区(SEQ ID NO：4)。

图11显示了大麦品种cv.Haruna Nijo(SEQ ID NO：2)和cv.Prestige(SEQ  ID NO：6)的几乎相同的MMT酶的序列比对。两个单独的氨基酸残基差别用 黑底白字突出显示。

图12显示了大麦突变体8063如何激活MMT基因内的隐藏剪接位点。 (A)在MMT基因的基因组结构图示下方的小水平箭头表示引物对15(参见 表4)的近似退火位置。(B)对利用来自野生型cv.Prestige或者突变体8063 的RNA模板的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)产物进行琼脂糖凝胶电泳后 的可视化DNA条带。(C)利用与A相同的图示元素，显示图12B中PCR产 物的内含子-外显子结构的图示。产物4的外显子5比野生型的短。垂直箭头 指向翻译提前终止密码子(premature stop codon)的近似位置。由于选择的引 物，所述产物不包含外显子1和2。然而，预测mRNA也包含外显子1和2。 (D)由内含子5内的突变(Mut.)和野生型(WT)5′剪接位点(突变位点用带下划 线的碱基表示)产生的转录本的详细图示。用3和4标记的连接实线的箭头分 别标记了在产物3和产物4(参见图12C)的剪接过程中使用的供体和受体位 点。标记为2^*的虚线指向野生型转录本(图12C的产物1)的剪接和未剪接的 产物2(参见图12C)。外显子和内含子5的碱基分别用小写和大写字母表示。 nt：核苷酸。(E)与突变体8063的MMT基因中内含子5的序列相比，单子 叶植物中5′和3′剪接位点的组成的概述(Sinibaldi and Mettler，1992)。

图13显示了用于突变体8063的异常MMT的异源表达的表达质粒，和 编码蛋白的比对。(A)包括所选限制性位点的pET19b-MMT的NcoI-BamHI 片段的图示，所述片段编码在带有肠激酶位点(**；序列SSGHIDDDDKH； SEQ ID NO：70)的框中与指定His-标签的序列(*；序列MGHHHHHHHHHH； SEQ ID NO：69)融合的野生型MMT。删除构建体示于(B)、(C)和(D)中。(E) 所编码的MMT序列(图A、B、C和D中所示的构建体分别对应于SEQ ID NOs： 6、11、13、15)的比对。使用对应于星号标记序列段的合成肽来产生针对大 麦MMT的多克隆抗体。对于野生型酶(SEQ ID NO：6)，没有显示跨越第333 位残基至第1084位残基的序列。

图14显示了在大肠杆菌中异源表达分别来自cv.Prestige和突变体8063 的野生型MMT和突变型MMT的结果，其试验细节描述在实施例12中。利 用由载体pET19b转化的大肠杆菌细胞的提取物以及纯SMM试样作为试验 对照样本。扫描后通过电子方式抹去两个印迹中泳道4和5之间包含了与本 申请无关的数据的凝胶面积。(A)纯SMM以及来自用所示质粒转化的大肠 杆菌细胞的提取物的HPLC-图谱。出于比较目的，所示图谱还是图18的实 体部分。(B)利用质粒pET-MMT(泳道2)、pET19b-Line8063-Prod3(泳道3)、 pET19b-Line8063-Prod4(泳道4)和pET19b(泳道5)转化的大肠杆菌细胞的可 溶性细胞提取物的根据大小分离的蛋白的Western印迹结果。泳道1中分离 的是具有所示质量(kDa)的参照蛋白。(C)用上文图14B部分所示的质粒转化 的大肠杆菌细胞的包涵体提取物的根据大小分离的蛋白的Western印迹结果。 在Western分析中使用的多克隆一抗是针对合成的大麦MMT的长15个残基 的肽而产生的，其对应于图13中用星号标记的氨基酸延伸段。

图15显示了用于鉴定以突变体8063的MMT基因中的G3076→A突变 为特征的谷粒的方法图示。如在相应反应(C)的琼脂糖凝胶电泳后溴化乙锭染 色的条带图案所示，引物对20(参见表7)在设定的反应1和反应2(A)中分别 产生了271-bp PCR片段和没有产生条带。在设定的反应3和4中(B)，仅后 者产生PCR片段。水平箭头表示与模板DNA的全序列匹配，而具有锐弯曲 的箭头显示错配。(D)利用抗-MMT抗体的Western印迹分析识别了野生型 cv.Prestige麦粒中的120-kDa MMT酶(泳道2)，而突变体8063中则没有识别。 在泳道1中分离的是标准蛋白，并显示相应的质量(kDa)。

图16显示大麦突变体14018如何激活MMT基因中的隐藏剪接位点。(A) MMT基因的基因组结构图示下方的小水平箭头表示引物对16(参见表4)的 近似退火位置。(B)对利用来自野生型(cv.Sebastian)或突变体14018的RNA 模板的RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后的可视化DNA条带。(C)利用与 A相同的图示元素，显示16B中PCR产物的内含子-外显子结构的描述。与 野生型的外显子2相比，产物8的外显子2被截短。垂直箭头指向翻译提前 终止密码子的近似位置。由于选择的引物，产物不包含外显子1。然而，可 以预测mRNA也包含外显子1。(D)对由内含子2中的突变(Mut.)和野生型 (WT)5′剪接位点产生的转录本的详细图示，其中用带下划线的碱基表示突变 位点。用7和8标记的连接实线的箭头分别标记了在产物7和产物8(参见图 16C)的剪接过程中使用的供体位点和受体位点。标记6^*的虚线指向野生型转 录本(图16C的产物5)的剪接和未剪接的产物6(参见图16C)。外显子和内含 子2的碱基分别用小写和大写字母表示。nt：核苷酸。(E)与突变体14018 的MMT基因中内含子2的序列相比，单子叶植物中5′和3′剪接位点的组成 的概述(Sinibaldi and Mettler，见上文)。

图17显示了用于突变体14018的异常MMT的异源表达的表达质粒，和 编码蛋白的比对。(A)包括所选择的限制性位点的pET19b-MMT的 NcoI-BamHI片段的图示，所述片段编码在带有肠激酶位点(**；序列 SSGHIDDDDKH；SEQ ID NO：70)的框中与指定His-标签的序列(*；序列 MGHHHHHHHHHH；SEQ ID NO：69)融合的野生型MMT。删除构建体示于 (B)、(C)和(D)中。(E)所编码的MMT序列(图A、B、C和D中所示的构建 体分别对应于SEQ ID NOs：18、22、24、26)的比对。对于野生型酶(SEQ ID  NO：18)，没有显示跨越第213位残基至第1084位残基的序列。

图18显示在大肠杆菌中异源表达分别来自cv.Prestige和突变体14018 的野生型和突变型MMT的基于HPLC的试验结果，试验细节描述在实施例 15中。利用纯SMM和由载体pET19b转化的大肠杆菌细胞的提取物作为试 验对照样本。出于比较目的，用星号标记的色谱图也是图14A的实体部分。

图19显示了用于鉴定以突变体14018的MMT基因中的G1462→A突变 为特征谷粒的遗传方法的图示。如相应反应(C)的琼脂糖凝胶电泳后溴化乙 锭染色的条带图案所示，引物对29(参见表9)在设定的反应1和反应2(A) 中分别产生了121-bp PCR片段和没有产生条带。在设定的反应3和4中 (B)，仅后者产生PCR片段(123bp)。水平箭头表示与模板DNA的全序列匹 配，而具有锐弯曲的箭头显示错配。(D)利用抗-MMT抗体的Western印迹 分析识别了野生型cv.Sebastian麦粒中的120-kDa MMT酶(泳道2)，但突变 体14018中则没有识别。在泳道1中分离标准蛋白，并显示相应的质量 (kDa)。

发明详述

定义

在随后的说明书、附图和表中使用了许多术语。为了提供包括给出这些 术语的范围的说明书和权利要求书，提供了下列定义：

本文使用的“一”可以指一个或多个，这取决于其使用的上下文。

术语“农学特征”描述了有助于形成所述植物的性能或经济价值的植物表 型或遗传特征。这种特征包括抗病性、抗虫性、抗病毒性、抗线虫性、抗旱 性、高盐度耐受性、产量、株高、成熟天数、麦粒分级(即麦粒的大小分级) 和麦粒的含氮量等。

与啤酒制造过程，特别是用于描述麦粒发芽(malting)过程时，相关术语 “大麦”指大麦粒。在其它所有情况下，除非另有说明，否则“大麦”是指包括 任何品种的大麦植物(Hordeum vulgare，L.)，而大麦植物的部分可以是大麦植 物的任何部分，例如任何组织或细胞。

在本文中限定的“谷类”植物是禾本科(Graminae)植物家族的成员，其中培 养禾本科植物主要是为了获取其含淀粉的种子。谷类植物包括，但不限于大 麦(Hordeum属)、小麦(Triticum属)、稻(Oryza属)、玉米(Zea属)、黑麦(Secale)、 燕麦(Avena属)、高粱(Sorghum属)和黑小麦(Triticale，黑麦-小麦杂交种)。

本文使用的“DMSP”是DMS前体或者潜在DMS的缩写，即可在饮料的 生产过程中能够转化为DMS的分子。SMM代表DMSP的主要部分(若非全 部)。本文将DMSP的水平定义为可以通过在碱性条件下煮沸1个小时，由 指定植物材料或其产品中的DMSP产生的DMS的量。根据本文的定义，1ppb DMSP可以被转化为1ppb DMS。

在有关特定核酸的上下文中，“编码”或“所编码的”表示包含用于翻译成 特定蛋白的信息。编码蛋白的核酸可在核酸翻译区内包含非翻译序列(例如内 含子)，或者可以缺乏这种插入的非翻译序列(例如在cDNA中)。利用密码子 对编码蛋白的信息进行说明。

本文在有关核酸的上下文中使用的“表达”应理解为来源于核酸片段的正 义mRNA或者反义RNA的转录和集聚。在有关蛋白质的上下文中使用的“表 达”指将mRNA翻译成多肽。

术语“基因”指参与产生多肽链的DNA片段；其包括在编码区之前和之 后的区域(启动子和终止子)。此外，编码蛋白的植物基因是不连续的，由被 内含子中断的外显子组成。在转录成RNA之后，通过剪接除去内含子以产 生成熟的信使RNA(mRNA)。通常通过作为剪接过程的剪接信号的共有序列 确定外显子之间的“剪接位点”，剪接过程包括从初级RNA转录产物删除内含 子和在切除内含子的任一侧连接或融合剩余RNA的末端。

本文使用的术语“萌芽(germination)”表示大麦粒在各种组合物中，例如在 见于自然界的普通土壤中开始或恢复生长。萌芽也可以在置于培养室等的盆 内土壤中进行，或者，例如可以在置于标准实验室皮氏培养皿的湿过滤纸上 进行，或者在麦粒发芽过程中进行(例如麦芽制造厂的浸泡罐或萌芽盒内进 行)。按照一般理解，萌芽包括麦粒的水合作用、麦粒的膨胀和诱导胚生长。 影响萌芽的环境因素包括湿度、温度和含氧量。观察根和嫩芽的发育。

本文使用的术语“分离(的)”表示从所述物质是从其原始环境中移出的。 例如，存在于活生物中的天然存在的多核苷酸或者多肽不是分离的，而从天 然系统中的一些或全部共存物质分离的相同多核苷酸或多肽是分离的。这种 多核苷酸可以是载体的一部分和/或这种多核苷酸或者多肽可以是组合物的 一部分，但它们仍然是分离，原因是这种载体或组合物不是其天然环境的一 部分。

术语“麦粒”被限定为包括谷类颖果，也称为内部种子(internal seed)、外 稃和内稃。在大多数大麦品种中，外稃和内稃附着于颖果上，而且是脱粒后 的麦粒的一部分。但是，还存在裸麦(naked barley)品种。在这些品种中，颖 果没有外稃和内稃，因此像小麦一样脱粒。术语“麦粒”和“谷粒”在本文中可 以互用。

“谷粒发育”是指开始于受精且终止于麦粒成熟和干燥的大麦生命周期， 其中借助或不借助液泡寻靶(vacuole targeting)将诸如糖、寡糖、淀粉、酚类、 氨基酸和蛋白的代谢储备物贮备至麦粒的各种组织，例如胚乳、外种皮、糊 粉和角质鳞片(scutellum)，导致麦粒膨胀、麦粒饱满。

术语“功能性MMT的完全丧失”(完全丧失功能性MMT)和“MMT活性的 完全丧失”(完全丧失MMT活性)是指缺乏MMT酶活性，即当使用下文实施 例2描述的试验时没有可检测到的MMT活性的大麦植物。或者通过分离所 述大麦的MMT cDNA，并测定由所述cDNA编码的蛋白是否能够催化甲基 基团从SAM转移至Met，并由此形成SMM来测定大麦植物的MMT活性。

术语“麦芽饮料”是指利用任选与其它成分混合的麦芽(例如发芽大麦和 未发芽大麦的混合物)制备的饮料，优选由包括用热水温育麦芽的步骤的方法 制备的饮料。麦芽饮料可以为，例如啤酒或无酒精麦芽饮料(maltinas)。

术语“发酵的麦芽饮料”是指已经发酵的，例如与酵母温育的麦芽饮料。

术语“MMT活性”是指大麦甲硫氨酸S-甲基转移酶的酶促活性。在本发 明中，“MMT活性”是MMT催化的Met的硫原子的甲基化以产生SMM。即 使MMT酶可能能够催化其它反应，出于测定本发明的MMT活性的目的， 仅应该考虑形成SMM的活性。图1B概述了通过甲基化将Met转化成SMM 的生物化学反应。

“(麦粒)发芽”是在不限于麦芽制造厂的浸泡池和萌芽箱内的受控环境条 件下进行的特殊萌芽形式。根据本发明的方法，麦粒发芽在浸泡大麦粒期间 和/或之后开始发生。可以通过干燥大麦粒，例如在烘干过程中终止麦粒发芽 过程。在未经烘干的情况下，麦芽被称为“绿色麦芽”。应理解，由MMT无 效大麦制备的麦芽组合物包含MMT无效麦芽，例如纯的MMT无效麦芽或 者包含MMT无效麦芽的任何麦芽混合物。可以对麦芽进行加工，例如通过 碾磨而加工，在这种情况下，还可将其称为“经碾磨的麦芽”或“面粉”。

“糖化”是经碾磨的麦芽在水中的温育。优选在特定温度和特定体积的水 中进行糖化以对底物进行期望的酶促解聚合。水的温度和体积是重要的，因 为其能够影响来源于麦芽的酶活性的下降速率，由此特别能够影响能够发生 的淀粉水解的量。蛋白酶作用也可具有重要性。糖化可以在辅料存在下发生， 应该理解辅料包含除麦芽以外的任何碳水化合物源，例如但不限于作为完整 麦粒或者经加工的产品(例如粗面粉或淀粉)的大麦(包括MMT无效大麦)或玉 米或稻米，所有都主要用作提取物的其它来源(在麦芽汁煮沸的过程中常添加 糖浆)。酿酒厂内辅料的加工要求取决于所用辅料的状态和类型，并且特别是 淀粉胶化或液化的温度。如果胶化温度超过正常的麦芽糖化温度，则淀粉在 添加至麦芽浆(mash)中之前就被胶化和液化。

当给定突变与纯合遗传特征锁定时，例如在≥M3代中，相应的大麦植 物在本文中可交换地称为“突变体”或者“突变系”或者“系”。

“突变”包括基因的编码和非编码区的缺失、插入、取代、颠换(transversion) 和点突变，其中非编码区优选为启动子区或内含子。缺失可以是整个基因或 者仅基因的一部分的缺失。点突变涉及一个碱基或者一个碱基对的变化，并 且可产生终止密码子、移框突变或氨基酸取代。体细胞突变是指仅发生在植 物的某些细胞或组织中的且不遗传至下一代的那些突变。生殖细胞突变可见 于植物的任何细胞中并且是遗传的。参考本文的图7，其显示了在育种程序 中如何繁殖突变大麦谷粒的概述，M3代谷粒和其直接繁殖的谷粒或者包括 其植物在内的任意子代可以称为“原始突变体(raw mutant)”。此外，仍然参照 本文图7，术语“育种系”是指M4代的谷粒和包括其植物在内的任意子代， 其可能是与栽培品种的杂交结果，或者是与具有单独的特定特征的另一育种 系杂交的结果。

本文使用的术语“MMT无效(无效MMT)”是指功能性甲硫氨酸S-甲基转 移酶的完全丧失。因此，“MMT无效(无效MMT)大麦植物”是在编码MMT 的基因中包含导致功能性MMT完全丧失的突变的大麦植物。类似地，“MMT 无效(无效MMT)麦粒”是在编码MMT的基因中包含导致功能性MMT完全 丧失的突变的麦粒，等等以此类推。

