一株适应幼仓鼠肾传代细胞的新城疫病毒耐热弱毒株及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一株适应幼仓鼠肾传代细胞的新城疫病毒耐热弱毒株及其制备方法和应用，其微生物保藏号是：CCTCC V201113；分类命名：新城疫病毒TS09-C株；保藏时间是：2011年5月9日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国.武汉.武汉大学，具有以下优点：1、已经充分适应BHK21细胞，其增殖滴度可达10

说明书

技术领域

本发明属微生物病毒领域，涉及一种病毒新毒株，具体涉及一株适应幼仓鼠肾传代细胞 的新城疫病毒耐热弱毒株及其制备方法和应用，其微生物保藏号是：CCTCC V201113；分 类命名：新城疫病毒TS09-C株；保藏时间是：2011年5月9日；保藏单位：中国典型培养 物保藏中心；保藏地址：中国.武汉.武汉大学。

背景技术

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)为副粘病毒科腮腺炎病毒属成员，是有囊膜的 负链RNA病毒。由NDV引起的新城疫(Newcastle disease，ND)是一种极易传染的毁灭性疾 病，死亡率可达90％以上，被国际兽疫局认定为两种A类禽病之一(另一种为禽流感)。ND 的防控以免疫预防为主。当前国际上生产和使用的ND疫苗有两大类，即活疫苗和灭活疫苗， 活疫苗又包括低毒力和中等毒力活疫苗。中等毒力活疫苗免疫效果优良，抗体一致性好，但 对雏鸡、鸽和鹌鹑等有较强的毒副反应，此类疫苗免疫的禽肉不符合出口要求；灭活疫苗使 用安全、免疫效果好，但需要肌肉注射，费工费时，免疫成本高，且影响禽肉品质，使其应 用受到了一定的限制；低毒力活疫苗以其使用方便(可通过拌料、饮水、喷雾、滴鼻、点眼 或注射等多种方式给苗)和毒副作用较小等优点在我国应用最为广泛。但低毒力活疫苗耐热 性能较差和冷藏条件要求高，常因保存或使用不当而影响疫苗免疫效果，不利于在我国气温 普遍较高的南方地区和冷藏条件较差的农村进行大面积推广应用。因此，ND低毒力耐热活 疫苗在我国有着较为广阔的应用前景。

当前，包括耐热活疫苗在内的ND疫苗生产主要是使用鸡胚，而以普通鸡胚生产疫苗就 可能使疫苗在生产过程中污染一些可由鸡胚垂直传播的疫病病原，导致这些病原随着疫苗的 使用而广泛传播。使用异源传代细胞制备ND疫苗可避免鸡胚传播其他疫病的风险。关于NDV 毒株在各种细胞中的增殖研究国内外均有报道。研究表明：NDV可在鸡胚尿囊液中复制并产 生感染性的病毒粒子，NDV强毒株可在多种体外培养细胞中复制，但是弱毒株只能在含有胰 蛋白酶的细胞中进行复制。但迄今为止，仍未见适应传代细胞的NDV耐热弱毒株的研究报 道。

现有关于新城疫病毒株的技术文献，主要有以下几项：如专利申请号为 CN200710003046.9的文献“新城疫病毒D90毒株及其应用”公开了新城疫病毒D90毒株，还 公开了该毒株在抗肿瘤中的应用，但D90毒株不具备适应传代细胞和耐热的特性；专利申请 号为CN200610001693.1的文献“表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组新城疫LaSota弱毒 疫苗株”和专利申请号为CN200610075781.6的文献“表达禽流感病毒H5亚型HA蛋白的重组 新城疫LaSota弱毒疫苗株”公开了两种能够表达外源病毒基因的新城疫病毒Lasota株，同样 这两种毒株也不具备适应传代细胞和耐热的特性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种新的、适应传代细胞的新 城疫病毒耐热弱毒株。

本发明还有一个目的是提供所述的弱毒株应用于制备预防新城疫的耐热活疫苗(传代细 胞源)，所述的耐热活疫苗具有耐热、保存期长、保护力好和可避免生产用鸡胚携带异源病毒 等优点。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案：一株适应幼仓鼠肾传代细胞(BHK21)的 新城疫病毒(NDV)耐热弱毒株，其微生物保藏号是：CCTCC V201113；分类命名：新城 疫病毒TS09-C株；保藏时间是：2011年5月9日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心； 保藏地址：中国.武汉.武汉大学。

