一种检测酸浆宿萼中β-隐黄质含量的方法

摘要

本发明涉及一种能够检测酸浆宿萼中β-隐黄质含量的反相HPLC方法。该方法包括样品预处理、游离水含量的测定、总类胡萝卜素提取、水解和HPLC分析等步骤。本方法可以准确客观地检测出酸浆果实和宿萼中β-隐黄质的含量，将有非常显著的现实应用意义。

说明书

【技术领域】

本发明属于天然植物中有效成分的检测方法的技术领域，更具体地， 本发明涉及一种能够检测酸浆宿萼中β-隐黄质含量的反相HPLC方法。

【背景技术】

酸浆(Physalis alkekengi L.var.franchetii(Masters)Makino)为茄科 (Solanaceae)酸浆属(Physalis)的一种多年生草本植物，又名“红姑娘”、 “洋姑娘”、“红灯笼”、“锦灯笼”等。酸浆果实为球状浆果，外部有宽大四棱 型宿萼包裹，呈灯笼形囊状，在我国大部分地区均有分布，全草均可入药， 果实可加工成果汁和果酱等制品。酸浆的宿萼和果实组织中含有丰富的β- 隐黄质，且以脂肪酸酯形式存在，其结构式如下，R＝脂肪酸基：

其中以宿萼中的含量最为丰富，在0.1～0.5％(W/DW)之间。许多情 况下，β-隐黄质在这些组织中与其合成前体-β-胡萝卜素(β-Carotene)和 玉米黄素(Zeaxanthin)共存。

因此，在检测酸浆宿萼中β-隐黄质含量时，首先应当将其中的β-隐黄 质酯水解，形成游离态的β-隐黄质(单体)，应用高效液相色谱(HPLC) 将其与其它类胡萝卜素分离，才能进行定性、定量测定。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的是提供一种能够检测酸浆宿萼中β-隐黄质含量的反相 HPLC方法；

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及一种能够检测酸浆宿萼中β-隐黄质含量的反相HPLC方法， 该方法的步骤如下：

酸浆宿萼中β-隐黄质含量的测定方法，其特征在于该方法的步骤如下：

A)样品预处理

将酸浆的宿萼与浆果剥离，再用组织捣碎机将酸浆宿萼粉碎成丝状宿 萼样品；

B)游离水含量的测定

把准确称取的丝状宿萼样品置于表面皿中，在温度40～80℃烘箱中烘干 至恒重，然后，按下式计算样品中游离水的含量：

$X=\frac{M-M^{\prime }}{M}\times 100---\left(1\right)$

式中：

X＝游离水含量，以％(重量)计；

M＝烘干前重量，以克计；

M’＝烘干后重量，以克计；

C)总类胡萝卜素提取

准确称取步骤A)得到的丝状宿萼样品10重量份，再加入5～8重量份 石英砂和以所述丝状宿萼样品重量计4～8倍的选自丙酮、乙醇、甲醇或四 氢呋喃的第一有机溶剂，研磨5～15min后静置分离4～8min，取上清液作为 “第一萃取溶媒”；剩余物再加入与所述的第一有机溶剂等量的选自正己烷、 石油醚或乙酸乙酯的第二有机溶剂，研磨5～15min后静置分离4～8min，取 上清液作为“第二萃取溶媒”，并反复用第二有机溶剂研磨提取，直至上清液 和提余物为无色；

将第一萃取溶媒和所有的第二萃取溶媒合并，置于分液漏斗中，加入 与合并萃取溶媒等量的蒸馏水，剧烈震荡混合，静置分离25～35min，取上 清液在温度40℃、压力-0.06MPa与旋转速度60rpm的条件下旋转浓缩至干， 得到0.5～1.5重量份含有总类胡萝卜素酯的提取物；

D)水解

使用20～40重量份的由正己烷-乙醇-丙酮-甲苯按照体积比10∶6∶7∶7组成 的稀释液将步骤C)得到的含有总类胡萝卜素酯的提取物完全溶解，得到 所述提取物溶液再加入以所述溶液体积计0.1～0.5倍质量百分浓度为 35～45％的碱性甲醇溶液，在温度50～60℃下进行水解反应15～25min后，冷 却到室温；