术语“大麦植物的部分”，例如包含在短语“大麦植物或其部分”的含义中 的术语“大麦植物的部分”包括大麦植物细胞、大麦植物原生质体、可以再生 出大麦植物的植物细胞组织培养物、大麦植物愈伤组织(calli)和在植物或大麦 植物的较大部分，例如胚、花粉、胚珠、花、麦粒、叶、根、根尖、花药或 植物的任意部分中的完整大麦植物细胞。

“PCR”或“聚合酶链式反应”是本领域技术人员熟知的用于扩增特定DNA 片段的技术(Mullis，K.B.et al.的美国专利No.4,683,195和No.4,800,159)。此 外，反转录(RT)-PCR也是本领域技术人员熟知的。对生物样本进行RT-PCR 的目的是检测特定基因的表达mRNA。当与MMT有关时，RT-PCR通常包 括获得疑似含有MMT的mRNA的样本，利用反转录酶、聚合酶和一对特异 性引物对样本进行RT-PCR以扩增如果存在的所述RNA，并检测作为样本中 存在MMT编码RNA的标志的扩增产物。引物成对发挥作用：“正向引物”(或 “上链引物”或“直接引物”)和“反向引物”(或“下链引物“)。本文给出的引物序 列为5′-至-3′方向。

术语“植物产品”表示由植物或植物部分的加工产生的产品。例如，所述 植物产品可以是麦芽、麦芽汁、发酵或未发酵饮料、食品或饲料。

本申请含义内的“啤酒品尝专家小组”是在品尝和表述啤酒风味(主要集 中于酯、高级醇、脂肪酸、硫成分和主味(body))方面受过全面训练的专家小 组。虽然存在许多用于评价风味成分的分析工具，但难以通过分析来评价风 味活性组分的相对显著性。但是，此类复杂的性质可以由品尝专家进行评价。 品尝专家的持续训练包括品尝并评价掺入了特定浓度的啤酒成分，例如乙酸 异戊酯、乙酸乙酯、己酸乙酯和异戊醇的标准啤酒样本。

术语“剪接位点”表示基因的外显子和内含子之间的界限。因此，剪接位 点可以是从外显子至内含子的边界，也被称为“供体位点”，或者是从外显子 分隔内含子的边界，也被称为“受体位点”。植物的剪接位点通常包括共有序 列。内含子的5′末端通常由保守性GT二核苷酸(mRNA中为GU)组成，内含 子的3′末端通常由保守性二核苷酸AG组成。因此，内含子的5′剪接位点包 含内含子的5′末端，而3′剪接位点包含内含子的3′末端。优选地，在本发明 中，内含子的剪接位点是

(i)由内含子的最5′端的二核苷酸(通常为GT)组成的5′剪接位点；或者

(ii)由内含子的最3′端的二核苷酸(通常为AG)组成的3′剪接位点。

“隐藏的剪接位点”在正常条件下不被识别并因此通常不引起剪接。然而， 在具有位于天然元件内的点突变的转录本中，此位点可以被激活用于剪接事 件。

“组织培养物”表示包含相同或不同类型的分离细胞的组合物，和组织成 为植物的部分(例如原生质体、愈伤组织、胚、花粉和花药等)中的那些细胞 的集合。

“野生大麦”，即Hordeum vulgare ssp.Spontaneum被认为是当今栽培大麦 的祖先。认为大麦从野生态至栽培态的转变与该植物向“大麦当地品种”的驯 化同时发生。与野生大麦相比，这些大麦在遗传上与现代栽培品种更紧密相 关。

术语“野生(型)”大麦是指按照惯例产生的大麦植物，优选该术语是指衍 生出本发明大麦植物的大麦植物，即亲本植物。野生型大麦粒通常可作为“栽 培品种”(通常简称为“cvs”，即由国家植物育种组织列出的在遗传上相似的麦 粒)而得自例如种子公司。术语“栽培品种”和“品种”在本文中可以交换使用。

术语“麦芽汁”表示麦芽，例如碾磨麦芽或绿色麦芽或者碾磨的绿色麦芽 的液体提取物。除所述麦芽外，还可以由麦芽和额外的成分，例如部分转化 为可发酵糖的其它含淀粉物质制备所述液体提取物。麦芽汁通常通过糖化， 随后任选的“喷射提取(sparging)”(即在用热水糖化后从用过的谷粒提取残留 糖和其它化合物的过程)而获得。喷射提取通常在滤桶、麦芽浆过滤器或可以 从用过的谷粒分离提取液体的另一种设备内进行。糖化后获得的麦芽汁通常 被称为“第一麦芽汁”，而喷射提取后获得的麦芽汁通常被称为“第二麦芽汁”。 如非特别指明，术语麦芽汁可以是第一麦芽汁、第二麦芽汁或者二者的组合。 在啤酒生产过程中，麦芽汁通常与酒花一起煮沸。没有与酒花一起煮沸而制 备的麦芽汁还可以称为“甜麦芽汁”，而无论有或没有与酒花一起，煮沸的麦 芽汁都可以被称为“煮沸的麦芽汁”。

大麦植物

大麦是一类植物。野生大麦(Hordeum vulgare ssp.Spontaneum)被认为是 当今栽培大麦的祖先。认为大麦从野生态至栽培态的转变与多个基因座的等 位基因频率的重要变化同时发生。农场主积极选择稀少的等位基因和新突变 事件，并很快在称作“大麦当地品种”的驯化植物群体中确立新特征。与野生 大麦相比，这些大麦在遗传上与现代栽培品种更密切相关。直至十九世纪晚 期，大麦当地品种才作为近交系和杂种分离子的高度异源混合物出现，其包 括由较早世代的随机杂交而来的少数植物。在现代农业中，大多数当地品种 已经被纯系栽培品种取代。剩余当地品种的特征在于中等水平或高水平的遗 传多样性。最初，“现代大麦”栽培品种代表了自当地品种的选择。后来，这 些栽培品种来源于确定的纯系，例如不同地理来源的纯系之间连续多轮的杂 交。最后，导致在许多，也可能是所有现代农作物的遗传基础显著缩小。与 当地品种相比，现代大麦栽培品种有多个改良的性质(Nevo，1992；von  Bothmer，1992)，例如但不限于：

(i)隐藏和裸露的麦粒；

(ii)种子休眠；

(iii)抗病性；

(iv)环境耐受性(例如对干旱或土壤pH的耐受性)；

(v)赖氨酸和其它氨基酸的比例；

(vi)蛋白含量；

(vii)氮含量；

(viii)碳水化合物组成；

(ix)大麦醇溶蛋白组成。

在本发明中，术语“大麦”包括任何大麦植物。因此，本发明涉及在编码 MMT的基因中具有导致功能性MMT完全丧失的突变的任何大麦植物。

然而，优选用于本发明的大麦植物是现代大麦栽培品种或纯系。本发明 使用的大麦栽培品种可以是，例如选自Sebastian、Celeste、Tangent、Lux、 Prestige、Saloon、Neruda、Harrington、Klages、Manley、Schooner、 Stirling、Clipper、Franklin、Alexis、Blenheim、Ariel、Lenka、Maresi、 Steffi、Gimpel、Cheri、Krona、Camargue、Chariot、Derkado、Prisma、 Union、Beka、Kym、Asahi 5、KOU A、Swan Hals、Kanto Nakate Gold、 Hakata No.2、Kirin-choku No.1、Kanto late Variety Gold、Fuji Nijo、New  Golden、Satukio Nijo、Seijo No.17、Akagi Nijo、Azuma Golden、Amagi  Nijpo、Nishino Gold、Misato golden、Haruna Nijo、Scarlett、Quench、NFC  Tipple和Jersey组成的组，优选来自Haruna Nijo、Sebastian、Tangent、Lux、 Prestige、Saloon、Neruda、Power、Quench和NFC Tipple组成的组。

因此，在本发明的一个实施方式中，所述植物是在编码MMT的基因中 具有导致功能性MMT完全丧失的突变的现代大麦栽培品种，优选选自上文 所述大麦栽培品种的组的一个栽培品种。因此，在该实施方式中优选所述大 麦植物不是大麦当地品种。

所述大麦植物可以是任何适合的形式。例如，本发明的大麦植物可以是 能活的大麦植物、干燥的植物、均质化的植物或者经碾磨的大麦粒。所述植 物可以是成熟的植物、胚、萌芽的麦粒、发芽的麦粒或经碾磨的发芽麦粒等。

大麦植物的部分可以是所述植物的任何合适的部分，例如麦粒、胚、叶、 茎、根、花或其小部分(fraction)。所述小部分可以是，例如麦粒、胚、叶、 茎、根或花的部分。大麦植物的部分还可以是匀浆的小部分、提取物的小部 分、或者经碾磨的大麦植物或麦粒的小部分。

在本发明的一个实施方式中，大麦植物的部分可以是所述大麦植物的细 胞，优选可以在体外，例如细胞或组织培养物中繁殖的活细胞。特别地，在 一个实施方式中，所述细胞可以是不能成熟为完整大麦植物的细胞，即不是生殖物质的细胞。

功能性MMT酶的丧失

本发明涉及植物产品，例如由大麦植物或其部分制备的饮料，所述大麦 植物在MMT基因中具有导致功能性MMT酶丧失的突变，例如与野生型大 麦的相应水平相比，优选与上文描述的任意野生型大麦栽培品种相比，更优 选与cv.Prestige品种的野生型大麦相比，丧失至少90％的MMT活性，优选 至少97％，更优选至少99％，还更优选至少99.5％的MMT活性。最优选地， 所述大麦植物在编码MMT的基因中具有导致MMT功能完全丧失的突变。

功能性MMT酶的完全丧失可以基于不同的机制。例如，功能性MMT 酶的完全丧失可能是由所述植物中的异常蛋白产生，即异常MMT酶，例如 没有可检测到的活性的突变MMT蛋白。例如，突变体的MMT蛋白可以是 截短的蛋白。MMT活性的丧失可以类似地基于不同的机制，例如异常MMT 蛋白。

优选地，通过催化甲基从SAM转移至Met由此形成SMM的能力来测 定突变MMT蛋白的活性。可以根据，例如下文实施例4的描述进行这种测 定。优选地，通过测定分离的相应大麦cDNA的翻译序列获得突变MMT的 氨基酸序列。这可以基本按照下文实施例8的描述进行。或者，通过如下文 实施例11和实施例12所述，在细菌细胞培养物中异源表达，然后验证重组 蛋白作为MMT酶是没有活性的而获得本发明大麦植物的突变MMT。

可以通过MMT蛋白的缺失而实现功能性MMT的完全丧失。MMT蛋白 的缺失将导致MMT功能的丧失。因此，所述大麦植物可以不包含，或者仅 包含非常少的，优选不包含可检测到的MMT蛋白。可以通过本领域技术人 员熟知的任何合适的手段测定MMT蛋白存在与否。然而，优选通过利用识 别MMT的特异抗体检测MMT蛋白的技术对所述蛋白进行分析。所述技术 可以是，例如Western印迹或者酶联免疫吸收试验，所述特异性抗体可以是 单克隆或者多克隆抗体。然而，优选所述抗体是识别MMT蛋白中的数个不 同表位的多克隆抗体。也可以通过间接检测，例如通过用于MMT活性测定 的方法间接检测。因此，在本发明的一个优选实施方式中，当在所述植物中 不能检测到MMT蛋白时，大麦植物被描述为编码MMT的基因中具有突变， 由此引起MMT活性的完全丧失。特别地，根据Western印迹分析，当在所 述大麦植物，优选在所述大麦植物的麦粒中没有检测到质量约为120kD， ±10％的MMT蛋白时，即是不能检测到MMT蛋白的情况。

功能性MMT的完全丧失也可能是没有MMT mRNA转录，或者MMT  mRNA转录非常少的结果，优选没有MMT mRNA转录。本领域技术人员应 该理解，MMT转录本的缺失也将导致MMT蛋白的缺失。

然而，优选地，功能性MMT的完全丧失是表达异常MMT转录本的结 果。所述转录本可以优选由初始转录本的异常剪接事件，例如由于剪接位点 内的突变引起的。可以，例如通过Northern印迹，或者通过RT-PCR方法检 测编码MMT的转录本的表达。

本发明的大麦植物中功能性MMT的完全丧失是由一个或多个突变引起 的。因此，本发明的大麦植物通常在MMT基因中具有至少一个突变。所述 突变可以在调控区内，例如在启动子或内含子内，或者所述突变可以在大麦 的编码区。因此，还可以通过分析MMT编码基因中的突变来检测功能MMT 的丧失。可以通过，例如对所述基因进行测序然后将其与野生型序列，优选 本文给出的cv.Prestige野生型序列(SEQ ID NO：3)，或者cv.Sebastian野生型 序列(SEQ ID NO：16)进行比较而检测MMT编码基因中的突变。优选地，如 实施例2或实施例4的描述，在鉴定突变后，通过检测MMT活性确定功能 的丧失。

术语MMT蛋白意在包括SEQ ID NO：6所示的全长大麦MMT蛋白，或 其功能同源物。在本文中，功能同源物是与SEQ ID NO：6所示的大麦MMT 蛋白具有相同水平±25％的MMT活性的MMT蛋白，其中所述MMT活性是 按照下文实施例2或实施例4中的描述测定的。

丧失至少90％，例如95％，例如99％，例如99.5％的MMT活性或者完 全丧失MMT活性的大麦植物可以包括具有部分功能的，或者优选没有功能 的截短形式的MMT，例如N-末端或C-末端的截短形式。大麦植物可以包含 多于一个截短形式的MMT，例如2个，或者例如3个，或者例如大于3个 不同截短形式的MMT，其可能是由异常剪接的转录本引起的。所述截短形 式仅包括MMT的N-末端片段。除了野生型MMT的N-末端片段外，所述 MMT的截短形式还可以包括在未见于野生型MMT中的其它C-末端序列。 所述其它C-末端序列可以例如被翻译的内含子序列，例如由于异常剪接而包 含在突变mRNA中的那些序列。优选地，所述截短MMT形式包含SEQ ID  NO：6的至多500个，更优选至多450个，甚至更优选至多400个，还更优选 至多350个，甚至更优选至多320个，还更优选至多311个，或者至多288 个N-末端氨基酸残基。当所述大麦植物的MMT活性完全丧失时，特别如此。 然而，MMT还可以包含较少的SEQ ID NO：6的N-末端氨基酸，例如不多于 300个，例如不多于250个，例如不多于200个，例如至多150个，例如不 多于147个，例如不多于133个SEQ ID NO：6的N-末端氨基酸。

在一个非常优选的实施方式中，所述截短的MMT形式可以由SEQ ID  NO：6的第1-311个氨基酸或者第1-288个氨基酸和任选的不存在于野生型 MMT中的其它C-末端序列组成。优选地，所述其它C-末端序列由至多50 个，更优选至多30个，甚至更优选至多10个，还更优选至多4个，或者至 多1个氨基酸组成。在一个非常优选的实施方式中，截短形式的MMT可以 是SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15的蛋白。SEQ ID NO：11 或SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15的蛋白都不是功能性MMT酶。

在另一个非常优选的实施方式中，截短的MMT形式可以由SEQ ID  NO：18的第1-147个氨基酸或者第1-133个氨基酸和任选的不存在于野生型 MMT中的其它C-末端序列组成。优选地，所述其它C-末端序列由至多50 个，更优选至多40个，甚至更优选至多39个，或至多33个，或至多30个 氨基酸组成。在一个非常优选的实施方式中，截短形式的MMT可以是SEQ  ID NO：22或SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：26的蛋白。SEQ ID NO：22或SEQ  ID NO：24或SEQ ID NO：26的蛋白都不是功能性MMT酶。

上述截短形式的MMT可以存在于，例如编码MMT的基因具有突变的 大麦植物中，其中所述突变引入了翻译提前终止密码子，导致形成编码上述 截短形式MMT的基因。

在本发明的优选实施方式中，所述大麦植物包含被转录成mRNA的基 因，其包含被剪接在一起且没有插入的部分而非全部野生型MMT基因(野生 型的大麦MMT基因的内含子-外显子结构示于图9)。因此，在一个实施方式 中，优选本发明大麦植物的MMT mRNA包含被剪接在一起且没有插入的至 多外显子1、2、3、4和5，或者例如被剪接在一起且没有插入的至多外显子 1和2。除了所述剪接在一起的外显子外，本发明大麦植物的MMT mRNA 还可以包含源自野生型内含子和/或外显子的其它3′末端序列，其中内含子将 外显子序列分隔开来。通过RT-PCR测定的并且具有相应片段长度(bp)的本 发明大麦植物的异常MMT mRNA的优选实例示于图12和图16。更优选地， 本发明大麦植物的异常mRNA是图12所示的5′端进一步包含外显子1和2 的mRNA，或者图16所示的5′端进一步包含外显子1的mRNA。