所述的适应幼仓鼠肾传代细胞的新城疫病毒耐热弱毒株的制备方法，是在含有0.2μg/ml TPCK-胰酶的培养条件下，将新城疫病毒TS09鸡胚适应株在BHK21细胞中进行17次连续 传代培养，其中有3次为极限稀释法纯化，传至第17代即获得适应幼仓鼠肾传代细胞的新城 疫病毒耐热弱毒株，即新城疫病毒TS09-C株。

按上述方案，所述的新城疫病毒耐热弱毒株在BHK21细胞中的增殖效价达10^8.0 TCID₅₀/ml。

按上述方案，所述的新城疫病毒耐热弱毒株的血凝素-神经氨酸酶(HN)基因序列为SEQ ID NO：1。

按上述方案，所述的新城疫病毒耐热弱毒株与原型株TS09株的HN基因序列的核苷酸同 源性为88.2％。

本发明适应幼仓鼠肾传代细胞的新城疫病毒耐热弱毒株的细胞增殖效价测定：病毒细胞 培养物离心后，取上清液进行半数细胞感染剂量(TCID₅₀)的测定，将上清液进行10倍梯度 稀释，取10^-5，10^-6，10^-7和10^-8稀释度样品接种长成致密单层的BHK21细胞，接种量为0.1ml/ 孔，每个稀释度接种5孔细胞。观察细胞病变，如120小时内出现细胞病变则判定为阳性， 如未出现细胞病变则判定为阴性，以Reed-Muench法计算TCID₅₀。结果该毒株的细胞增殖效 价为10^8.0TCID₅₀/ml。

本发明适应幼仓鼠肾传代细胞的新城疫病毒耐热弱毒株的致细胞病变效应观察：病毒液 以10^-3稀释后，接种长成致密单层的BHK21细胞，观察细胞病变情况。结果细胞在接种病毒 48小时左右，开始出现大小不等、椭圆形的空泡、细胞融合，在72～96小时内，出现大量 细胞破碎、死亡、悬浮于营养液中。

对本发明适应幼仓鼠肾传代细胞的新城疫病毒耐热弱毒株的血凝素-神经氨酸酶(HN) 基因进行RT-PCR扩增及序列测定，发现该弱毒疫苗株的HN基因序列为SEQ ID NO：1，序 列总长度为1851bp。

对本发明适应幼仓鼠肾传代细胞的新城疫病毒耐热弱毒株的HN基因序列进行分析：通 过MegAlign程序(DNAstar软件包)进行HN基因序列比对，证实该耐热弱毒株与其原型株 TS09株的HN基因核苷酸同源性为88.2％。

本发明适应幼仓鼠肾传代细胞的新城疫病毒耐热弱毒株可用于制备新城疫耐热活疫苗 (传代细胞源)，用于新城疫的预防。

本发明适应幼仓鼠肾传代细胞的新城疫病毒耐热弱毒株制备成疫苗的方法：选用生长状 态良好、长成致密单层的BHK21细胞，倾弃培养液后，换以含0.1％病毒种子液的无血清 DMEM营养液(含0.2μg/ml TPCK-胰酶)，置于37度培养，每日观察细胞状态。发现生长异 常、污染的细胞应废弃。培养2～3日后，约有80％以上的细胞出现病变，且对照细胞状态 良好，即可收获，经三次反复冻融后，置-20度保存。取少量进行无菌检验和病毒效价检验。 将检验合格的病毒液与保护剂按1∶1比例混合，充分摇匀后分装，迅速进行冷冻真空干燥。 然后进行物理性状、纯粹、效价、安全和效力等检验。检验合格的产品即为新城疫耐热活疫 苗(传代细胞源)。