然后，将所述冷却反应液转移至分液漏斗中，并用20～40重量份的正 己烷反复洗涤反应瓶，洗涤液合并至分液漏斗中，向反应液中加入20～60 重量份的重量百分浓度为5～15％的Na₂SO₄溶液，剧烈震荡后，在避光的条 件下静置分离0.8～1.4h，弃去下层相，将收集的上层溶液转移至100mL棕 色容量瓶中，用正己烷定容至刻度，准确移取其溶液1mL，离心分离 10～15min，得到的上清液进行HPLC分析；

E)HPLC分析

a)β-隐黄质标准溶液配制

准确称取β-隐黄质参比样品1mg，用1mL丙酮溶解后转移至25mL棕 色容量瓶中，用正己烷定容至刻度，配制成40μg/mL的储备液。

准确量取配制好的储备液，用逐级稀释的方法，配制成质量浓度分别 为0.00、0.039、0.078、0.156、0.313、0.625、1.250、2.500、5.000μg/mL 的标准溶液；

b)HPLC分析条件的设定

色谱柱：Diamonsil^TM(5μm，4.6mmx25cm)；流动相A：以体积计9∶1 的乙腈-水混合物；流动相B：乙酸乙酯；线性梯度洗脱：流动相B的体积百 分浓度在25min内由0％增加至100％；流速：1.0mL/min；检测波长：450nm； PDA波长范围250nm～550nm；进样量：20μL；

c)标准曲线绘制

使用C18-HPLC，测定步骤a)中配制的β-隐黄质标准溶液在λ＝450nm处 的峰面积，再结合所述标准溶液浓度绘制标准曲线；

d)样品中β-隐黄质含量的HPLC测定

使用高效色谱仪，在步骤b)设定的条件下测定样品在λ＝450nm处的 峰面积，根据步骤c)所绘制的标准曲线计算出样品中的β-隐黄质含量：

根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的酸浆宿萼用酸浆的浆 果代替。

根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤B使用的第一萃取溶剂 选自丙酮、乙醇或四氢呋喃。

根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤B使用的第二萃取溶剂 选自正己烷或乙酸乙酯。

根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的碱性甲醇溶液选自氢 氧化钾-甲醇溶液或氢氧化钠-甲醇溶液。

下面将更详细地描述本发明。

本发明涉及一种能够检测酸浆宿萼中β-隐黄质含量的反相HPLC方法， 该方法的步骤如下：

A)样品预处理

将酸浆的宿萼与浆果剥离，再用组织捣碎机将酸浆宿萼粉碎成丝状宿 萼样品；

在本发明中，除了所述的酸浆宿萼外，还可以使用酸浆果实。

所述的酸浆宿萼以及酸浆果实都需要进行粉碎预处理。

在本发明中，所述的组织捣碎机是使用在中药材加工技术中通常使用 的捣碎设备。

本发明中，所使用的组织捣碎机可以是在中药材加工技术中通常使用 的目前市场上销售的捣碎机，例如江阴市保利科研器械有限公司生产的 DS-200型组织捣碎机。

B)游离水含量的测定

把准确称取的丝状宿萼样品置于表面皿中，在温度40～80℃烘箱中烘干 至恒重，然后，按下式计算样品中游离水的含量：

$X=\frac{M-M^{\prime }}{M}\times 100---\left(1\right)$

式中：

X＝游离水含量，以％(重量)计；

M＝烘干前重量，以克计；

M’＝烘干后重量，以克计；

在本发明中，干燥时可以使用在中药材加工技术中通常使用的干燥设 备进行干燥，例如上海博迅实业有限公司医疗器械厂生产的GZX-9146MBE 型数显鼓风干燥箱进行干燥。

C)总类胡萝卜素提取

(1)准确称取步骤A)得到的丝状宿萼样品10重量份，再加入5～8 重量份石英砂和以所述丝状宿萼样品重量计4～8倍丙酮的第一有机溶剂， 研磨5～15min后静置分离4～8min，用滴管小心移出上层清液作为第一萃取 溶媒；剩余物再加入与所述的第一有机溶剂等量的正己烷的第二有机溶剂， 研磨5～15min后静置分离4～8min，用滴管小心移出上清液作为第二萃取溶 媒，并反复用第二有机溶剂研磨萃取，直至上清液和提余物为无色。