在本发明的一个非常优选的实施方式中，MMT基因具有突变的大麦植 物在MMT基因内的剪接位点内包含突变，其导致异常剪接的mRNA。更优 选地，所述突变位于MMT基因的内含子内，甚至更优选位于内含子的5′剪 接位点中，例如内含子1(分隔外显子1和2的内含子)上的5′剪接位点中， 例如内含子2(分隔外显子2和3的内含子)上的5′剪接位点中，例如内含子3 (分隔外显子3和4的内含子)上的5′剪接位点中，例如内含子4(分隔外显子 4和5的内含子)上的5′剪接位点中，例如内含子5(分隔外显子5和6的内含 子)上的5′剪接位点中，内含子6(分隔外显子6和7的内含子)上的5′剪接位 点中，最优选在内含子2或者内含子5上的5′剪接位点中。

优选所述突变是上述内含子的末端5′碱基的G→A突变。因此，非常优 选的突变是内含子2的末端5′碱基的G→A突变，或者内含子5的最5′碱基 的G→A突变。

本发明的大麦植物可以由本领域技术人员熟知的任何合适的方法制备， 优选通过下文“功能性MMT完全丧失的大麦植物的制备”部分描述的方法制 备。

在本发明的一个实施方式中，优选本发明的MMT活性完全丧失的大麦 植物在生理学和发育学上具有与野生型大麦相当的谷粒和植物特征。因此， 在本文中优选MMT无效大麦植物在对农学具有重要性的特征上类似于野生 型大麦，例如株高、每株的分蘖数、开始开花和/或每穗的谷粒数。

在一个非常优选的实施方式中，本发明大麦植物的MMT编码基因具有 SEQ ID NO：8所示的序列。因此，优选本发明大麦植物在SEQ ID NO：3的第 3076位碱基具有G→A突变(其中，SEQ ID NO：3是大麦cv.Prestige的MMT 的野生型基因组序列)。

MMT活性完全丧失的大麦植物的一个优选实例是2008年10月13日保 藏在美国标准培养物保藏中心(ATCC，美国马纳萨斯(VA20110)大学街10801 号专利存放处)，被称为″大麦，Hordeum vulgare；8063系(Barley，Hordeum  vulgare；Line 8063)″的大麦植物。因此，本发明的大麦植物可以是2008年10 月13日保藏在ATCC的大麦系8063(ATCC专利保藏名称：PTA-9543)，或 其任何子代大麦植物，其中本发明大麦植物的MMT编码基因具有SEQ ID  NO：8所示的序列。

在一个非常优选的实施方式中，本发明大麦植物的MMT编码基因具有 SEQ ID NO：19所示的序列。因此，优选本发明的大麦植物在SEQ ID NO：16 的第1462位碱基具有G→A突变(其中，SEQ ID NO：16是大麦cv.Sebastian 的MMT的野生型基因组序列)。

功能性MMT完全丧失的大麦植物的制备

根据本发明，功能性MMT完全丧失的大麦植物可由本领域技术人员熟 知的任何合适的方法制备。优选地，本发明的大麦植物通过包括以下步骤的 方法制备：诱变大麦植物或其部分(例如大麦麦粒)，然后逐个筛选和选择 MMT活性完全丧失的大麦植物。有趣的是，本发明一方面涉及可以鉴定所 述大麦植物的非常高效率的新筛选方法。

因此，本发明的目标是提供制备MMT基因具有引起MMT活性完全丧 失的突变的大麦植物的方法。所述方法包括以下步骤：

(i)诱变大麦植物，和/或大麦细胞，和/或大麦组织，和/或大麦粒，和/ 或大麦胚，由此获得M0代大麦；和

(ii)繁殖(例如培育)≥2代的所述诱变大麦植物、麦粒和/或胚，由此获得 Mx代的大麦植物，其中x为≥2的整数；和

(iii)获得所述Mx大麦植物的样本；和

(iv)测定所述样本中SMM的水平；和

(v)选择植物，其中所述样本包含小于10ppb SMM，优选小于5ppb  SMM，更优选不能检测到SMM；和

(vi)对至少一部分MMT基因进行测序；和

(vii)选择MMT基因中具有突变的植物。

由此获得MMT基因中具有引起功能性MMT完全丧失的突变的大麦植 物。

上述列表中的步骤(i)可以涉及诱变活的大麦材料，其选自大麦植物、大 麦细胞、大麦组织、大麦粒和大麦胚组成的组，优选选自大麦植物、大麦粒 和大麦胚组成的组，更优选大麦粒。可以通过任何适合的方法进行诱变。在 一个实施方式中，通过将诱变剂和大麦植物或其部分一起温育，例如和大麦 粒或来自大麦的单个细胞一起温育而进行诱变。这种诱变剂是本领域技术人 员已知的，并且可以例如选自叠氮化钠(NaN₃)、甲磺酸乙酯(EMS)、叠氮丙 三醇(AG)、甲基亚硝基脲(MNU)和马来酰肼(MH)组成的组。

在另一个实施方式中，通过照射，例如通过紫外线照射大麦植物或其部 分，例如麦粒来进行诱变。在本发明的优选实施方式中，依照下文“化学诱变” 部分中列出的任何方法进行诱变。合适的诱变方案的非限制实例公开在 Breddam，K.et al.的美国专利No.7,420,105号的实施例1以及下文的实施例2 中。

优选以以下方式进行诱变，即在筛选M3代的大麦时，期望突变的预期 频率达到每10,000谷粒最少0.5，例如0.5-5的范围，例如0.9-2.3的范围。

在优选的实施方式中，对大麦粒实施诱变，并将其被命名为M0代(另参 见图7)。

在诱变后，选择没有可检测到的MMT活性的大麦植物或其部分。优选 地，选择过程包括从大麦植物，优选从萌芽的大麦植物，甚至更优选从已经 萌芽4天的大麦植物获取样本。优选所述样本来自胚芽鞘和/或初生叶，优选 来自叶。因此，所述样本可以为，例如1cm-3cm范围的叶组织。

可以根据本文描述的新开发的多步骤方案提取并分析样本，所述方案涉 及不同溶剂和结合物质的连续使用。通常，可以利用溶剂或溶剂混合物，优 选水和/或有机溶剂提取样本。所述有机溶剂可以是，例如醇，优选甲醇，或 者所述有机溶剂可以为，例如卤代烷，优选氯仿。在一个优选的实施方式中， 所述溶剂是水、甲醇和氯仿的混合物。有利地，可以在例如利用振荡器或混 合器混合的同时进行所述提取。可以向所述溶剂/样本混合物中加入固体支持 物，例如珠，如玻璃珠。

在优选的实施方式中，上述叶样本取自Mx代麦粒，其中x是≥2的整数， 优选在2-10的范围，更优选在3-8的范围。在非常优选的实施方式中，测定 M3萌芽植物或其样本(例如叶)中SMM的水平。在所述实施方式中，优选培 养M0代的诱变大麦粒以获得大麦植物，其随后进行杂交以获得M1代麦粒。 重复所述过程直至获得M3代麦粒(参见图7)。

优选SMM水平的测定基于下文描述的新方法。有趣的是，该方法可以 高通量地筛选，从而使其可以鉴定以功能性MMT完全丧失为特征的大麦植 物。

概括地，所述方法优选涉及使按照上文描述制备的样本或优选所述样本 的提取物与能够结合SMM的化合物反应。发现OPA试剂(下文简称为OPA， Sigma，cat.no.P7914；参见图2)特别适用于测定SMM水平。其中，OPA与 SMM反应形成被称为SMM-OPA(参见图2)的分子。所述反应优选涉及使按 照上文描述制备的样本的提取物与OPA一起温育。此外，优选向反应混合物 中加入3-巯基丙酸。优选将所述混合物保持在碱性pH，优选在pH 8-pH 11 的范围，更优选在pH 9-pH 11的范围，甚至更优选在pH 9.5-pH 10.5的范围， 例如在pH 10。优选在0℃-10℃的范围，优选在1℃-8℃的范围，甚至更优选 在2℃-6℃的范围，甚至更优选在3℃-5℃的范围，例如4℃的温度下进行温 育。温育时间优选≥10分钟。

基于SMM-OPA分别吸收和发射340nm和450nm的光的现象，可利用 荧光分光镜对其进行检测。检测的最初步骤优选包括在柱子上，优选在30×2 mm Gemini 3μC18柱子(Phenomenex，cat.no.00A-4439-80；Phenomenex，2006) 上分离提取物，然后利用高通量液体色谱系统，优选Ultra Performance Liquid  Chromatography(UPLC system，Waters，其是经设计用以鉴定和测量在340nm 激发且在450nm发射的分子的荧光水平)检测荧光。当利用该方法时，“没有 可检测到的SMM”表示不存在与SMM共洗脱的可检测的化合物。在这种情 况下，色谱峰的小“肩峰”被认为是假峰。因此，参见图3，在Asn/Ser峰右手 侧的小肩峰被认为不代表SMM峰。因此，例如，图3B中所示的上面两个色 谱被认为是描述了“没有可检测到的SMM”，而该图下部色谱则代表了包含 SMM的样本的分离。

可以优选按照实施例2的描述进行SMM的检测。本发明的用于选择大 麦植物的优选方法描述在下文的实施例2中。萌芽大麦植物，甚至更优选已 经萌芽4天的大麦植物。值得注意的是，上文提及的筛选方法特别有用。首 先，分析方法全都是新的。此外，上述方法的显著进步在于其能够测定萌芽 大麦植物中，例如萌芽大麦植物的叶中的SMM水平。从萌芽大麦取样的时 间选择产生了用于基于UPLC的SMM检测的预料不到地纯净制备物。其它 样本，例如上文所述类似谷粒的麦芽汁样本的组成太复杂，并且通常不能用 于所提及的用于检测SMM水平的色谱方法。

在鉴定出具有小于10ppb SMM，优选没有可检测到的SMM的大麦植物 后，通常对相应的MMT基因或其部分进行测序以测定所述大麦植物是否能 够被归类为MMT基因中具有突变的类型。然后选择特征在于没有可检测到 的SMM并且其中MMT编码基因的一个或多个碱基不同于野生型序列的大 麦植物。在这种情况下，优选野生型序列是见于相应的野生型大麦栽培品种 的序列，优选本文给出的SEQ ID NO：3的序列。优选所述突变如上文所述。

可以进一步繁殖所选择的大麦突变体，并根据SMM含量对子代植物进 行再筛选。在筛选出有用的大麦植物后，可将其用于使用在下文“植物育种” 部分描述的那些传统方法的育种计划中。

植物产品

本发明一方面涉及由MMT基因具有引起MMT功能完全丧失的突变的 大麦植物或其部分制备的，具有低DMS水平的饮料或其它植物产品。有趣 的是，此类植物产品通常包含非常低水平的DMS。此外，此类植物产品通常 还包含非常低水平的SMM，并且还优选包含非常低水平的DMSO。不受理 论束缚，本申请人确认缺少源自大麦和麦芽的SMM导致由所述特征在于丧 失功能性MMT酶的大麦制备的饮料和其它植物产品中的DMS水平非常低。 下文描述了由MMT活性完全丧失的大麦植物制备的有用植物产品的实例， 例如饮料。

优选所述饮料，或所述植物产品包含的DMS或SMM含量分别为由野生 型大麦植物制备的类似饮料或植物产品的：

(i)小于30％，优选小于20％，更优选小于15％，甚至更优选小于10％ 的DMS；和/或

(ii)小于30％，优选小于20％，更优选小于15％，甚至更优选小于 10％，例如小于5％，如小于2％的SMM。

甚至更优选所述饮料或所述植物产品包含：

(i)小于30ppb，优选小于25ppb，更优选小于20ppb，甚至更优选小 于15ppb，还更优选小于10ppb，甚至更优选小于5ppb，还更优选没有可 检测到的DMS；和/或

(ii)小于50ppb，优选小于40ppb，更优选小于30ppb，甚至更优选小 于20ppb，还更优选小于10ppb，甚至更优选小于5ppb，甚至更优选没有 可检测到的SMM。

此外，优选所述植物产品包含的DMSO含量为由野生型大麦植物制备 的类似饮料或植物产品的小于30％，优选小于20％，更优选小于15％，甚至 更优选小于10％。

一方面，本发明的植物产品可以是具有导致功能性MMT完全丧失的突 变的大麦粒。所述植物产品还可以是包含所述麦粒的组合物和由所述麦粒制 备的组合物，以及由所述麦粒制备的其它植物产品。

一方面，本发明的植物产品是通过MMT编码基因具有引起MMT活性 完全丧失的突变的大麦植物的发芽麦粒而制备的麦芽组合物。术语“发芽”应 该理解为浸泡的大麦粒在受控制的环境条件下(例如图8所示)发生的萌芽。

麦粒发芽是受控的浸泡和萌芽，随后对大麦谷粒进行干燥(优选烘干)的 过程。在干燥前，浸泡和萌芽的大麦谷粒被称为“绿色麦芽”，其也可以是本 发明的植物产品。这一作业顺序对于许多酶的合成都很重要，所述这些酶在 主要用以解聚死胚乳细胞的细胞壁并动员麦粒营养的过程中引起谷粒改变。 在干燥过程中，作为化学反应的结果而产生风味和颜色(例如褐色)。虽然麦 芽的主要用途是生产饮料，但是其还可以用在其它工业工艺中，例如作为烘 烤业的酶来源，或者作为食品工业的调味品和着色剂，例如作为麦芽或麦芽 粉，或间接作为麦芽糖浆等。

一方面，本发明涉及产生所述麦芽组合物的方法。所述方法优选包括以 下步骤：

(i)由MMT编码基因具有引起MMT活性完全丧失的突变的大麦植物提 供大麦粒；

(ii)浸泡所述麦粒；

(iii)在预定的条件下使浸泡的麦粒萌芽；

(iv)干燥所述萌芽的麦粒；

从而产生SMM和/或DMS水平低的麦芽组合物。例如可以由Briggs et al. (1981)和Hough et al.(1982)描述的任意方法产生所述麦芽。

然而，适合产生麦芽的任何其它方法也可以用在本发明中，例如用于产 生特色麦芽的方法，包括但不限于焙烧(roasting)麦芽的方法。

有趣的是，DMS是相当易挥发的化合物，沸点为37℃-38℃(Imashuku， 见上文)，并且在麦芽产生过程中，例如在烘干过程中，所述组合物通常被加 热，从而使大量的DMS经蒸发去除。然而，在正常的麦芽组合物冷却过程 中，可以由DMS前体(DMSP)产生更多的DMS。本发明的一个重要优势在于 在麦芽组合物中没有或者仅产生非常少的DMS(参见实施例6，图5A)。

用于降低麦芽中的DMS浓度的方法已有描述。这些方法中的很多依赖 于麦芽的热处理。所述热处理可以是简单地加热麦芽，例如在烘干过程中通 过采用蒸汽而蒸发出游离DMS。因此，麦芽的蒸汽处理可以降低麦芽中游离 DMS的水平。然而，这些方法主要降低了麦芽中游离DMS的水平，但对SMM 的水平仅有较低程度的影响。如上文所述，优选本发明的植物产品，例如麦 芽组合物包含低水平的DMS和SMM。在本发明的一个实施方式中，本发明 的麦芽组合物仅经过包括通过蒸汽挥发并除去游离DMS在内的有限处理， 或者可选地在烘干过程中没有经过包括利用蒸汽挥发并除去游离DMS的处 理。

在本发明的一个实施方式中，优选本发明的麦芽没有用溴酸盐，例如溴 酸钾或溴酸钙处理。

可以通过，例如碾磨，对麦芽进行进一步加工，由此获得经碾磨的麦芽。 因此，本发明的植物产品可以是任何种类的麦芽，例如未加工的麦芽，或者 经碾磨的麦芽，或者其粉末。经碾磨的麦芽和其粉末包含麦芽的化学成分， 包括缺乏再萌芽能力的死细胞。

本发明的麦芽组合物优选包含至多3μg/g，优选至多2μg/g，更优选至 多1μg/g，甚至更优选至多0.5μg/g，例如至多0.2μg/g的游离DMS。此外， 优选本发明的麦芽组合物优选包含至多2μg/g，优选至多1μg/g，更优选至 多0.5μg/g SMM。

在优选方面本发明提供了麦芽组合物，其包含至多200ppb，优选至多 150ppb，更优选至多100ppb，甚至更优选至多50ppb，例如至多25ppb的 游离DMS。此外，还优选本发明的麦芽组合物优选包含至多1000ppb，优选 至多500ppb，更优选至多250ppb，甚至更优选至多100ppb，还更优选至多 50ppb SMM。还优选本发明的麦芽组合物包含至多1000ppb，优选至多500 ppb，更优选至多100ppb ppb，还更优选至多50ppb DMSP。