本发明适应BHK21细胞的NDV耐热弱毒株与现有的NDV弱毒株相比，具有以下优点：

1、已经充分适应BHK21细胞，其增殖滴度可达10^8.0TCID₅₀/ml；

2、具有较好的耐热特性，56度处理1小时HA效价无明显下降；

3、具有弱毒特性，鸡胚平均致死时间大于90小时，脑内致病指数为0.00；

4、以该毒株制备的新城疫耐热活疫苗(传代细胞源)具有耐热、保存期长、保护力好、 可避免生产用鸡胚携带异源病毒等优点，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明适应幼仓鼠肾传代细胞的新城疫病毒耐热弱毒株感染BHK21细胞后的细 胞病变图，(A)感染48小时的BHK21细胞；(B)感染96小时的BHK21细胞；(C)正常 对照细胞；

图2是本发明适应幼仓鼠肾传代细胞的新城疫病毒耐热弱毒株与原型株TS09株的HN 基因序列比较结果；

图3是本发明适应幼仓鼠肾传代细胞的新城疫病毒耐热弱毒株与原型株TS09株的HN 基因核苷酸同源性分析结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明要求保护的范围。

实施例1

本发明适应幼仓鼠肾传代细胞的新城疫病毒耐热弱毒株的制备

以含0.2μg/ml TPCK-胰酶的DMEM营养液(无血清)为接种液和细胞维持液，将NDV TS09鸡胚适应株在BHK21细胞中进行17次连续传代，除第11、13和15代为极限稀释法纯 化病毒外(稀释度由出现CPE的最高稀释度决定)，其余均为10^-2稀释接种。对传代病毒进 行了生物学特性测定，得到表1。

表1.NDV TS09鸡胚适应株在BHK细胞上的传代培养结果

注：-表示细胞无病变；+～++++表示细胞病变率(分别为25％～100％)；

^a表示该次传代方法为以极限稀释法进行病毒的纯化；

^b表示极限稀释法的极限稀释倍数。

由表1可得出，第2、3代病毒未检测出HA活性，也无典型CPE出现，第4、5代逐渐 出现典型CPE，且HA效价也上升至2³，表明该阶段为TS09株在BHK21细胞中的适应期； 在第6～10代过程中，病毒的HA效价稳定在2⁵左右，且CPE较为明显，表明该阶段为TS09 株在BHK21细胞中的稳定期；在第11～17代中，经过3次极限稀释法纯化病毒后，病毒的 HA效价稳定在2⁶左右，且病毒滴度由第10代的10^6.8TCID₅₀/ml上升至10^8.0TCID₅₀/ml。因此， 经过在BHK21细胞中的17次连续传代(包括3次极限稀释法纯化)，TS09株已经完全适应 了BHK21细胞，从而获得了一株新的、纯化的新城疫病毒细胞适应株，命名为TS09-C株。 其微生物保藏号是：CCTCC V201113；分类命名：新城疫病毒TS09-C株；保藏时间是：2011 年5月9日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国.武汉.武汉大学。

与原型株TS09株相比，TS09-C株的细胞增殖滴度由10^3.3TCID₅₀/ml上升至 10^8.0TCID₅₀/ml，其鸡胚增殖滴度由10^8.6EID₅₀/ml下降至10^5.7EID₅₀/ml，表明TS09-C株已由鸡 胚适应株转变为传代细胞适应株。此外，耐热特性、MDT和ICPI测定结果表明，TS09-C株 保持了其母本株的耐热和弱毒的特性。

实施例2

本发明适应BHK21细胞的NDV耐热弱毒株的致细胞病变效应

将本发明TS09-C株病毒液以10^-3稀释后，接种长成致密单层的BHK21细胞，观察细胞 病变情况，得到图1。

由图1可看出，细胞在接种病毒48小时左右，开始出现大小不等、椭圆形的空泡、细胞 融合；在72～96小时内，出现大量细胞破碎、死亡、悬浮于营养液中；正常对照细胞则生长 状态良好。结果表明：TS09-C株对BHK21细胞有致细胞病变效应。

实施例3

本发明适应BHK21细胞的NDV耐热弱毒株的HN基因序列测定与分析

根据GenBank已发表的新城疫病毒HB92株(GenBnak登录号：AY225110)的HN基因 序列，设计一对引物，扩增全长的HN基因，由上海生工生物工程技术有限公司合成。具体 序列如下：NDV-F2：5′-CGGTTGTAGATGACCAAAGG-3′；NDV-R2： 5′-AATCTAATCACATTAGCACTAGCTG-3′；