所述的第一有机溶剂可以选自丙酮、乙醇、甲醇或四氢呋喃等。第一 有机溶剂是化工技术领域中非常普遍使用的溶剂。它们都是目前市场上销 售的产品。

所述的第二有机溶剂可以选自正己烷、石油醚或乙酸乙酯等。第二有 机溶剂所选试剂是化工技术领域中非常普遍使用的溶剂。它们都是目前市 场上销售的产品。

(2)将第一萃取溶媒和所有的第二萃取溶媒合并，置于分液漏斗中， 加入与合并萃取溶媒等量的蒸馏水，剧烈震荡混合，再静置分离25～35min， 取上清液在温度40℃、压力-0.06MPa与旋转速度60rpm的条件下进行旋转 浓缩至干，得到0.5～1.5重量份含有总类胡萝卜素酯的提取物；

本发明中，所用到的减压浓缩装置为由上海振捷实验设备有限公司生 产的RE-52A型旋转蒸发仪，容量为2L，真空泵为由巩义市予华仪器有限 责任公司生产的SHZ-D(III)型循环水式真空泵。

D)水解

(1)使用20～40重量份的由正己烷-乙醇-丙酮-甲苯按照体积比10∶6∶7∶7 组成的稀释液将步骤C)得到的含有总类胡萝卜素酯的提取物完全溶解， 得到所述提取物溶液再加入以所述溶液体积计0.1～0.5倍重量百分浓度为 35～45％的碱性甲醇溶液，在温度50～60℃下进行水解反应15～25min，然后 冷却到室温；

根据本发明，皂化反应瓶为三口平底或圆底250mL烧瓶。中口用橡皮 塞封闭，钻孔接空气冷却回流管。回流管为一根长玻璃管，各种形状均可， 直径根据烧瓶容积而变。玻璃管在瓶口上端的部分至少有45cm长，下端至 少超出橡胶塞0.5cm。一侧开口可用橡皮塞封闭，开孔接温度计。另一侧开 口可作为进/出料口使用。反应时用橡皮塞封闭。图1为皂化反应瓶示意图。

也可采用容积适当的单口或双口玻璃容器。采用单口容器时，开口联 结回流冷凝管。采用双口容器时，与地面垂直的开口连接回流冷凝管。

根据本发明，35～45％碱性甲醇溶液是用氢氧化钾及氢氧化钠按照常规 方法配制的；

根据本发明，如果所加碱性甲醇溶液小于提取物溶液体积的0.1倍， 则会因为碱液用量不足而造成皂化反应不充分，反应液中残留未皂化完全 的β-隐黄质酯；如果所加碱性甲醇溶液大于提取物溶液体积的0.5倍，则会 因为碱液用量太大而使反应液维持在高碱性条件而造成β-隐黄质单体的降 解。

根据本发明，如果皂化反应时间小于15min，则会由于反应时间不够 而造成反应不够充分；如果皂化反应时间大于25min，则会由于长时间的高 温及碱性条件而造成β-隐黄质单体的降解。

(2)将所述冷却后的反应液转移至分液漏斗中，并用20～40重量份的 正己烷反复洗涤反应瓶，洗涤液合并至分液漏斗中，向反应液中加入20～60 重量份的5～15％(重量)的Na₂SO₄溶液，剧烈震荡后，在避光的条件下静 置分离0.8～1.4h，弃去下相，将收集的上层溶液转移至100mL棕色容量瓶 中，用正己烷定容至刻度，准确移取其溶液1mL，离心分离10min，得到 的上清液进行HPLC分析；

根据本发明，5～15％的Na₂SO₄溶液是按照常规方法配制的；

根据本发明，加入Na₂SO₄溶液，是为了去除水解反应后反应液中残留 的未反应的碱及反应产生的皂，并防止因去皂而带走大量β-隐黄质单体而 造成检测结果偏低；

根据本发明，如果所述Na₂SO₄溶液量小于20重量份，则会由于Na₂SO₄ 溶液用量太少而造成碱及皂去除不干净，如果所述Na₂SO₄溶液量大于60 重量份，则会由于Na₂SO₄溶液用量太大而造成一部分β-隐黄质单体转移至 下相而造成损失；

E)HPLC分析

a)β-隐黄质标准溶液配制

(1)准确称取β-隐黄质参比样品1mg，用1mL丙酮溶解后转移至25mL 棕色容量瓶中，正己烷定容至刻度，配制成40μg/mL的储备液。

根据本发明，储备液不能长时间储存。在避光和室温条件下，要求在 24h内使用；在充保护气(如：氩气)、-20℃条件下，要求在72h内使用； 在充保护气、-70℃条件下，要求在一周内使用。参比样品储备液的存放时 间超过上述期限时，再次使用之前须按下述方法测定即时含量。