在另一方面本发明涉及绿色麦芽组合物，其包含至多5000ppb，更优选 至多2500ppb，还更优选至多1000ppb，甚至更优选至多500ppb，还更优 选至多250ppb，例如至多150ppb DMSP。还优选所述绿色麦芽组合物包含 至多200ppb，优选至多150ppb，更优选至多100ppb，甚至更优选至多50 ppb，例如至多25ppb的游离DMS。

另一方面，本发明的植物产品是糖浆，例如大麦糖浆或者大麦芽糖浆。 所述植物产品还可以是大麦或麦芽的提取物。

另一方面，本发明的植物产品是麦芽汁组合物，其由源自MMT基因具 有引起MMT活性完全丧失的突变的大麦粒的麦芽组合物制备(参见实施例 6；图5B)。所述麦芽汁可以仅由MMT无效麦粒制备，或者由还包含其它麦 粒的混合物制备。本发明还涉及利用MMT无效大麦或其部分(单独或与其它 组分混合)制备的麦芽汁组合物。所述麦芽汁组合物可以是第一麦芽汁，和/ 或第二麦芽汁，和/或进一步的麦芽汁。所述麦芽汁组合物可以是甜麦芽汁， 煮沸的麦芽汁或其混合物。通常，麦芽汁组合物包含高水平的氨基氮和可发 酵的碳水化合物，后者主要是麦芽糖。图8中例示说明了由麦芽制备麦芽汁 的常规方法。通常，通过在糖化过程中使麦芽和水一起温育而制备麦芽汁。 在糖化过程中，可向麦芽/水组合物补充其它富含碳水化合物的组合物，例如 大麦、玉米或稻米辅料。已知未发芽的谷类辅料通常包含水平非常低的酶， 为了糖转化和/或产生提取物(包括产生游离氨基氮)，必须补充麦芽或外源酶。

在本发明的一个实施方式中，所述植物产品可以是未发芽的大麦，其可 以例如在糖化过程中用作辅料。

通常，麦芽汁生产工艺的第一个步骤是碾磨麦芽，从而使水可以在糖化 阶段中进入谷粒颗粒中，其中糖化阶段可以被认为是利用底物的酶促解聚作 用的麦粒发芽过程的延续。在糖化过程中，经碾磨的麦芽与液体，例如水一 起温育。温育温度保持恒定(恒温糖化)或者逐渐提高。在优选的实施方式中， 初始的糖化温度不超过70℃，优选不超过69℃，因此，例如初始糖化温度可 以在50℃-69℃的范围，例如55℃-69℃的范围，例如55℃-65℃的范围。如 果初始糖化温度过高，其将影响醪液中的酶活性并可能降低，甚至消除期望 的酶活性，这将导致麦芽汁质量的变化。在任一情况下，在麦粒发芽和糖化 中产生的可溶物质都被释放至所述液体部分中。随后的过滤可分离麦芽汁液 体和残余的固体麦粒(称为用过的谷粒)。所述麦芽汁还可以被称为“第一麦芽 汁”。过滤后，可通过用热水喷射提取获得“第二麦芽汁”。Briggs et al.(1981) 和Hough et al.(1982)描述了适合用于制备麦芽汁的工艺的非限制性实例。

可以将第一麦芽汁、第二麦芽汁和进一步的麦芽汁合并并随后进行煮沸。 未煮沸的麦芽汁(纯的第一麦芽汁或者合并的麦芽汁)也被称为“甜麦芽汁”， 而煮沸之后，可将其称为“煮沸的麦芽汁”。如果麦芽汁将用于生产啤酒，则 通常在煮沸前加入酒花。

还可以通过将MMT无效大麦植物或其部分(例如未发芽的MMT无效植 物或其部分)和一种或多种合适的酶(例如酶组合物或者酶混合组合物，如 Ultraflo或Cereflo(Novozymes))一起温育，而制备麦芽汁组合物。还可以利 用麦芽和未发芽大麦植物或其部分，或者仅未发芽大麦而制备麦芽汁组合物， 任选在所述制备过程中加入一种或多种合适的酶，特别是淀粉酶、葡聚糖酶 (优选(1-4)-和/或(1-3，1-4)-β-葡聚糖酶)，和/或木聚糖酶(例如阿拉伯木聚糖酶)， 和/或蛋白酶，或者包含一种或多种上述酶的酶混合物，例如在所述制备过程 中加入酶混合物Ondea Pro(Novozymes)。

可以将本发明的大麦加入至麦芽醪液中并用作辅料。更具体地，可以在 有或没有外源酿造酶的情况下，将本发明的大麦与麦芽汁以任意组合一起用 于糖化，例如但不限于大麦∶麦芽＝100∶0或75∶25或50∶50或25∶75。

在传统的酿造方法中，将麦芽汁长时间煮沸，通常煮沸60-120分钟，一 个原因是长时间煮沸降低了挥发性DMS的量。然而，出于很多其它原因， 例如长时间煮沸需要大量能量供给，而并不希望长时间煮沸。此外，所述煮 沸可能导致产生不期望的Strecker醛异味。根据本发明，甚至在没有长时间 煮沸的情况下，也可以由MMT无效大麦产生具有低水平DMS的麦芽汁。 因此，根据本发明优选实施方式，麦芽汁煮沸至多45分钟，甚至更优选煮沸 至多30分钟，例如至多15分钟。值得注意的是，即使麦芽汁全面煮沸，仍 然可以随着时间由DMSP产生DMS。有趣的是，本发明的麦芽汁保持低水 平的DMS，其显著低于煮沸常规麦芽汁后获得的水平。

在本发明的其它实施方式中，优选在麦芽汁煮沸后和发酵前没有对麦芽 汁进行二氧化碳洗涤。

优选地，本发明的麦芽汁组合物包含小于30ppb、优选小于25ppb、更 优选小于20ppb、甚至更优选小于15ppb、还更优选小于10ppb、甚至更优 选小于5ppb、还更优选没有可检测到的DMS，和/或小于50ppb、优选小于 40ppb、更优选小于30ppb、甚至更优选小于20ppb、还更优选小于10 ppb、甚至更优选小于5ppb、甚至更优选没有可检测到的SMM。

本发明的植物产品或其部分还可以是包含编码MMT的基因具有引起 MMT活性完全丧失的突变的大麦植物的食物组合物、饲料组合物以及香料 组合物(fragrance raw material composition)。食物组合物可以是，例如但不限 于发芽或未发芽的大麦粒、大麦粉、面包、粥、包含大麦的谷类混合物、保 健品如包含大麦的饮料、大麦糖浆，以及薄片状、碾碎的或挤出的大麦组合 物。饲料组合物包括例如，包含大麦粒和/或粗粉的组合物。下文将对香料组 合物进行描述。

本发明还涉及本文描述的植物产品的混合物。例如，本发明一方面涉及 通过以下物质的混合物制备的组合物：

(i)包含编码MMT的基因具有引起MMT活性完全丧失的突变的大麦植 物或其部分的组合物；和

(ii)由MMT无效麦粒制备的麦芽组合物

在优选的方面，本发明涉及饮料，更优选涉及源自麦芽的饮料，甚至更 优选涉及醇饮料，例如含低水平DMS的啤酒，其中所述饮料是使用MMT 无效大麦或其部分制备的。

因此，在优选的实施方式中，本发明涉及饮料，更优选涉及源自麦芽的 饮料，甚至更优选涉及醇饮料，例如啤酒，所述饮料或啤酒包含：

(i)小于30ppb、优选小于25ppb、更优选小于20ppb、甚至更优选小 于15ppb、还更优选小于10ppb、甚至更优选小于5ppb、还更优选没有可 检测到的DSM；和/或

(ii)小于50ppb、优选小于40ppb、更优选小于30ppb、甚至更优选小 于20ppb、还更优选小于10ppb、甚至更优选小于5ppb、甚至更优选没有 可检测到的SMM。

优选通过发酵MMT无效大麦或其部分或其提取物，例如通过利用由 MMT无效大麦产生的麦芽产生的麦芽汁(单独或与其它成分的组合)进行发 酵而制备所述饮料。

然而，在本发明的其它实施方式中，所述饮料为未发酵的饮料，例如麦 芽汁，优选由MMT无效麦芽制备的麦芽汁。所述饮料可以由未发芽大麦植 物或其部分，优选由未发芽的MMT无效大麦植物或其部分制备，这也包括 在本发明中。

所述饮料可以是无醇饮料，例如无醇啤酒或其它种类的无醇饮料，例如 无醇麦芽饮料，例如无酒精麦芽饮料(maltina)。

然而，优选所述饮料由包含MMT无效大麦粒的麦芽组合物制备。更优 选地，所述饮料是啤酒，其可以是本领域技术人员已知的任何种类的啤酒。 在一个实施方式中，所述啤酒是，例如储藏啤酒。优选使用包含萌芽的MMT 无效大麦的麦芽组合物酿造啤酒。然而，所述麦芽组合物还可以包含其它成 分，例如其它萌芽或未萌芽的谷类，例如野生型大麦、小麦和/或黑麦，或者 包含糖的未萌芽原料或源自发芽或未发芽原料的组合物，包括糖浆组合物。

通常认为DMS可以随时间由包括SMM的DMSP产生。因此，即使饮 料中最初不含或者含有非常少的DMS，DMS也会随时间而累积。然而，本 发明的目的是提供甚至在储藏后也仅含少量或不含DMS的饮料。

因此，本发明的目的是提供源自大麦植物的饮料(例如啤酒)，其在储藏 至少1周、优选至少2周、更优选至少3周、甚至更优选至少4周，例如1-3 个月、如3-6个月、如6-12个月、如大于1年后包含小于30ppb、优选小于 25ppb、更优选小于20ppb、甚至更优选小于15ppb、还更优选小于10ppb、 甚至更优选小于5ppb、还更优选没有可检测到的DSM。进行储藏的温度在 5℃-40℃的范围，例如15℃-40℃的范围。

此外，优选本发明饮料的特征在于优越的味道性质。特别地，优选本发 明的饮料的特征在于比相应的“常规”啤酒更加芬芳(aromatic)和芳香(fragrant) (参见实施例7，图6)。不受理论束缚，本发明提供了低水平DMS和SMM 或者甚至不存在DMS和SMM使芬芳和芳香气味感增强的理论。

优选地，由专业品尝小组确定芬芳和芳香风味。在饮料为啤酒的实施方 式中，测试小组优选由专业的啤酒品尝师组成。在本文中“专业啤酒品尝小组” 也被称为“经过训练的品尝小组”或者“啤酒品尝专家小组”。尽管已知DMS 本身对啤酒的味道性质具有深刻的影响，但一些品尝小组可出现出对多层面 的硫样风味产生不准确评价的倾向。原因仅仅是由于风味感知的差异而导致 小组成员保持不恰当的“标准(calibrated)”。如本文所描述的，通过成立接受全 面培训的至少9位啤酒品尝员的专家小组而使这个复杂的难题得到解决，其 中所述品尝员可熟练地对啤酒的酯、高级醇、硫组分和啤酒主味的味道性质 作出评价。

因此，品尝小组应该由至少9人组成，优选9-20人的范围，例如9-12 人，如10人。每个品尝小组成员应该优选地接受全面的培训，特别是每个 成员都应该熟练地对啤酒的酯、高级醇、硫组分和啤酒主味的味道性质作出 评价。因此，每个品尝小组成员可以按照0-5分的分级对不同的风味韵调进 行评价。所述风味品质优选选自苦味强度、苦味性质、主味、均衡度(balanced)、 新鲜度、可饮性、芳香、酯味、醇味(alcoholic)/溶剂、花味(floral)、啤酒花味 (hoppy)、树脂味(resinous)、麦芽味(malty)、谷粒味(grainy)、焦糖味(caramel)、 烧焦味(burnt)、酚醛味(phenolic)、硫磺味(sulfury)、酸味(acidity)和甜味。

在使用上述方法的过程中，当将两种饮料的酯/醇谱调整为相似并且以相 同方式制备所述饮料时，与具有相似乙醇含量并且由野生型大麦(优选cv. Power)制备的饮料相比，优选本发明的饮料在选自芳香、酯味、醇味/溶剂、 花味和啤酒花味组成的组中至少1个、优选至少2个、甚至更优选至少3个、 还更优选至少4个、甚至更优选全部的芬芳/芳香性质都具有较高分值。

此外，使用上述方法，当将两种饮料的酯/醇谱调整至相似时，与具有相 似乙醇含量并且由野生型大麦(优选cv.Power)制备的饮料相比，优选本发明 的饮料在选自平衡度、新鲜度和可饮性组成的组中至少1个、优选至少2个、 甚至更优选全部三个整体性质都具有较高分值。

使用上述方法，当将两种饮料的酯谱(ester profile)调整至相似时，与具有 相似乙醇含量并且由野生型大麦(优选cv.Power)制备的饮料相比，优选本发 明的饮料在新鲜度和酯味方面的分值高出至少0.1、更优选高出至少0.2或更 多。

在本申请中，当表1提及的12种化合物被调整为类似水平时，即所述饮 料包含相同量±20％的表1所提及的12种化合物时，认为酯/醇谱是相似的(还 可参见实施例7)。如果乙醇含量是相同量±20％，优选相同量±10％，则认为 乙醇含量是相似的。

因此，优选如果调整以下12种化合物(参见表1和实施例7中的列表)的 含量至：

(i)乙醛1.20ppm±20％；

(ii)甲酸乙酯0.24ppm±20％；

(iii)乙酸乙酯23.40ppm±20％；

(iv)乙酸异丁酯0.05ppm±20％；

(v)1-丙醇13.80ppm±20％；

(vi)异丁醇9.60ppm±20％；

(vii)乙酸异戊酯3.43ppm±20％；

(viii)1-丁醇0.23ppm±20％；

(ix)异戊醇52.00ppm±20％；

(x)己酸乙酯0.13ppm±20％；

(xi)乙酸正己酯0.01ppm±20％；

(xii)辛酸乙酯0.33ppm±20％.

则本发明饮料的特征是至少1个，优选至少2个，更优选至少3个，甚 至更优选至少4个，还更优选至少5个，甚至更优选所有以下性质都具有如 下分值(当按照实施例7的描述进行测定时)：

(i)“平衡度”(分值至少2.5，优选至少2.7)；

(ii)“新鲜度”(分值至少2.5，优选至少2.7，更优选至少2.9，还更优选 至少3.1)；

(iii)“可饮性”(分值至少2.5，优选至少2.7，更优选至少2.9，还更优选 至少3.0)；

(iv)“芬芳”(分值至少2.5，优选至少2.7，更优选至少2.9)；

(v)“酯味”(分值至少2.5，优选至少2.7，更优选至少2.9，还更优选至 少3.0)；

(vi)“醇味/溶剂”(分值至少1.5)；

(vii)“花味”(分值至少1.7，优选至少1.9)；

(viii)“啤酒花味”(分值至少1.8)；

更优选在以下性质方面(当按照实施例7的描述进行测定时)：

(i)“新鲜度”(分值至少2.5，优选至少2.7，更优选至少2.9，还更优选至 少3.1)；

(ii)“可饮性”(分值至少2.5，优选至少2.7，更优选至少2.9，还更优选 至少3.0)；

(iii)“芬芳”(分值至少2.5，优选至少2.7，更优选至少2.9)；

(iv)“酯味”(分值至少2.5，优选至少2.7，更优选至少2.9，还更优选至 少3.0)。

因此，优选本发明的饮料具有：

(i)当品尝专家小组以0-5分的分级进行评价时，“新鲜度”分值至少为 2.5；和/或

(ii)当品尝专家小组以0-5分的分级进行评价时，“可饮性”分值至少为 2.5；和/或

(iii)当品尝专家小组以0-5分的分级进行评价时，“芬芳风味”分值至少 为2.5；和/或

(iv)当品尝专家小组以0-5分的分级进行评价时，“酯风味”分值至少为 2.5；

前提是饮料的酯/醇谱如实施例7，表1中加入了混合物1和混合物2的 “MMT无效”列所示。

特别地，本发明公开了饮料中存在的DMS可以掩盖酯味道。因此，本 发明的目的是提供，与以相同方式制备但包含至少100ppb的DMS、例如 100-200ppb范围的DMS的饮料相比，或者与以相同方式制备但包含至少50 ppb的DMS、例如50-100ppb范围的DMS的饮料相比，酯味分值更高的饮 料，其中所述味道是由经过训练的品尝小组评价的，优选由经过训练的至少 9位成员的品尝小组评价。所述酯味道分值更高表示，当按照上述以0-5分 的分级进行测定酯味道时，优选高出至少0.5分，优选高出至少0.7分，如高 出至少0.9分。

本发明还涉及用于生产上述饮料的方法，所述方法优选包括以下步骤：

(i)提供包含萌芽的MMT无效麦粒的麦芽组合物；

(ii)将所述麦芽组合物加工成饮料；

由此获得包含小于30ppb，优选小于25ppb，更优选小于20ppb，甚至 更优选小于15ppb，还更优选小于10ppb，甚至更优选小于5ppb，还更优选 没有可检测到的DMS的饮料。