病毒基因组RNA的提取参照试剂盒说明书进行，提取的RNA溶解于17ul DEPC水， 加入1μl逆转录引物，75℃5min，立即冰浴，然后加入逆转录反应液：5×RT Buffer 5μl，dNTPs (10mmol/L)1μl和M-MLV 1μl。42℃30min，95℃5min，-20℃保存待进行PCR反应。

PCR反应体系：10×Buffer 5μl，MgCl₂(25mmol/L)3μl，dNTPs(10mmol/L)1.5μl，上、 下游引物(10μmol/L)各2μl，Taq酶5U，RT产物5μl，余下用水补至50μl。反应条件： 95℃5min；30×(94℃30sec，55℃1min，72℃1min)；72℃10min。1％琼脂糖凝胶电泳检 测目的条带。将特异的阳性条带以DNA纯化试剂盒进行纯化回收，送至上海生工生物工程 技术有限公司进行序列测定。

对测序结果进行分析：与其他NDV毒株进行Blast比对，去掉不属于HN基因的序列， 最终得出的TS09-C株的HN基因序列为SEQ ID NO：1，序列总长度为1851bp。采用MegAlign 程序(DNAstar软件包)，对TS09-C株和原型株TS09株的HN基因进行序列比对和同源性分 析，分别得到图2和图3。

由图2可以得出，TS09-C株与TS09株相比，TS09-C株HN基因的最大特征性变异是从 第1735位到1851位，共插入了117个核苷酸。

由图3可以得出，TS09-C株与TS09株的HN基因核苷酸同源性为88.2％；与V4株的同 源性最高，为99.6％；与HB92株的同源性最低，为83.7％。

实施例4

利用本发明适应幼仓鼠肾传代细胞的新城疫病毒耐热弱毒株制备ND耐热活疫苗(传代 细胞源)

以下简述ND耐热活疫苗(传代细胞源)的制备过程：

1.BHK21细胞由本单位保存，细胞的冻存、复苏与培养按照常规方法进行。

2.毒种生产用毒种为本发明TS09-C株，该毒株由申请人鉴定、保存和供应。效检用强毒 为北京株(CVCC AV1611株)，由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。

3.疫苗生产及半成品检验

3.1疫苗的生产选用生长状态良好、长成致密单层的BHK21细胞，倾弃培养液后，换以 含0.1％病毒种子液的无血清DMEM营养液(含0.2μg/ml TPCK-胰酶)，置于37度培养，每 日观察细胞状态。发现生长异常、污染的细胞应废弃。培养2～3日后，约有80％以上的细 胞出现病变，且对照细胞状态良好，即可收获，经反复三次冻融后，低速离心取上清，获得 病毒液，置-20度保存。取少量病毒液进行半成品检验。

3.2半成品检验按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，应无菌生长；将半成品用灭菌 生理盐水作10倍系列稀释，取10^-5、10^-6、10^-7三个稀释度各接种BHK21细胞5孔，每孔0.1ml， 置37℃继续培养。观察细胞病变，120小时内出现细胞病变者判为感染，计算TCID₅₀，每0.1ml 病毒含量应不低于10^6.0TCID₅₀，否则判为不合格。

3.3配苗及分装将检验合格的半成品混合于同一容器内，按规定羽份，加一定比例的5％ 蔗糖脱脂牛奶(质量与体积比)作稳定剂，同时加入适宜的抗生素，充分摇匀，定量分装， 每羽份病毒含量应不低于10^5.0TCID₅₀。分装后迅速进行冷冻真空干燥(按《中华人民共和国 兽用生物制品规程》2000年版附录进行)。

4.成品检验参照现行《中国兽药典》附录，对成品疫苗分别进行物理性状、无菌、支原 体、外源病毒、安全和效力等检验，均应合格。

5.作用与用途用于预防鸡新城疫。也可用于预防鸽、鹌鹑的新城疫。

6.用法与用量按瓶签注明羽份，用灭菌生理盐水或适宜的稀释液稀释。滴鼻或点眼免疫， 每只0.05ml；饮水免疫，剂量加倍。

7.贮藏与有效期-15℃下保存，有效期为24个月；2～8℃保存，有效期为12个月。

8.规格250羽份/瓶。