取0.5mL储备液定容至10mL的正己烷溶液中，在449nm处，以正己烷作 空白，测定其吸光值，连续测定三次取其平均值，按式(2)计算储备液浓 度。在随后的使用中，使用测定值作为溶液浓度。

$x=\frac{100000\times A}{0.5\times A_{1\mathrm{cm}}^{1\%}}---\left(2\right)$

式中：

x＝β-隐黄质储备液的浓度[μg/mL]

A＝吸光值

比色杯光程为1cm时， 溶液浓度为1％(W/V)时的吸光系数为2460。

(2)准确量取配制好的储备液，用逐级稀释法，配制成质量浓度分别 为0.00、0.039、0.078、0.156、0.313、0.625、1.250、2.500、5.000μg/mL 的标准溶液；

b)HPLC分析条件的设定

色谱柱：Diamonsil^TM，5μm，4.6mmx25cm；流动相A：以体积计9∶1的 乙腈-水混合物；流动相B：乙酸乙酯；线性梯度洗脱：流动相B的体积百分 浓度在25min内由0％增加至100％；流速：1.0mL/min；检测波长：450nm； PDA波长范围250nm～550nm；进样量：20μL；

根据本发明，所用到的HPLC为Waters1525系统，配备PDA-2996二极管 阵列检测器

c)标准曲线绘制

使用高效液相色谱仪，在在步骤b)设定的条件下测定步骤a)中配制 的β-隐黄质标准溶液在λ＝450nm处的峰面积，并根据各标准溶液在λ＝450nm 处的峰面积与各标准溶液的浓度做线性回归分析，得到质量浓度-峰面积线 性回归曲线，回归方程为：y＝22655x，R²＝0.997，线性区间为：0.1～5μg/mL。

d)样品中β-隐黄质含量的HPLC测定

使用高效色谱仪，在步骤b)设定的条件下测定样品在λ＝450nm处的 峰面积，根据标准曲线计算样品中β-隐黄质含量。

[有益效果]

酸浆在我国作为药食两用植物有着悠久的历史。其β-隐黄质含量丰富。 检测其所含的β-隐黄质含量是评价其营养品质的重要内容。本方法可以准 确客观地检测出酸浆果实和宿萼中β-隐黄质的含量，将有非常显著的现实 应用意义。

【附图说明】

图1表示皂化反应瓶示意图。

图2参比样品(a)和样品(b)中β-隐黄质组分的电子吸收光谱图。 溶剂：HPLC流动相。

图3是宿萼样品HPLC色谱图。组分鉴定：I＝β-隐黄质。

【具体实施方式】

实施例1

取新鲜的带宿萼的酸浆果实500g，用蒸馏水洗净，立刻用滤纸揩干。 将宿萼与浆果剥离，收集宿萼。将每片宿萼沿长轴均分为二，分别收集两 份宿萼。一份用于测定含水量，另一份用于萃取。将每份宿萼粉碎成细丝。

准确(精确至0.0001g)称取丝状宿萼样品10g，置于表面皿中，放入 60℃烘箱中烘干至恒重。恒重值为样品干重。按照说明书中公开的计算方 法算出游离水含量为9.8％。

准确(精确至0.0001g)称取丝状宿萼样品10g，置于研钵内，加入6g 石英砂及以所述丝状宿萼样品重量计6倍的第一有机溶剂乙醇研磨10min， 静置5min，用滴管小心移出上清液作为“第一萃取溶媒”。随后加入与所 述第一有机溶剂等量的正己烷研磨10min，静置5min，用滴管小心移出上 清液作为“第二萃取溶媒”。之后，反复用正己烷研磨萃取，至上清液和 残渣均为无色。合并第一萃取溶媒和所有的第二萃取溶媒。将合并的萃取 溶媒置于500mL分液漏斗中，加入等量蒸馏水，摇匀后静置30min分层， 收集上层相。用上海振捷实验设备有限公司生产的RE-52A型旋转蒸发仪在 40℃，-0.06MPa，60rpm条件下将上层相蒸干。