在一个优选的实施方式中，所述饮料是啤酒。在这种情况下，所述加工 步骤优选包括例如通过上文描述的任何方法由所述麦芽组合物制备麦芽汁， 并发酵所述麦芽汁。

一般来说，可以用发芽和/或未发芽的大麦谷粒制备醇饮料，例如啤酒。 除了酒花和酵母外，麦芽也促成了啤酒的风味和颜色。此外，麦芽还充当可 发酵糖的来源和酶的来源。啤酒生产的一般工艺的示意图示于图8，而用于 发芽和酿酒的方法的详细描述可见于，例如Briggs et al.(1981)和Hough et al. (1982)的文献。可获得多种用于分析大麦、麦芽和啤酒产物的定时更新的方 法。这些方法包括，例如但不限于American Association of Cereal Chemists  (1995)，American Society of Brewing Chemists(1992)，European Brewery  Convention(1998)和Institute of Brewing(1997)。已经认识到特定的啤酒厂使 用了许多带有显著差异的具体过程，这些差异与当地消费者的喜好有关。本 发明可以使用任何此类制造啤酒的方法。

可以通过例如，上文描述的任何方法获取上述饮料，包括例如啤酒、麦 芽饮料或非发酵麦芽汁的麦芽组合物。可以由所述麦芽组合物制备麦芽汁。

从麦芽汁生产啤酒的第一步优选涉及煮沸所述麦芽汁。在煮沸期间，可 以添加其它组分，例如谷类糖浆或酒花，其中酒花组分可以提供典型的苦啤 酒和芳香啤酒特征。煮沸麦芽汁也会导致多酚和变性蛋白质之间形成可在啤 酒生产的后续阶段中沉淀的聚集物。此外，煮沸麦芽汁也会导致包括DMS 在内的可挥发化合物的蒸发。然而，如上文所述，由MMT无效大麦制备的 麦芽汁包含少量或不包含DMS，因此，可显著降低此麦芽汁的煮沸时间。冷 却后，麦芽汁被转移到包含酵母，优选卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis) 种啤酒酵母的发酵罐中。可以将麦芽汁发酵任何适当时间，通常在1-100天 的范围。在持续数天的发酵过程中，糖被转变成醇和CO₂，同时伴随产生一 些香味物质。

随后可以对啤酒进行进一步加工，例如冷却啤酒。也可以过滤和/或贮藏 啤酒，贮藏是产生令人愉快的芳香以及较少酵母(yeasty)味的过程。也可以加 入添加剂。此外，还可以加入CO₂。最后可以在装瓶或装罐前，对啤酒进行 巴氏灭菌或过滤。

有很多方法可用于确定大麦植物产品或植物产品是否由MMT基因具有 引起MMT功能完全丧失的突变的大麦植物制备。植物产品通常会包含至少 一些来自用于生产该植物产品的植物的基因组DNA。因此，麦芽将包含大量 的基因组DNA，但即便是大麦或麦芽提取物(例如麦芽汁)也可以包含来自所 述大麦或麦芽的基因组DNA。此外，基于大麦的饮料，例如啤酒也可包含来 自所述植物的基因组DNA。通过分析植物产品中的DNA，可以确定用于制 备植物产品的植物的MMT基因是否具有引起MMT功能完全丧失的突变。 所述突变可以是，例如上文在“功能性MMT酶的丧失”部分描述的MMT基 因的任何突变。可以通过任何可用的方法，例如通过测序或者通过基于扩增 的方法(包括基于PCR的方法)分析所述基因组DNA。如果假定MMT基因具 有特定突变，则可以采用多态性分析，例如SNP分析。此类分析可以按照下 文实施例13和17的描述而进行。本领域技术人员能够对这些实施例中描述 的具体SNP分析进行适应性改进以用于其它突变或者其它起始材料。

如果上述植物产品仅由MMT基因具有引起MMT功能完全丧失的突变 的大麦植物制备，则大麦MMT mRNA和/或MMT蛋白的存在与否也可以表 明所述植物产品是否由MMT无效大麦制备。因此，可以利用Western印迹 分析，或者其它蛋白分析，或者利用RT-PCR，或者利用Northern印迹分析， 或者利用其它mRNA分析进行植物产品的检测。当所述植物产品为麦芽时， 此类分析特别有用。

SMM和DMS

可以通过任何合适的方法测定植物产品中SMM和DMS的量。SMM可 以基本按照上文中描述了大麦样本中SMM水平测定的“功能性MMT完全丧 失的大麦植物的制备”部分的描述进行测定。因此，可以通过使SMM与化合 物(例如OPA)偶联并通过例如使用UPLC系统测定荧光而测定SMM。对于定 量测定，可以测定与SMM峰对应的色谱面积。

对于更准确的测定，优选利用高分辨毛细管气相色谱对DMS和DMSP (例如SMM)两者的量进行测定，其中后一化合物在活化后作为DMS而测定。 本文将麦芽汁或啤酒样本中的总DMS定义为游离DMS和其前体形式(称为 DMSP)的数量之和。利用该定义，可以以总DMS(在煮沸样本，优选在碱性 条件下煮沸1小时的样本中测定)和游离DMS(在未煮沸样本中测定)之间的 差异测定麦芽汁或啤酒样本中DMSP的量。实施例6详细描述了用于测量总 DMS和游离DMS水平的优选方式。

化学诱变

为了产生本发明的MMT编码基因具有引起MMT活性完全丧失的突变 的大麦植物，可以通过任何合适的诱变方法，例如通过使用大麦粒的化学诱 变(已知随机诱导突变的方法)制备非常大量的大麦突变体。可以利用任何化 学诱变物质进行大麦的诱变。然而，优选利用NaN₃处理谷粒(参见图7)，使 存活的谷粒萌芽，然后分析子代植物。由诱变的谷粒长成植物世代(称为M0) 包含任何给定突变的杂合嵌合体。在自花传粉之后收集的子代植物称为M1 代，在M1代中，给定突变分离至相应的杂合子和纯合子中。

利用NaN₃处理大麦粒不等同于处理单个大麦细胞，原因是处理之后的 谷粒可包含一些未突变的细胞和多种具有DNA突变的细胞。在不产生种系 的细胞谱系中，突变会丢失，因此，目标就是将诱变剂靶向发育为生殖组织 的少数细胞，这有助于M1代的产生。

为了评价总突变效率，可分别计数M0和M1代中的白化(albino)嵌合体 和白化植物。由作为存活植物的函数的计分突变体数量(scoring mutant  number)得出对突变效率的估计，而作为已处理种子的函数的计分突变体数量 提供了突变效率和谷粒死亡二者的组合测定。

值得注意的是，在基因表达的几乎每个步骤，细胞都具有可缓和损害突 变影响的质量保证机制。真核生物中的一个经过深入研究的实例是无义介导 的mRNA降解(称为NMD)，其阻止合成潜在有害的提前截短蛋白(Maquat and  Carmichael，2001；Wu et al.，2007)。在NMD中，通过末位密码子相对于下游 脱稳定元件的位置将其鉴定为翻译提前终止密码子。产生翻译提前终止(无义) 密码子(称为PTC)的突变有时提高了选择性剪接转录本的水平，由此跳过有 害突变，从而潜在地挽救了蛋白的功能(Mendell and Dietz，2001)。

植物育种

农作物发育可以看做是始于引入新特征的长期过程。从植物育种家的观 点看，这一步骤通常产生与现在的市场品种相比，农业性状总体谱图不甚理 想的植物。因此，在本发明的一个优选实施方式中，目的是提供MMT基因 具有引起功能性MMT完全丧失的突变且在农艺学上有用的大麦植物。

除了MMT无效特征之外，在产生商业发芽大麦品种的领域还要考虑其 他因素，包括但不限于麦粒产量、麦粒大小以及与发芽性能或酿造性能相关 的其它参数。因为(即便不是所有)许多此类特征都处于遗传控制下，本发明 还提供了现代的纯合且高产量的大麦栽培品种，其可以通过与MMT无效大 麦植物杂交而制备。此类大麦植物的麦粒提供了没有功能性MMT酶的新原 料。有经验的大麦育种者将能够使本发明的MMT无效大麦植物与其它大麦 植物杂交，随后选择并发展具有产生出众栽培品种的特征的子代。此类子代 也被认为是本发明的一部分。或者，大麦育种者可以利用本发明的植物用于 进一步的诱变，以产生源自MMT无效大麦的新栽培品种。

可以根据任何合适的方案，将本发明的大麦植物用在育种中。

本发明的另一个目的是提供包含MMT无效特征，且在农艺上优良的大 麦植物。因此，本发明还涉及通过使第一亲本大麦植物与第二亲本大麦植物 杂交而产生新的MMT无效大麦植物的方法，其中所述第一或第二植物是 MMT无效大麦。此外，第一和第二亲本大麦植物代表了MMT无效大麦品 种。因此，利用MMT无效大麦品种的任何以下此类方法都是本发明的一部 分：自花授粉、回交和群体杂交等。利用MMT无效大麦品种作为亲代产生 的所有植物都在本发明的范围内，包括由源自MMT无效大麦品种的品种发 展出的那些植物。在将外源DNA引入至MMT无效植物或植物组织并在其 中表达的情况下，MMT无效大麦还可以用于遗传转化。

本发明可以使用回交方法以将突变大麦植物的MMT无效特征引入至另 一个品种，例如另一个栽培品种中，例如cv.Scarlett或cv.Jersey，它们都是 当代高产发芽大麦栽培品种。在标准的回交操作中，将原始目标品种(即轮回 亲本目标植物)与携带单个待转移目标基因的第二品种(非轮回亲本植物)杂 交。随后，将这次杂交产生的MMT无效子代植物与轮回亲本植物杂交，重 复这一过程直至获得这样的大麦植物，即其中除转入了非轮回亲本植物的 MMT无效特征的遗传设置之外，轮回亲本植物的基本所有特有特征都在所 产生的植物中得到恢复。最后，将最后产生的回交植物自交以产生纯合的 MMT无效育种子代植物。

优选在成功的回交过程中具有合适的轮回亲本，回交过程的目的包括将 MMT无效特征引入原始品种。为了完成这一过程，在保留来自原有品种的 基本所有遗传性质的同时，使用来自非轮回亲本植物的MMT无效特征的遗 传设置来修饰轮回品种的遗传设置。虽然当被转移的遗传性质表现显性等位 基因时，回交方法得到简化，但也可回交隐性MMT无效特征。

加快植物育种过程的方法包括通过应用组织培养和再生技术对所产生的 突变体进行初始增殖。因此，本发明另一个方面提供了生长和分化后产生具 有MMT无效特征的大麦植物的细胞。例如，育种可以包括传统杂交、制备 源自可育花药的植物或利用小孢子培养方法。

本发明的实施方式还提供了不仅在MMT编码基因具有引起MMT活性 完全丧失的突变，而且还具有一个或多个其它有用的突变的大麦植物。此类 额外的突变可以包括，例如在编码脂氧合酶-1(LOX-1)的大麦基因中的突变， 例如引起LOX-1活性水平降低的突变(例如Douma，A.C.等人的美国专利No. 6,660,915中描述的突变)，或者引起LOX-1功能完全丧失的突变，例如 Breddam，K.等人的美国专利No.7,420,105或PCT专利申请WO 2005/087934 中公开的任何突变体，特别是Breddam.K.等人的美国专利No.7,420,105中 的包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6所示的编码LOX-1基因的基因组序列 的突变体。

如上述专利和专利申请中的描述，LOX-1无效麦芽本身可提供用于在大 麦的发芽过程中低温烘干的原料。然而，组合的LOX-1无效-MMT无效双突 变体更为优异，并且由于LOX-1和MMT活性均被失活，而酿造业中特别有 用。可以通过将本发明的大麦植物与Breddam，K.等人的美国专利No. 7,420,105或PCT专利申请WO 2005/087934描述的大麦植物杂交而获得此类 大麦植物。

实施例

本文的实施例部分例示说明了本发明的优选实施方式，但不应被认为是 对本发明的限制。

除非另有说明，否则用于操作核酸、蛋白和细菌的基本分子生物学技术 均按照Sambrook and Russel(2001)中的描述进行。

实施例1

DMS掩盖了啤酒的酯味

通常被认为难以表征硫样风味韵调，即便是在常规啤酒品尝小组成员中 也是如此。通常，啤酒品尝小组成员使用专业术语“硫味”来表征硫味韵调， 而不使用更具体的硫味评论，例如“硫醇”、“硫化氢”和“DMS”。

在成立9人品尝小组后，对成员进行有关于追踪含硫组分气味的全面培 训，意外地发现加入硫组分强列地影响其它气味组分的感知，这是导致例如 酯味和啤酒主味分值较低的性质。

在另一套试验中，选择DMS用于培训品尝小组。为品尝小组提供掺有 高浓度的所述含硫组分的啤酒样本，要求小组成员品尝并以0(无)至5分(极 度)的分级对“主味”、“酯味”和“DMS”特征进行分级。每轮测试都包括标准的 市售啤酒和品尝小组成员未知的两个样本。

在图1B中例示了来自包括分别掺有酯和酯/DMS的啤酒样本的系列测试 的平均分值结果。意外的结果是，与通过仅掺有酯所获得的结果相比，当与 酯组合时DMS的添加对所感知的酯味分值产生不利的影响。同样地，啤酒 主味评分下降。意料之中的是，DMS的掺入增强了该性质的分值。

上述结果证明，专业化品尝小组品尝单个风味组分的能力表现为高度依 赖于由其它气味组分决定的“风味背景”。

图1B中概括的来自所述品尝测试的意外发现也为本发明提供了基础， 通过提供具有低水平DMS的饮料和可用于制备此种饮料的大麦突变体(即缺 乏SMM合成能力的大麦突变体)，这样，在饮料生产中利用相应原料不仅能 够产生含较少或不含DMS的产品，还有望于改善酯味韵调。

实施例2

筛选设置，方案1

按照Kleinhofs et al.(1978)提供的试验详述，将从cv.Prestige和cv. Sebastian大麦植物收集的麦粒分别与诱变剂NaN₃一起温育。选择此方法的 原因是已知其具有在大麦基因组DNA中诱导点突变的潜能。

在该实验中，在试验点繁殖M1代的突变谷粒，通过连续两代，最后产 生高比例的M3代纯合植物以用于筛选目的。预期M3代突变体包含基因突 变的频率为0.9-2.3/10,000个谷粒(Kleinhofs et al.，见上文)。值得注意的是， M2谷粒未经筛选。

有趣的是，本发明描述了用于检测缺乏MMT活性的M3突变大麦谷粒 的高通量的快速筛选方法，前提是在发芽过程中没有可检测到的SMM合成。 因此，申请人发现SMM主要聚集在萌芽大麦的胚芽鞘和初生叶中，并且可 以通过从4日龄的萌芽谷粒的压碎叶组织提取氨基酸，随后使所提取的氨基 酸与OPA反应已形成高荧光产物，而进行SMM的检测(参见图2)。

实际上，各实验在具有一张Whatman#1滤纸(296×20.9mm)的密闭塑料 盒中进行，其中使来自94种潜在突变体和两种野生型植物中每种植物的各两 粒谷粒萌芽。对多个潜在突变谷粒重复实验(参见下文)。在萌芽开始时，向 所述塑料盒中加入25mL自来水，然后在萌芽的第2天加入额外的15mL自 来水。在萌芽4天后，将1-3cm叶组织转移至储藏板(ABgene)中，其中在该 储藏板的96个1.2mL孔中都分别含有直径为5mm的玻璃珠和500μL 12∶5∶6 (v/v/v)的水∶甲醇∶氯仿混合物。然后以30Hz的频率在MM 300实验磨(Retsch) 中振荡45秒。此后，将平板转移至离心机(Rotanta 460R，Hettich)中，并以4,000 rpm在室温下离心15分钟以沉淀不溶物质。将10μL上清转移至96孔储藏 板(Waters，cat no.186002481)中，并与200μL H₂O和包含15,000∶45(v/v)的 OPA试剂(Sigma，cat.no.P7914)：3-巯基丙酸(Aldrich，cat.no.M5801)的60μL 反应溶液混合。将混合物在4℃温育至少10分钟以获得样本氨基酸和OPA 的定量衍生。利用装配有荧光检测仪的基于Waters的UPLC系统，通过混合 流动相A(调整至pH 7.8的40mM NaH₂PO₄缓冲液)和移动相B[乙腈∶甲醇∶ 水为45∶45∶10(v∶v∶v)的溶液，如(Phenomenex，2006)的描述]，以梯度洗脱在 3-μm颗粒的2.1×30-mm C18 Gemini柱(Phenomenex，cat.no.00A-4439-80)上 分离出2μL衍生的混合物。在340nm激发所洗脱的OPA衍生物，并测定 450nm的光发射。图3A显示了色谱图的示例，以例示说明天冬氨酸(Asp)、 谷氨酸(Glu)、天冬酰胺(Asn)、丝氨酸(Ser)和SMM的洗脱谱。由于整个试验 计划的目的是鉴定缺乏SMM合成能力的大麦植物，即相应的色谱峰非常小 或者优选没有相应的色谱峰的植物，因此将化合物SMM包含在内。

筛选设置，方案2

与本实施例中的上述试验平行，尝试建立用于鉴定缺乏活性MMT酶的 大麦苗的非常快速的筛选方法。基于以下事实，即如果所述植物包含用于转 化亚硒酸钠的活性MMT，那么所述麦苗可以在存在250μM亚硒酸钠的条件 下生长，设计了筛选方案，以对所述浓度的亚硒酸钠存在下生长下降的麦苗 进行目测评分。实际上，将NaN₃-诱变的M3代大麦cv.Prestige的22,704个 穗(各由20-30个麦粒组成)置于装有补充了250μM亚硒酸钠的标准 Vermeculite生长培养基的塑料盘中。使所述穗的麦粒萌芽并发育成约15cm 长的麦苗。将特征为生长下降(即麦苗长度＜15cm)的总计812株植物转移到 新鲜土壤中并使其进一步发育。然而，通过与野生型SMM水平相比确定， 发现所述植物都不具有降低的MMT活性。因此，上述筛选方法没有产生突 变体，并因此终止。

实施例3

潜在突变

对总数分别为10,248和3,858个的NaN₃-诱变的大麦cv.Prestige和cv. Sebastian的麦粒的SMM含量进行筛查(参见实施例2中的方案1)，目的是鉴 定所述SMM含量比与野生型谷粒大幅减少的那些大麦。仅鉴定出两个M3 代的潜在突变体，即样本号为8,063的谷粒(源自cv.Prestige并在下文称为突 变体8063，该命名也用于其子代的谷粒，图3B)和样本号为14,018的谷粒(源 自cv.Sebastian并在下文称为突变体14018，该命名也用于其子代的谷粒，图 3B)。将每个突变体的谷粒繁育至M4代，然后收获并最后进行再分析。结果 证明突变体8063和突变体14018的谷粒的SMM含量极低，可能完全丧失了 SMM。

在独立的试验中，利用Western印迹分析证明突变体8063和突变体14018 缺乏MMT酶。使突变体和相应野生型植物的谷粒在浸泡在水中的滤纸上避 光萌芽4天。将每个样本的一个谷粒转移至含有250μL H₂O的Eppendorf管 中，并利用雌蕊(pistil)匀质。以13,000rpm离心10分钟后，将15μL液体提 取物与5μL标准的4倍浓缩的SDS样本缓冲液混合。通过使用与实施例12 中描述的相同的免疫方法和与所述实施例中详述的相同的抗-MMT抗体试 样，根据大小通过电泳使上述萌芽麦粒的样本提取物的蛋白分离，并应用于 Western印迹分析。注意到突变体8063和突变体14018的按大小分离的提取 物不存在对应于MMT的120-kDa蛋白染色条带。然而，在萌芽的野生型麦 粒的提取物中清楚地看到120-kDa蛋白条带(图3C)。结合突变体8063和突 变体14018的提取物中不存在SMM，但野生型麦粒的提取物中存在SMM的 Western印迹分析结果(图3B)，证明了突变体8063和突变体14018代表与 MMT特征相关的无效突变体。

实施例4

突变体8063的MMT活性测定

MMT酶催化甲基基团从SAM转移至Met，形成SMM(参见图1B)。利 用其中的甲基基团带有氚标记的[³H]SAM作为底物，可以在利用活性炭除去 剩余的[³H]SAM后，通过闪烁计数监测所述甲基基团的转移。活性炭化合物 与底物结合但不与新合成的标记产物SMM结合(Pimenta et al.，1995)，从而允 许对MMT活性和SMM含量进行测定，按照实施例2的描述，测定突变体 8063和cv.Prestige的各15个芽提取物中的SMM含量(图4)。数据测定证明 了在野生型麦粒中MMT催化SMM的形成，而在突变体8063的谷粒中不存 在这个性质。

实施例5

突变体8063的MMT无效麦粒的中试规模发芽和酿造

对突变体8063的麦芽和cv.Power的对照麦芽进行的发芽和酿造分析包 括以下步骤：

(i)萌芽，包括浸泡以产生绿色麦芽，有时随后进行烘干以获烘干麦芽；

(ii)制备麦芽汁；

(iii)分离麦芽汁；

(iv)煮沸麦芽汁；

(v)利用卡尔酵母发酵麦芽汁；

(vi)储藏啤酒；

(vii)过滤淡色啤酒(bright beer)；

(viii)啤酒装瓶。

对于突变体8063和cv.Power(对照样本)，均使用30kg麦芽用于酿造。 碾磨麦芽样本，然后向每个样本中加入自来水至150L。在60℃的温度糖化 (Mashing-in)20分钟，然后5分钟升温至65℃，在该温度下持续温育55分 钟。然后使醪液在15分钟升温至78℃，在5分钟温育后结束糖化。

随后的酿造工序包括过滤麦芽汁，1小时的煮沸步骤和在旋涡中分离。 根据标准酿造操作的说明，例如Briggs et al.(1981)和Hough et al.(1982)的描 述，进行7天发酵、储藏并将成品啤酒装入绿色玻璃瓶中。制备了总计100 瓶(33-cL)源自野生型麦芽和突变麦芽的啤酒。

实施例6

MMT无效麦芽制备的啤酒中的DMS和DMSP水平

按照实施例5的描述，由MMT无效的麦芽和cv.Power的麦芽酿造啤酒。 在发芽和酿造过程中，测定绿色麦芽和烘干麦芽(图5A)以及相应的甜麦芽汁 和煮沸麦芽汁中，以及成品啤酒中(图5B)中的游离DMS和DMSP的水平。

基本按照Hysert et al.(1980)的描述，利用通过静态顶空气相色谱在350B 硫化学发光检测器(Sievers)上，通过硫特异性检测法来测定DMS和DMSP 的水平。利用自动设备(HS-40 Automated Headspace Sampler，Perkin Elmer)进 行取样。通过将各样本在碱性条件下煮沸1小时获得DMS的总水平，即麦 芽汁，以及绿色麦芽和烘干麦芽的提取物中的游离DMS和DMSP之和。然 后对样本进行顶空分析以确定DMS水平。如上文所述，将煮沸样本中的总 DMS水平与相应的未煮沸样本中游离DMS之间的差异定义为等于样本 DMSP的量。基本按照在麦芽汁中的程序(Hysert et al.，见上文)测定啤酒中的 游离DMS量。

实施例7

品尝用MMT无效麦芽酿造的啤酒

为了确定专业啤酒品尝小组如何评价用MMT无效麦芽酿造的中试规模 产生的啤酒，对经测定包含4ppb DMS的啤酒进行层次品尝(profile tasting)。 利用76ppb DMS的常规啤酒作为对照，这种啤酒是利用cv.Power的麦芽生 产的。

在品尝分析之前，通过气相色谱分析获得啤酒酯和高级醇的谱图。在所 分析的12个化合物中，MMT无效麦芽的啤酒中有3个化合物具有较低的水 平(表1)。在第一品尝测试中，将由乙酸乙酯、乙酸异戊酯和辛酸乙酯组成的 混合物1掺入至用MMT无效麦芽酿造的啤酒中，以确保两种储藏啤酒中这 些促成标准酯谱的风味活性化合物的水平相似(参见表1)。第二测试的目的是 制备具有增强的风味韵调的高酯啤酒。因此，将由乙酸异戊酯、己酸乙酯和 辛酸乙酯组成的混合物2掺入到cv.Power麦芽的啤酒中(表1)，而向MMT 无效麦芽的啤酒中掺入混合物1和混合物2。

然后由经培训的10人品尝小组对上述啤酒进行检测，评价了20个具体 的风味特征，每个风味特征都分成0-5分的级别(图6)。

如图6A中对高酯啤酒的详述，与掺至相同水平的标准啤酒相比，对由 MMT无效麦芽酿造的“DMS非常低的啤酒”中芬芳-芳香风味的感知具有显 著作用。对所评价的所有芬芳-芳香风味都记录了较高的分值。即使在经掺入 达到正常酯谱的MMT无效麦芽的啤酒中(图6B)，也记录到对芬芳-芳香风味 的感知增强，这再次表明低水平DMS对芬芳啤酒化合物的感知具有积极作 用。对这种现象的简单解释是啤酒中的DMS掩盖了令人愉快的芬芳-芳香风 味的味道，而这种味道代表了在评价饮料新鲜度时的重要因素。

表1：啤酒的酯和醇分析

风味化合物的浓度

^*2-甲基-丁基乙酸酯和乙酸异戊酯浓度之和。

^**2-甲基-1-丁醇和异戊醇浓度之和。

实施例8

大麦cv.Prestige中编码MMT的基因的序列测定

为了确定导致野生型大麦植物和突变大麦植物之间MMT活性差异的遗 传多样性，在跨越相应大麦基因的起始密码子和终止密码子的DNA序列测 定中进行了大量工作。为了确定此前未知的大麦MMT基因的基因组序列， 第一步是按照植物DNA提取试剂盒(Roche，cat.no.1667319)供应商提供的说 明书，从6日龄cv.Prestige大麦苗的叶中纯化基因组DNA(gDNA)。

随后，设计寡核苷酸引物以与编码MMT的cDNA序列(GenBank登陆 号AB028870；SEQ ID NO：1)结合。以大麦gDNA作为模板，利用6组不同的 引物对进行标准PCR扩增，所述引物对的DNA序列列于表2中。发现所述 引物成对地在外显子1(包括翻译起始密码子和其下游)和2，外显子2和4， 外显子4和5，外显子5和9，外显子9和11以及外显子11和12(包括翻译 终止密码子和其上游)中退火。上述6个反应中有5个产生了跨越外显子2-4、 外显子4-5、外显子5-9、外显子9-11和外显子11-12的DNA片段(参见图 9)。还有设计了一个反应，其产生跨越翻译起始密码子和外显子2的DNA 片段(即与表2和图9中所列引物对1的反应)，但仅观察到反应人工产物 (reaction artifact)。虽然造成这个难点的原因仍不清楚，但目的基因片段中显 著高含量的G和C碱基可能是造成正确序列扩增失败的原因。因此，采用了 声称有助于扩增富含G-C基因区域的多个市售PCR反应补充物，以尝试扩 增编码MMT的大麦基因的起始密码子下游且仍包含该起始密码子的DNA 片段。尽管尝试多次，但利用gDNA模板的所有尝试都没能在表2所列的反 应1中通过引物扩增出特异性片段。

除了利用gDNA的扩增试验，还研究了大麦苗叶的源自RNA的cDNA 是否可能构成用于扩增MMT基因的难点外显子1序列的功能性模板。因此， 采用FastRNA ProGreen试剂盒(Q-BIOgene，cat.no.6045-050)的组分和使用说 明，从4日龄cv.Prestige大麦苗的嫩叶提取并纯化总RNA。按照OneStep  RT-PCR试剂盒(Qiagen，cat.no.210212)使用说明书的详述，将其等分试样用 在8×2个标准的RT-PCR反应中(即8种引物对组合(表3)，每个组合使用两 个反应缓冲液]。在1％琼脂糖凝胶上分离片段，随后的分析表明只有利用所 述试剂盒的缓冲液1才能获得反应产物。然后利用QiaexII凝胶提取试剂盒 (Qiagen，cat.no.20051)纯化目标DNA条带。在上述RT-PCR试剂盒的Q-溶液 存在下，利用引物对7、10和11(参见表3)进行单独的RT-PCR扩增。在这 种情况下，也纯化出了目标DNA片段。将各个DNA片段插入至载体 pCR2.1-TOPO(Invitrogen，cat.no.K4500-01)中，并用构建体转染大肠杆菌细 胞之后，测定质粒插入物的相应DNA序列。

综上所述，合并上述工作的成果拼接出了跨越cv.Prestige大麦MMT基 因的翻译起始密码子和终止密码子的基因组序列(SEQ ID NO：3)。通过比对 cDNA和基因组序列(即比对SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：1)，确定如图9例 示的大麦MMT基因包含被11个内含子(共3192bp)分隔的12个外显子(总共 3267bp)。由此衍生的cv.Prestige的MMT氨基酸序列示于图10，并且表示 为SEQ ID NO：6。在上述衍生的cv.Prestige的MMT氨基酸序列中，除了 Pro157→Ala和Met985→Tyr外，与cv.Haruna Nijo的序列(GenBank登录号 AB028870；SEQ ID NO：2)的比较表明完全相同(图11)。

表2：用于扩增编码大麦MMT的基因组序列的引物

^*)MMT的基因组序列的碱基对编号(SEQ ID NO：3；另参见图9)。

^**)标记为“PCR产物末端”的列中所列的片段的5′端的序列。

^***)标记为“PCR产物末端”的列中所列的片段3′端的互补序列。

表3：用于扩增编码大麦MMT的cDNA序列的引物

^*)MMT的基因组序列的碱基对编号(SEQ ID NO：3)。

^**)标记为“PCR产物末端”的列中所列的片段5′末端的序列。

^***)标记为“RT-PCR产物末端”的列中所列的片段3′末端的互补序列。

实施例9

大麦突变体8063的MMT编码基因在内含子5的5′剪接位点发生突变

突变体8063的大麦苗中的SMM含量极低或者不存在(实施例3)，这与 MMT活性的缺乏相一致(实施例4)。基于该发现，研究MMT编码基因中的碱 基取代是否是由NaN₃诱变剂对大麦麦粒进行初步处理而引起的。因此，为了 建立突变体8063的MMT无效表型的分子基础，尝试扩增、克隆突变体8063 的所述基因并测序。

利用6个引物对扩增cv.Prestige的野生型MMT基因的核苷酸序列(表2； 详述于实施例8)，对大麦突变体8063进行类似的方法。简而言之，从所述 突变体提取基因组DNA，然后将其MMT基因特异性的扩增片段插入至载体 pCR2.1-TOPO(Invitrogen，cat.no.K4500-01)中，克隆、测序、连接(SEQ ID  NO：8)，最后与野生型大麦的结果进行比较。在MMT基因的蛋白编码部分内 没有鉴定出突变。然而，通过比较突变基因和野生型基因的内含子序列，发 现内含子5的第一碱基(SEQ ID NO：8的第3076位核苷酸)具有G→A的碱基 转换。所述碱基是内含子5的5′剪接位点的一部分，并且将影响所述基因的 初始RNA加工，即RNA剪接(Sinibaldi and Mettler，1992；另参见图12)。

为了评价碱基突变可在扰乱突变体8063的MMT编码基因的正常基因剪 接中发挥的作用，对源自突变体的RNA进行详细分析以检测剪接中间体。 选择该方法的原因是内含子的5′GT二核苷酸中的变化可能导致剪接中间体 的聚集(Lal et al.，1999)。

为了扩增目的片段，根据RT-PCR试剂盒(OneStep RT-PCR from Qiagen， cat.no.210212)提供的使用推荐进行分析。使用按照实施例8中的描述从cv. Prestige和突变体8063的4日龄麦苗嫩叶纯化的1μg总RNA作为模板。利用引 物对15(表4)，设计RT-PCR反应以扩增跨越野生型Prestige和突变体8063的 MMT转录本的外显子3和外显子7的基因区(图12A)。扩增后，通过在1％琼脂 糖凝胶上电泳分离反应产物(图12B)。

对扩增产物的检测表明，利用野生型RNA的反应仅产生单个条带(图 12B)。将该条带从凝胶切出，利用QiaexII试剂盒(Qiagen，cat.no.20051)的组 分纯化，并插入到载体pCR2.1-TOPO(Invitrogen，cat.no.K4500-01)中，克隆 并测序。分析证明了存在882-bp的片段(图12B、图12C的产物1；SEQ ID  NO：9)，该条带的特征是序列与野生型大麦MMT的全长cDNA的跨越碱基 442-1323的序列(SEQ ID NO：4)相同。基于该发现，认为选择性剪接与野生 型基因的表达无关。

除了采用从突变体8063纯化的模板RNA外，与前段描述相同的RT-PCR 反应产生了3个特异性DNA片段，在图12B中被称为产物2、产物3和产 物4，其长度均与利用野生型RNA扩增的产物1不同(图12B)。因此，在突 变体8063的MMT基因的内含子5的5′剪接位点中的单个碱基突变阻碍了前 mRNA的加工。这种情况完全消除了所述5′剪接位点的使用，但激活了隐藏 的其它剪接位点的使用。