用移液管取30mL由正己烷-乙醇-丙酮-甲苯按照体积比10∶6∶7∶7组成的 稀释液加入到旋转蒸发瓶中，震荡1min，至残留物完全溶解。将溶液转移 至所述的皂化反应瓶中。用少许稀释液洗涤旋转蒸发瓶，洗液合并转移至 皂化反应瓶中。向皂化反应瓶中加入9mL重量百分浓度为40％的氢氧化钾 -甲醇溶液，震荡1min后立刻与空气回流管连接，以防止溶剂挥发。将皂化 反应瓶置于56℃±0.5℃的水浴中反应20min。随后在冷水中冷却5min。将 反应液转移至250mL分液漏斗中。用30mL正己烷洗涤反应瓶，洗涤液转 移至分液漏斗中，震荡1min，向其中加入10％Na₂SO₄溶液40mL。剧烈震 荡1min后在暗室静置1h分层，弃去下相，收集上相于100mL棕色容量瓶 中，用正己烷定容至刻度。准确量取定容溶液1mL，10,000rpm离心10min， 取上清液用于HPLC分析。

在C18-HPLC上，测定各参比样品工作液在λ＝450nm处色谱图上β-隐黄 质组分的峰面积，与各样品浓度做线性回归，得到质量浓度-峰面积线性回 归曲线，回归方程：y＝22655x，R²＝0.997，线性区间为：0.1～5μg/mL。

根据样品中β-隐黄质组分的色谱行为(保留时间)和电子吸收光谱特征 (最大吸收波长)与参比样品的比较对其进行定性。图2为参比样品(a) 和样品(b)中β-隐黄质组分的电子吸收光谱图。二者的三个吸收峰均在相 同波长处。图3为宿萼样品在450nm处的HPLC色谱图。与参比样品的HPLC 色谱图相比，二者中β-隐黄质组分的保留时间一致。在450nm的色谱图上计 算β-隐黄质组分的峰面积，根据β-隐黄质的质量浓度-峰面积线性回归曲线， 计算样品中β-隐黄质的含量为1.937mg/g，折合为2.124mg/g干重。

实施例2

取新鲜的带宿萼的酸浆果实500g，用蒸馏水洗净，立刻用滤纸揩干。 将宿萼与浆果剥离，收集宿萼。将每片宿萼沿长轴均分为二，分别收集两 份宿萼。一份用于测定含水量，另一份用于萃取。将每份宿萼粉碎成细丝。

准确(精确至0.0001g)称取丝状宿萼样品10g，置于表面皿中，放入 40℃烘箱中烘干至恒重。恒重值为样品干重。按照说明书中公开的计算方 法算出游离水含量为8.7％。

准确(精确至0.0001g)称取丝状宿萼样品10g，置于研钵内，加入5g 石英砂及以所述丝状宿萼样品重量计8倍的第一有机溶剂甲醇研磨5min， 静置4min，用滴管小心移出上清液作为“第一萃取溶媒”。随后加入与所 述第一有机溶剂等量的正己烷研磨5min，静置4min，用滴管小心移出上清 液作为“第二萃取溶媒”。之后，反复用正己烷研磨萃取，至上清液和残 渣均为无色。合并第一萃取溶媒和所有的第二萃取溶媒。将合并的萃取溶 媒置于500mL分液漏斗中，加入等量蒸馏水，摇匀后静置25min分层，收 集上层相。用上海振捷实验设备有限公司生产的RE-52A型旋转蒸发仪在 40℃，-0.06MPa，60rpm条件下将上层相蒸干。

用移液管取20mL由正己烷-乙醇-丙酮-甲苯按照体积比10∶6∶7∶7组成的 稀释液加入到旋转蒸发瓶中，震荡1min，至残留物完全溶解。将溶液转移 至所述的皂化反应瓶中。用少许稀释液洗涤旋转蒸发瓶，洗液合并转移至 皂化反应瓶中。向皂化反应瓶中加入10mL重量百分浓度为35％的氢氧化 钾-甲醇溶液，震荡1min后立刻与空气回流管连接，以防止溶剂挥发。将皂 化反应瓶置于60℃±0.5℃的水浴中反应15min。随后在冷水中冷却5min。 将反应液转移至250mL分液漏斗中。用20mL正己烷洗涤反应瓶，洗涤液 转移至分液漏斗中，震荡1min，向其中加入5％Na₂SO₄溶液20mL。剧烈震 荡1min后在暗室静置1h分层，弃去下相，收集上相于100mL棕色容量瓶 中，用正己烷定容至刻度。准确量取定容溶液1mL，10,000rpm离心10min， 取上清液用于HPLC分析。