在揭示在突变体8063中获得上述3个PCR片段的潜在分子原因的工作 中，利用上文实施例8中描述的用于cv.Prestige的源自PCR的DNA条带的 方法，制备各个PCR片段用于DNA测序。最大片段的长度为1089bp(图12C 中的产物2；SEQ ID NO：10)，并且发现包括完整的内含子5，而产物3(图 12C；SEQ ID NO：12)和产物4(图12C；SEQ ID NO：14)的长度分别为955bp 和810bp，因此比来自野生型RNA(参见上文)的882-bp的片段短。产物3 的DNA序列分析揭示了在内含子5中间的隐藏剪接位点，然而产物4的隐 藏剪接位点在外显子5中(图12D)。

DNA序列分析的另一个重要发现在于，发现产物2中的翻译提前终止密 码子[根据大麦cv.Prestige的基因组DNA(SEQ ID NO：3)的碱基编号为第 3088-3090位的TGA]、产物3中的翻译提前终止密码子[根据大麦cv.Prestige 的基因组DNA(SEQ ID NO：3)的碱基编号为第3088-3090位的TGA]和产物4 中的翻译提前终止密码子[根据大麦cv.Prestige的基因组DNA(SEQ ID NO：3) 的碱基编号为第3289-3291位的TGA]分别产生长度为315、315和289个氨 基酸的翻译蛋白。图12C提供了产物1、产物2、产物3和产物4的测序结 果的图示比较和概括，而图12D和图12E中的图示提供了参与选择性剪接事 件的具体碱基的具体数据。

表4.用于检测大麦MMT编码基因的选择性剪接的引物

用于使用突变体8063的RNA模板的RT-PCR。

用于使用突变体14018的RNA模板的RT-PCR。

^*)MMT的cDNA(SEQ ID NO：4)的碱基对编号。

^**)标记为“PCR产物末端”的列中所列的片段的5′末端的序列。

^***)标记为“PCR产物末端”的列中所列的片段的3′末端的互补序列。

实施例10

编码野生型MMT的表达质粒

由于以下两个发现，在大肠杆菌中异源表达突变的或截短的大麦MMT 产生了模仿酶促活性或者验证其缺乏酶促活性的新方法：

(i)大肠杆菌细胞缺乏MMT和合成SMM的能力(Thanbicher et al.， 1998)；

(ii)可以在大肠杆菌中合成植物MMT(Tagamount et al.，2002)。 由于来自大肠杆菌的重组野生型大麦MMT可作为此试验的阳性对照，任务 是设计并构建用于异源表达大麦MMT的大肠杆菌表达质粒。

为了扩增相关序列，首先从cv.Prestige的4日龄苗的嫩叶提取总RNA(按 照实施例9的详述)，并利用1μg所提取的总RNA作为标准RT-PCR反应的 模板，但向反应混合物中加入引物对17(表5)。将扩增产物插入到载体 pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中，产生质粒pCR2.1-TOPO-MMT。在质粒克隆之 后，对完整的插入物进行测序(SEQ ID NO：5)，并与cv.Prestige的序列(SEQ ID  NO：4)进行比较。在克隆产物中鉴定出3个PCR引起的核苷酸差异 (T1310→A，T2954→C和G3031→A)，产生MMT氨基酸的取代Leu437→His、 Tyr985→Met和Gly1011→Ser(通过比较SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7而确 定)。认为这些氨基酸变化都不会以与本申请相关的方式危害重组MMT的作 用。该结论基于所表达的蛋白具有活性且能够被抗-MMT抗体识别的发现(参 见实施例12)。

随后，利用NdeI-EcoRI切割pCR2.1-TOPO-MMT，产生569-bp的 NdeI-EcoRI 5′片段和2699-bp的3′-EcoRI片段。将所述5′片段插入到 NdeI-EcoRI-线性化表达载体pET19b(Novagen，cat.no.69677-3)中，并在所产 生的质粒的EcoRI位点中插入上述2699-bp 3′片段，由此产生表达质粒 pET19b-MMT(图13A)。该表达质粒编码与N-末端His标签 (MGHHHHHHHHHH；SEQ ID NO：69)和肠激酶位点(SSGHIDDDDKH；SEQ  ID NO：70)相连的MMT。

表5.用于扩增大麦MMT基因的蛋白编码序列的引物

^*)MMT的cDNA(SEQ ID NO：5)的碱基对编号，即不包括分别为起始密码子和终止密码 子的上游和下游的序列延伸CAT和AATTC。

^**)如引物对限定的，在标记为“RT-PCR产物末端”的列中列出的片段的5′末端，NdeI位 点用下划线表示；翻译起始密码子用双下划线表示。

^***)标记为“RT-PCR产物末端”的列中列出的片段的3′末端的互补序列。EcoRI位点用下 划线表示；包括EcoRI位点部分在内的翻译终止密码子用斜体字表示。

实施例11

编码突变体8063的截短MMT的表达质粒

在实施例9中，显示突变体8063的MMT编码基因在内含子5的5′剪接 位点包含G→A碱基转换，由此活化两个隐藏的剪接位点，导致表达出各自 包含翻译提前终止密码子的三个异常转录本(参见图12B、C)。

为了证明突变转录本编码无功能的MMT，按照下文所述，扩增每个相 应的开放阅读框并插入至大肠杆菌表达载体中。应注意，两个选择性剪接的 转录本，特别是产物2和产物3给出的那些转录本(图12B)编码相同的蛋白。 因此，仅两个表达质粒足以确定大麦突变体8063的异常剪接基因是否编码功 能性MMT酶。

已知突变体8063中隐藏剪接产物的序列(参见图12D)使从表达质粒 pET19b-MMT扩增相关基因部分成为可能，表达质粒pET19b-MMT的构建 详述于实施例10中。利用表6中列出的引物对18扩增基因的3′部分(产物2 的SacII-BamHI片段(SEQ ID NO：27)和产物3的SacII-BamHI片段(SEQ ID  NO：28))。随后使这些序列与pET19b-MMT的相应片段交换(参见图13A)，产 生表达质粒pET19b-Line8063-Prod2(图13B)和pET19b-Line8063-Prod3(图 13C)。利用引物对19进行平行反应(表6)，以产生表达质粒 pET19b-Line8063-Prod4(图13D；SEQ ID NO：29列出了用于克隆的产物4的 序列)，经设计用于合成与产物4相关的相应截短MMT(参见图12B)。

图13E提供了野生型MMT和由突变体8063编码的截短产物的详细的氨 基酸序列比较。

表6.用于扩增突变体8063的DNA片段的引物(用于质粒构建)

^*)数字表示相邻列所示的相应SEQ ID NO的核苷酸编号。

^**)单个下划线分别用以表示正向引物和反向引物中的SacII和BamHI位点。双下划线表 示终止密码子。

实施例12

突变体8063的重组MMT形式没有活性

为了证明突变体8063的MMT缺失形式在酶学上是没有活性的，分别用 质粒pET19b、pET19b-MMT、pET19b-Line8063-Prod3和 pET19b-Line8063-Prod4(参见图13)转化大肠杆菌株BL21的细胞，然后在含 氨苄青霉素的5mL标准Luria Broth(LB)培养基中增殖过夜。将各培养物的 1.25-mL试样加入至100mL新鲜LB中，并在37℃温育直至细胞密度达OD₆₀₀＝0.6。此时，加入40μL 1M IPTG以诱导异源蛋白的表达。在20℃过夜温育 后，通过在4℃以4,000rpm离心20分钟，沉淀各个培养物的细胞。将各细 胞沉淀重悬在5mL H₂O中，然后进行数次冻融循环，并最后在～750单位/L 核酸酶(Sigma，cat.no.E8263-25KU)存在下在37℃温育30分钟，以降低样本 的粘度。在4℃以4,000rpm离心30分钟以将不溶性蛋白(定义为沉淀中的蛋 白)与细胞可溶性蛋白(定义为液体相中的蛋白)分离后，通过将沉淀重悬在含 1mg溶菌酶的2mL H₂O中进一步洗涤沉淀。在室温温育5分钟后，通过加 入15mL H₂O稀释样本。进行三次类似的洗涤-沉淀循环，随后使用含7M 尿素、2mM β-巯基乙醇的1mL 50-mM Tris-Cl缓冲液(pH 8.0)提取沉淀内包 涵体中的蛋白。

为了测定MMT活性，将含细胞可溶性蛋白(如上文的定义)的50μL样本 转移到包含0.4mM AdoMet、10mM Met、1mM DTT、0.1mg/mL BSA的250 μL 25-mM K-磷酸盐缓冲液(pH 6.0)中。在50℃温育1小时后，过滤样本并按 照实施例2的详述使10-μL试样与OPA反应。然后，如实施例2的描述对 SMM水平进行分析，结果总结在图14A中。只有来自用pET19b-MMT转化 的细胞的提取物产生了与SMM标准品相同保留时间的色谱峰。因此，由 pET19b-Line8063-Prod3和pET19b-Line8063-Prod4转化的细胞的色谱图中不 存在类似峰则表明突变体8063缺乏产生活性MMT的能力。

以下独立试验的目的在于证明突变体8063缺乏产生全长且具有活性的 MMT的能力。通过标准的电泳分离上述大肠杆菌提取物的5-μL细胞可溶性 蛋白样本和10-μL源自沉淀的蛋白样本，并用针对大麦MMT的长15个残基 的肽抗原的兔多克隆抗MMT抗体进行检测[参见图13E(用星号标记的序列 段)；亲和纯化的12mL多克隆抗MMT抗体制剂购自Invitrogen(方案号 L0402801K；动物号C7511)，并以1∶1000的稀释度用在标准Western印迹分 析中(图14B、C)]。

具体地，将上述蛋白上样至10％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上并通过在150 V电泳75分钟而分离，之后通过以2.5mAmp/cm²(最高25V)运行的电转印 装置(Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell，BioRad)将蛋白转移至聚偏二氟乙 烯膜(Immobilon-P，Millipore)上。将转移印迹在封闭缓冲液[1×磷酸缓冲盐 (PBS)，1％BSA]中于25℃静置1小时。除去缓冲溶液，并将膜在抗MMT抗 体溶液中静置1小时。然后，利用1×PBS洗涤膜，并在山羊抗兔IgG碱性磷 酸酶(Sigma)溶液中温育1小时。在上述温育后，在1×TBS中洗涤膜，然后 在利用氮蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(Sigma)温育后使蛋白条带可视 化。最后在水中洗涤凝胶以终止磷酸酶反应。

按照上文的描述，抗MMT抗体制剂用于检测由pET19b-MMT(图14B、 C；标记为“2”的泳道)、pET19b-Line8063-Prod3(图14B、C；标记为“3”的泳 道)、pET19b-Line8063-Prod4(图14B、C；标记为“4”的泳道)和pET19b(图 14B、C；标记为“5”的泳道)转化的大肠杆菌细胞的细胞可溶性蛋白印迹和源 自沉淀的蛋白印迹。尽管细胞可溶性蛋白和源自沉淀的蛋白的整体条带图具 有差异(后者呈现为从凝胶上部开始并向下延伸至凝胶底部的蛋白条带拖 尾)，全长MMT被识别为是在pET19b-MMT转化的细胞的提取物中与 120-kDa标准蛋白共同迁移的蛋白条带(标记为“1”的泳道)。预期用 pET19b-Line8063-Prod3和pET19b-Line8063-Prod4转化的细胞中MMT蛋白 的无活性形式对应于30kDa和40kDa之间的印迹区内深度染色的条带。应 注意，所染色的80-kDa蛋白条带不是源自MMT的，原因是其还出现在用载 体pET19b转化的阴性对照细胞的提取物中。

根据利用如上文所述并经设计用以产生野生型大麦和突变体8063的重 组MMT形式的异源表达MMT形式的试验结果，推断只有野生型MMT具 有活性，而所述突变体中的MMT形式没有活性。因此，与突变体8063相反， 催化Met转化为DMS前体SMM的能力仅限于野生型大麦。

实施例13

大麦突变体8063的监测系统

除了用于检测突变体8063的大麦粒的生化试验(参见实施例2)外，本实 施例描述了经设计用以鉴定突变麦粒或其产品的遗传学方法。使用技术人员 已知的适当修饰，所述方法还可用于检测给定的植物产物是否是利用大麦突 变体8063制备的。如图15所例示的，该试验基于测定单核苷酸多态性(SNP) 的分析，具体为突变体8063的MMT基因的第3076位的G→A突变，并且 具有表7所列的寡核苷酸引物对的特征。

当将引物对20应用在利用大麦cv.Prestige的基因组DNA作为模板的反 应中时，产生了271bp的PCR产物(序列为SEQ ID NO：33)，而当将突变体 8063的基因组DNA用作模板时则没有扩增出产物，后一种情况仅仅是因为 在反向引物3′末端和模板之间没有碱基配对(图19A)。然而，在利用突变体 8063的基因组DNA的PCR扩增中，由引物对21获得了271bp的PCR产物 (SEQ ID NO：34；图19A)，原因是所述反向引物具有与模板完全匹配的序列。 设计了引物对22(其由引物对20和21所示的四个上述引物组成，两个用于 扩增突变体8063的MMT基因中包含G3076→A突变的片段，两个用于扩增 突变体14018的MMT基因中包含G1462→A突变的片段(SEQ ID NO：36；参 见实施例17)，用以监测包含上述两种核苷酸突变的MMT突变基因的存在。

以由200ng基因组DNA和50-100pmol特异引物对的各个引物(表7) 组成的50-μL RedTaq聚合酶反应(Sigma，cat.no.D6063)进行上述各PCR扩增 试验。在标准的PCR循环仪中扩增(95℃1分钟；然后是94℃60秒-64℃30 秒-72℃30秒的30个循环；之后为72℃10分钟而结束)之后，将所述样 本的25-μL试样应用于2％琼脂糖凝胶的标准电泳。如图15C所例示的，在 引物对20和引物对21存在下，利用cv.Prestige的基因组DNA的PCR分别 产生了271-bp DNA片段和没有产生任何片段。而在引物对20和21存在下， 利用突变体8063的基因组DNA的PCR分别没有产生片段和产生271-bp DNA片段。在利用未知身份的大麦谷粒的基因组DNA进行PCR的结果为后 一结果的情况下，模板DNA与突变体8063的DNA相同的可能性很高。用 以支持所述结论的进一步验证工作包括用于测试SMM水平(参见实施例2) 和MMT活性(参见实施例4)的分析。

用以证明突变体8063缺乏MMT的另一个方法涉及利用实施例3详述的 技术方法和抗-MMT抗体的Western印迹分析。实际上，使cv.Prestige和突 变体8063的麦粒在20℃萌芽4天，然后将一个野生型麦粒和一个突变体8063 的麦粒分别在250μL H₂O中单独匀质化。在13,000rpm离心10分钟后，将 每种上清各15μL与5μL SDS上样缓冲液混合，煮沸5分钟，上样至12％ 的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，通过电泳分离，电转印并最后用抗MMT多克隆抗 体检测(图15D)。在cv.Prestige的提取物中可以容易地识别出清楚的120kDa 的MMT蛋白条带，而在突变体8063中没有与120kDa标准蛋白共迁移的免 疫活性蛋白。因此，上述Western印迹分析方法可用于检测萌芽大麦粒产生 MMT还是缺乏MMT活性。可以采用进一步的分子和生化检测以确定给定 谷粒是否源自突变体8063。

表7.用于突变体8063的SNP检测的引物

^*)MMT的野生型基因组序列(SEQ ID NO：3)的碱基对编号。

^**)突变体8063的MMT的基因组序列(SEQ ID NO：8)的碱基对编号。

^***)突变体14018的MMT的基因组序列(SEQ ID NO：19)的碱基对编号。

^****)标记为“PCR产物末端”的列中列出的片段的5′末端的序列。

^*****)标记为“PCR产物末端”的列中列出的片段的3′末端的互补序列。

实施例14

大麦突变体14018的MMT编码基因在内含子2的5′剪接位点发生突变

在发现大麦突变体14018的萌芽麦粒的提取物中SMM水平极低或完全 没有SMM之后，在与上文实施例9中详述的用于突变体8063的试验条件相 同的试验条件下对该植物进行分析。然而，在该情况下的野生型植物材料来 自cv.Sebastian，原因是在利用NaN₃对包含突变14018的一批麦粒中进行诱 变时使用的是cv.Sebastian。按照下文的描述设计并完成用以鉴定引起MMT 无效表型的突变。

首先，对cv.Sebastian的MMT编码基因的独特基因组DNA序列(基因 组DNA序列为SEQ ID NO：16；cDNA序列为SEQ ID NO：17；翻译的cDNA 序列为SEQ ID NO：18；在所有情况下序列都与本文实施例8中描述的cv. Prestige的序列相同)和突变体14018的MMT编码基因的独特基因组DNA序 列(基因组序列为SEQ ID NO：19；cDNA序列为SEQ ID NOs：20、21、23、25) 进行比较，集中比较跨越翻译起始密码子和终止密码子的区域。在所测序的 突变体14018的基因部分中，具体地为紧邻于外显子2下游，在内含子2的 第一碱基的供体剪接位点供体位点内，更具体的是在第1462号核苷酸处鉴定 出G→A碱基转换，并因此将影响所述基因转录本的初始RNA加工(图16)。