在C18-HPLC上，测定各参比样品工作液在λ＝450nm处色谱图上β-隐黄 质组分的峰面积，与各样品浓度做线性回归，得到质量浓度-峰面积线性回 归曲线，回归方程：y＝22655x，R²＝0.997，线性区间为：0.1～5μg/mL。

根据样品中β-隐黄质组分的色谱行为(保留时间)和电子吸收光谱特征 (最大吸收波长)与参比样品的比较对其进行定性。二者的三个吸收峰均 在相同波长处。宿萼样品在450nm处的HPLC色谱图与参比样品的HPLC色谱 图相比，二者中β-隐黄质组分的保留时间一致。在450nm的色谱图上计算β- 隐黄质组分的峰面积，根据β-隐黄质的质量浓度-峰面积线性回归曲线，计 算样品中β-隐黄质的含量为1.902mg/g，折合为2.083mg/g干重。

实施例3

取新鲜的带宿萼的酸浆果实500g，用蒸馏水洗净，立刻用滤纸揩干。 将宿萼与浆果剥离，收集宿萼。将每片宿萼沿长轴均分为二，分别收集两 份宿萼。一份用于测定含水量，另一份用于萃取。将每份宿萼粉碎成细丝。

准确(精确至0.0001g)称取丝状宿萼样品10g，置于表面皿中，放入 80℃烘箱中烘干至恒重。恒重值为样品干重。按照说明书中公开的计算方 法算出游离水含量为10.1％。

准确(精确至0.0001g)称取丝状宿萼样品10g，置于研钵内，加入8g 石英砂及以所述丝状宿萼样品重量计4倍的第一有机溶剂丙酮研磨15min， 静置8min，用滴管小心移出上清液作为“第一萃取溶媒”。随后加入与所 述第一有机溶剂等量的正己烷研磨15min，静置8min，用滴管小心移出上 清液作为“第二萃取溶媒”。之后，反复用正己烷研磨萃取，至上清液和 残渣均为无色。合并第一萃取溶媒和所有的第二萃取溶媒。将合并的萃取 溶媒置于500mL分液漏斗中，加入等量蒸馏水，摇匀后静置35min分层， 收集上层相。用上海振捷实验设备有限公司生产的RE-52A型旋转蒸发仪在 40℃，-0.06MPa，60rpm条件下将上层相蒸干。

用移液管取40mL由正己烷-乙醇-丙酮-甲苯按照体积比10∶6∶7∶7组成的 稀释液加入到旋转蒸发瓶中，震荡1min，至残留物完全溶解。将溶液转移 至所述的皂化反应瓶中。用少许稀释液洗涤旋转蒸发瓶，洗液合并转移至 皂化反应瓶中。向皂化反应瓶中加入4mL重量百分浓度为45％的氢氧化钾 -甲醇溶液，震荡1min后立刻与空气回流管连接，以防止溶剂挥发。将皂化 反应瓶置于60℃±0.5℃的水浴中反应15min。随后在冷水中冷却5min。将 反应液转移至250mL分液漏斗中。用40mL正己烷洗涤反应瓶，洗涤液转 移至分液漏斗中，震荡1min，向其中加入15％Na₂SO₄溶液60mL。剧烈震 荡1min后在暗室静置1h分层，弃去下相，收集上相于100mL棕色容量瓶 中，用正己烷定容至刻度。准确量取定容溶液1mL，10,000rpm离心10min， 取上清液用于HPLC分析。

在C18-HPLC上，测定各参比样品工作液在λ＝450nm处色谱图上β-隐黄 质组分的峰面积，与各样品浓度做线性回归，得到质量浓度-峰面积线性回 归曲线，回归方程：y＝22655x，R²＝0.997，线性区间为：0.1～5μg/mL。

根据样品中β-隐黄质组分的色谱行为(保留时间)和电子吸收光谱特征 (最大吸收波长)与参比样品的比较对其进行定性。二者的三个吸收峰均 在相同波长处。宿萼样品在450nm处的HPLC色谱图与参比样品的HPLC色谱 图相比，二者中β-隐黄质组分的保留时间一致。在450nm的色谱图上计算β- 隐黄质组分的峰面积，根据β-隐黄质的质量浓度-峰面积线性回归曲线，计 算样品中β-隐黄质的含量为1.949mg/g，折合为2.168mg/g干重。