其次，利用引物对16(表4)，设计并配置RT-PCR反应以扩增跨越cv. Sebastian和突变体14018的MMT编码基因的外显子2至外显子5的基因区 域(图16A)。扩增DNA后，对反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果示于图 16B。与实施例9中描述的突变体8063的结果类似，来自cv.Sebastian的野 生型RNA产生了一个PCR片段，即图16B中的产物5(长度和DNA序列参 见SEQ ID NO：20)，其与跨越野生型大麦MMT的全长cDNA的第246-933 位碱基的序列(SEQ ID NO：17)相同。该结果再次强调了选择性剪接不是野生 型基因表达的特征。

第三，在PCR反应中使用从突变体14018纯化的模板RNA，产生了三 个特异性片段，其在图16B、C中被称为产物6(SEQ ID NO：21)、产物7(SEQ  ID NO：23)和产物8(SEQ ID NO：25)，且长度和序列与野生型模板的扩增产物 不同。该结果证明，在突变体14018的MMT基因中的内含子2的5′剪接位 点中的单个突变通过消除正常的剪接位点而阻碍了前-mRNA的加工，反而活 化了隐藏的额外剪接位点的使用。在该方面，对于产物6和产物7，都在内 含子2中鉴定出了隐藏的剪接位点，而对于产物8该隐藏剪接位点则在外显 子2中。上述测序结果的比较图见于图16C。

此外，DNA序列分析揭示了产物6中的翻译提前终止密码子[根据大麦 cv.Sebastian的基因组DNA(SEQ ID NO：16)的碱基编号为第1579-1581位碱 基TAG]，产物7中的翻译提前终止密码子[根据大麦cv.Sebastian的基因组 DNA(SEQ ID NO：16)的碱基编号为第1840-1842位碱基TAA]和产物8中的 翻译提前终止密码子[根据大麦cv.Sebastian的基因组DNA(SEQ ID NO：16) 的碱基编号为第1916-1918位碱基TGA]分别产生SEQ ID NO：22、SEQ ID  NO：24和SEQ ID NO：26所示的长度为186、180和163个氨基酸的翻译蛋白。 与上述对于突变体8063的结果平行(图12D、E)，图16D、E中的图示提供 了参与选择性剪接事件的具体碱基的性质的具体数据。

实施例15

用于合成突变体14018的截短MMT的表达质粒

用于构建直接合成源自突变体14018的三个截短的重组MMT的表达质 粒的基本原理和策略与实施例11中描述的用于突变体8063的相同。简而言 之，试验目的是证明突变体14086的异常剪接事件产生编码没有活性的MMT 的转录本。因此，重组的基因延伸段应编码序列如SEQ ID NO：22、SEQ ID  NO：24和SEQ ID NO：26所示且反映了导致产物6、产物7和产物8的异常剪 接事件的蛋白(参见图16B、C)。

参见实施例10，在以引物对23、24和25(表8)为引物的三个标准连续 PCR中利用质粒pET19b-MMT作为模板，产生了394-bp扩增片段(SEQ ID  NO：30)。利用SacII-BamHI酶切该片段并与pET19b-MMT的SacII-BamHI大 片段(图17A)连接，产生表达质粒pET19b-Line14086-Prod6(图17B)，所设计 的该质粒用于合成与图16B中所示产物6对应的截短MMT。

在三个连续PCR扩增中，利用与上述用于394-bp片段相同的方法，但 此时使用引物对23、24和26(表8)，产生了376-bp的片段(SEQ ID NO：31)， 利用SacII-BamHI酶切该片段并与pET19b-MMT的SacII-BamHI大片段(图 17A)连接，产生表达质粒pET19b-Line 14086-Prod7(图17C)。该表达质粒设 计用于合成与图16B中所示产物7对应的截短MMT。

在平行进行的试验(以与上述用于pET19b-MMT类似的方式进行，但使 用引物对27和28(表8))中，扩增出325-bp片段(SEQ ID NO：32)，利用 SacII-BamHI酶切该片段并与pET19b-MMT的SacII-BamHI大片段(图17A) 连接，产生表达质粒pET19b-Line14086-Prod8(图17D)。该表达质粒设计用 于合成与产物8对应的截短MMT(参见图16B)。

表8.用于扩增突变体14018的DNA片段的引物(用于质粒构建)

^*)注意：在所有反应中使用了其中的SacII位点用下划线标记的相同正向引物。对于反向 引物，利用波浪线表示没有退火至模板DNA的5′延伸段；BamHI位点用斜体字显示，而 互补的翻译终止密码子用加粗的字母表示。

^**)数字表示相邻列所示的相应SEQ ID NO的核苷酸编号。

实施例16

突变体14018的重组MMT形式没有活性

按照实施例12的方法，只是将源自突变体8063的构建体替换为源自突 变体14018的构建体。利用pET19b-Line14018-Prod6、 pET19b-Line14018-Prod7和pET19b-Line14018-Prod8转化大肠杆菌(图 17A-D，相应的氨基酸比对显示在图17E)，但该试验没有进行Western印迹 分析，原因是实施例12所述的抗MMT抗体针对的序列延伸段(MMT特定部 分)不存在于突变体14018中。

转化细菌的提取物均不显示产生SMM的能力(图18)，因此，由与上文 实施例12中提供的相同的论证提供了以下结论的基础，即大麦突变体14018 产生非功能性MMT酶(其缺乏形成DMS前体SMM的催化能力)。

实施例17

用于大麦14018的监测系统

除了用于检测突变体14018的大麦粒的生化试验(参见实施例2)外，本实 施例还描述了设计用以鉴定由大麦突变体14018制备的突变麦粒或植物产物 的遗传方法。该方法基于利用表9所示寡核苷酸引物对的特征来检测单核苷 酸多态性(SNP)，特别是图19例示的在突变体14018的MMT基因的第1462 位的G→A突变的分析。

当在使用大麦cv.Sebastian的基因组DNA作为模板的反应中使用引物对 29时，产生了序列为SEQ ID NO：35的121bp的PCR产物，而当使用突变 体14018的基因组DNA作为模板时没有扩增出产物，后一情况的原因仅是 在反向引物的3′末端和模板之间没有碱基配对(图19B)。然而，在使用突变 体14018的基因组DNA的PCR扩增中使用引物对30获得了121bp的PCR 产物(SEQ ID NO：36)，原因是反向引物的序列与模板(图19B)完全匹配。设计 引物对31，其由引物对29和30所示的四个上述引物组成(两个引物用于扩 增突变体14018的MMT基因中含有G1462→A突变的片段(即SEQ ID NO：36) 和另两个引物用于扩增突变体8063的MMT基因中的G3076→A突变，即 SEQ ID NO：34，参见实施例9))，用以监测包含上述两个核苷酸突变的MMT 突变基因的存在。

上述PCR扩增试验均以由200ng基因组DNA和50-100pmol特定引物 组的各引物(参见表7)组成的50-μl RedTaq聚合酶反应(Sigma，cat.no.D6063) 而进行。在标准PCR循环仪中扩增(95℃1分钟；然后是94℃60秒-64℃30 秒-72℃30秒的30个循环，以72℃10分钟结束)后，使用25-μl样本试样 在2％琼脂糖凝胶上进行标准电泳。如图19C所示，在引物对29和引物对30 存在下，利用cv.Sebastian的基因组DNA的PCR分别产生了121-bp DNA 片段和没有产生片段。而在引物对29和引物随30存在下，利用突变体14018 的基因组DNA的PCR分别没有产生片段和产生了123-bp DNA片段和没有 产生片段。利用未知身份的大麦麦粒的基因组DNA的PCR结果为后一种结 果的情况下，所述模板DNA与突变体14018的DNA相同的可能性很高。用 以支持所述结论的进一步的验证工作包括用于测试SMM水平(参见实施例2) 和MMT活性(参见实施例4)的分析。

用以证明突变体14018缺乏MMT的另一个方法包括利用实施例3详述 的技术方法和抗-MMT抗体的Western印迹分析。实际上，使cv.Sebastian 和突变体14018的麦粒在20℃萌芽4天，然后将一个野生型麦粒和一个突变 麦粒分别在100μL H₂O中单独匀质化。在13,000rpm离心10分钟后，将每 种上清各15μL与5μL SDS上样缓冲液混合，煮沸5分钟，上样至12％的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶，通过电泳分离，电转印并最后用抗MMT多克隆抗体 检测(图15D)。在cv.Sebastian的提取物中可以容易地识别出清楚的120kDa 的MMT蛋白条带，而在突变体14018中没有与120kDa标准蛋白共迁移的 免疫活性蛋白。因此，上述Western印迹分析方法可用于检测萌芽大麦粒产 生MMT还是缺乏MMT活性。可以采用进一步的分子和生化检测以确定给 定谷粒是否源自突变体14018。

表9.用于突变体14018的SNP检测的引物

^*)野生型的基因组MMT序列(SEQ ID NO：16)的碱基对编号。

^**)突变体14018的基因组MMT序列(SEQ ID NO：19)的碱基对编号。

^***)突变体8063的基因组MMT序列(SEQ ID NO：8)的碱基对编号。

^****)标记为“PCR产物末端”的列中列出的片段的5′末端的序列。

^*****)标记为“PCR产物末端”的列中列出的片段的3′末端的互补序列。

参考文献

专利文献

Mullis，K.B.等人的美国专利No.4,683,195

Mullis，K.B.等人的美国专利No.4,800,159

Reuther，H.的美国专利No.5,242,694

Douma，A.C.等人的美国专利No.6,660,915

Breddam，K.等人的美国专利No.7,420,105

Bisgaard-Frantzen，H.等人的美国专利申请公开No.2006/0057684

AU专利No.4,683,195

Breddam，K.等人的PCT专利申请WO 2005/087934

其它公开

American Association of Cereal Chemists，″Approved methods of the  American Association of Cereal Chemists.″ISBN 0-913250-86-4(1995).

American Society of Brewing Chemists，″Methods of analysis of the American Society of Brewing Chemists.″ISBN 1-881696-01-4(1992).

Bourgis，F.et al.″S-Methylmethionine plays a major role in phloem sulfur  transport and is synthesized by a novel type of methyltransferase.″Plant Cell  11：1485-1497，1999.

Briggs，D.E.et al.″Malting and brewing science.Volume I Malt and sweet  wort.″Chapman and Hall，New York，USA.ISBN 0412165805，1981.

Dufour，J.P.，″Direct assay of S-methylmethionine using high-performance  liquid chromatography and nuorescence techniques.″J.Am.Soc.Brew.Chem. 44：1-6，1986.

Durai，S.et al.″Zinc finger nucleases：custom-designed molecular scissors  for genome engineering of plant and mammalian cells.″Nucleic Acids Res. 33：5978-5990，2005.

European Brewery Convention，″Analytica-EBC.″ISBN 3-418-00759-7 (1998).

Hansen，M.et al.″Antisense-mediated suppression of C-hordein biosynthesis  in thebarley grain results in correlated changes in the transcriptome，protein  profile，and amino acid composition.″J.Exp.Bot.58：3987-3995，2007.

Hough，J.S.et al.，″Malting and brewing science.Volume II Hopped wort and  beer.″Chapman and Hall，New York，USA.ISBN 0412165902，1982.

Hysert，D.W.et al.″The origin and control ofdimethyl sulfide and its  precursor in malt.″Tech.Q.MBAA 17：34-43，1980.

Iida，S.and Terada，R.，″Modification of endogenous natural genes by gene  targeting in rice and other higher plants.″Plant Mol.Biol.59：205-219，2005.

Imashuku，H.，″Two new technologies for efficient and flexible wort boiling： 1.Rest before wort boiling to convert SMM to DMS；2.Hop boiling separately  from wort.″3rd World Brewing Congress，Presentation O-52，Program Book，p. 91 and attached presentation slides，2008.

Institute of Brewing，″Instirate of Brewing.Methods of analysis.″ISBN  0-900489-10-3，1997.

Kleinhofs，A.et al.″Induction and selection of specific gene mutations in  Hordeum and Pisum.″Mutat.Res.51：29-35，1978.

Ko，S.et al.″S-Methylmethionine is both a substrate and an inactivator of  1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase.″Arch.Biochem.Biophys. 421：85-90，2004.

Kocsic，M.G.et  al.″Insertional inactivation of the methionine  S-methyltransferase gene eliminates the S-methylmethionine cycle and increases  the methylation ratio.″Plant Physiol.131：1808-1815，2003.

Kumar，S.et al.″Gene targeting in plants：fingers on the move.″Trends Plant  Sci.11：159-161，2006.

Lal，S.et al.″A splice site mutant of maize activates cryptic splice sites， elicits intron inclusion and exon exclusion，and permits branch point elucidation.″ Plant Physiol.121：411-418，1999.

Maquat，L.E.and Carmichael，G.G.，″Quality control of mRNA function.″ Cell 104：173-176，2001.

McElroy，D.and Jacobsen，J.，″What′s brewing in barley biotechnology？″ Bio/Technology 13：245-249，1995.

Meilgaard，M.C.，″Prediction of flavour differences between beers from their  chemical composition.″J.Agric.Food Chem.30：1009-1017，1982.

Mendell，J.T.and Dietz，H.C.，″When the message goes awry： Disease-producing mutations that influence mRNA content and performance.″ Cell 107：411-414，2002.

Mudd，S.H.and Datko，A.H.，″The S-methylmethionine cycle in Lemna  paucicostata.″Plant Physiol.93：623-630，1990.

Nevo，E.″Origin，evolution，population genetics and resources for breeding  of wild barley，Hordeum spontaneum，in the Fertile Crescent.″In Shewry，P.R. (ed.)：″Barley：Genetics，Biochemistry，Molecular Biology and Biotechnology，″ pp.19-43.CAB International，Wallingford，UK.ISBN 0-85198-725-7，1992. 1992.

Pimenta，M.J.et al.″Determination of  S-adenosyl-L-methionine：L-methionine S-methyltransferase activity by selective  adsorption of[methyl-³H]S-adenosylmethionine onto activated charcoal.″Anal. Biochem.225：167-169，1995.

Phenomenex，″HPLC application.″ID No.：15992，2006.

Ranocha，P.et al.″The S-methylmethionine cycle in angiosperms：ubiquity， antiquity and activity.″Plant J.25：575-584，2001.

Rasmussen，S.K.and Hatzack，F.，″Identification of two low-phytate  barley(Hordeum vulgare L.)grain mutants by TLC and genetic analysis.″ Hereditas 129：107-112，1998.

Robbins M.P.et al.″Gene manipulation of condensed tannins in higher  plants.″Plant Physiol.116：1133-1144，1998.

Sambrook，J.and Russell，D.W.，″Molecular cloning.A laboratory manual， 3rd Ed.″，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York， U.S.A.ISBN 0-87969-577-3，2001.

Scheuren，H.and Sommer，K.，″Vaporescence versus boiling-Expulsion of  aromatic compounds during the whole wort production.″3rd World Brewing  Congress，Presentation O-55，Program Book，p.92 and attached presentation  slides，2008.

Sinibaldi，R.M.and Mettler I.J.，″Intron splicing and intron-mediated  enhanced expression in monocots.″Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol. 42：229-257，1992.

Stahl，Y.et al.″Antisense downregulation of the barley limit dextrinase  inhibitor modulates starch granule sizes distribution，starch composition and  amylopectin structure″.Plant J.39：599-611，2004.

Tagmount，A.et al.″An essential role of  S-adenosyl-L-methionine：L-methionine S-methyltransferase in selenium  volatilization by plants.Methylation of selenomethionine to  selenium-methyl-L-selenium-methionine，the precursor of volatile selenium.″ Plant Phys.130：847-856，2002.

Thanbichler，M.et al.″S-Methylmethionine metabolism in Escherichia coli.″ J.Bacteriol.181：662-665，1998.

Tzfira，T.and White，C.，″Towards targeted mutagenesis and gene  replacement in plants.″Trends Biotechnol.23：567-569，2005.

von Bothmer，R.″The wild species of Hordeum：Relationships and potential  use for Improvement of cultivated barley.″In Shewry，P.R.(ed.)：″Barley： Genetics，Biochemistry，Molecular Biology and Biotechnology，″pp.3-18.CAB  International，Wallingford，UK.ISBN 0-85198-725-7，1992.

Wu，J.et al.″Nonsense-mediated mRNA decay(NMD)silences the  accumulation of aberrant trypsin proteinase inhibitor mRNA in Nicotiana  attenuata.″Plant J.51：693-706，2007.

表10：序列表

PCT/RO/134表

申请人或申请单位的提交号P1600PC00    国际申请号PCT/DK2009/050315

关于微生物或其它生物材料保藏的说明

         (PCT细则13之二)

PCT/RO/134表(1998年7月；2004年1月再版)