抗骨髓瘤细胞多克隆抗体及其制备方法

摘要

本发明属于抗体制备与应用领域。具体涉及一种抗骨髓瘤细胞的多克隆抗体及其制备方法与应用。本发明骨髓瘤细胞多克隆抗体是用骨髓瘤细胞免疫动物后制得。本发明骨髓瘤细胞多克隆抗体能用于制备检测或诊断多发性骨髓瘤的试剂中。本发明骨髓瘤细胞多克隆抗体能用于制备治疗多发性骨髓瘤的药物。由于本发明骨髓瘤细胞多克隆抗体是以全骨髓瘤细胞为抗原制备的多克隆抗体，从而能同时针对骨髓瘤细胞表面的多个抗原，有利于增强临床骨髓瘤患者的治疗效果。

说明书

技术领域

本发明属于抗体制备与应用领域。具体涉及一种抗骨髓瘤细胞的多克隆抗体及其制备方法与用途。 

背景技术

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是血液系统第二大常见恶性肿瘤，约占血液恶性肿瘤的10％，占人类恶性肿瘤的1％。我国的年发病率约1/10万人。随着人口的老龄化，我国多发性骨髓瘤的发病率也不断上升。传统的放化疗、自体干细胞移植以及异体移植都很难治愈骨髓瘤。因此急需开发新的治疗药物和寻求新的治疗途径。 

随着各种肿瘤相关抗原在骨髓瘤细胞被鉴定出来，如CD20、CD40、CD52、CD33、CD138、MUC1、HM1.24、CYP1B1、SP17、PRAME、Wilms’tumour 1(WT1)和gp96。靶向骨髓瘤细胞表面特异性抗原的单克隆抗体在多发性骨髓瘤的诊断和治疗中发挥出了重要的作用。已经上市(1997年被美国FDA批准)的抗CD20单克隆抗体(商品名为美罗华，Rituximab)，其治疗骨髓瘤的效果显著。此外，多种单克隆抗体包括SGN-40(anti-huCD40)、anti-CD126(atlezumab)、anti-CD52(alemtuzumab)、MRA(humanizedanti-interleukin-6(IL-6)antibody，atlizumab)、TRM-1(Fully Human TRAIL-R1MoAb)、AHM(anti-HM1.24MoAb)也已进入临床试验阶段。但是，由于骨髓瘤细胞的异质性，以及单克隆抗体靶点的局限性，致使在治疗多发性骨髓瘤时，有时单克隆抗体的效果有限。比如，CD20仅仅在13～22％的病人中检测有表达。因此，并不是所有患者在使用现有的抗体药物后都能产生预期的反应。所以，开发针对肿瘤细胞具有特异性和广谱性的药物将是骨髓瘤治疗领域的重要发展方向。 

与单克隆抗体相比，多克隆抗体可能是一种选择，因为其能同时靶向多个抗原，从而可能同时触发不同的细胞死亡途径。另外，多克隆抗体也能在肿瘤细胞表面达到足够高的密度，有利于与效应细胞表面的Fc受体或者C1q相交联，从而触发抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)和补体依赖的细胞毒作用(Complementdependent cytotoxicity，CDC)效应。而且，多克隆抗体能最小程度地避免由于药物耐受而发生的肿瘤细胞突变体的出现，因为肿瘤细胞同时丢失其表面抗原的几率很低。 

虽然，目前也有研究者尝试用多克隆抗体治疗骨髓瘤，但采用的是抗胸腺细免疫球蛋白(Polyclonal antithymocyte globulins，ATG)和抗淋巴细免疫球蛋白(Polyclonal antilymphocyte globulins，ALG)。目前，已有商品化ATG和ALG，主要用于器官移植免疫排斥反应的治疗。ATG或ALG的制备主要是以T细胞或淋巴细胞作为抗原免疫兔或马而获得，因此，其识别骨髓瘤细胞能力可能不足，在临床应用上可能对高骨髓瘤负担的患者作用有限。所以，开发更有效，高识别能力和广谱的多克隆抗体具有清晰而明确的医学需求。 

发明内容

本发明的目的是提供一种针对活的骨髓瘤全细胞表面特异性抗原的多克隆抗体及其制备方法与用途。 

本发明提供的骨髓瘤细胞多克隆抗体是用骨髓瘤细胞免疫动物后制得， 

进一步的，本发明骨髓瘤细胞多克隆抗体是由以下方法制得： 

a、首次用1×10⁶～5×10⁷个活的骨髓瘤细胞与完全弗氏佐剂免疫动物； 

b、然后每隔7～14天加强免疫一次，加强免疫用不完全弗氏佐剂与活的骨髓瘤细胞混合免疫；每次免疫前均检测血液抗体滴度，当抗体滴度达到1∶10000～50000以上终止免疫； 

c、终止免疫后取血于室温下放置2～3h后于4摄氏度过夜，然后取上清离心得到含骨髓瘤细胞多克隆抗体的血清，从含骨髓瘤细胞多克隆抗体的血清中纯化制得骨髓瘤细胞多克隆抗体。 

其中，上述方法步骤c中从含骨髓瘤细胞多克隆抗体的血清中纯化制得骨髓瘤细胞多克隆抗体的方法为： 

a、将含骨髓瘤细胞多克隆抗体的血清上样于用10倍柱体积的缓冲液A平衡的柱子，柱子填料为Mabselect，再用5倍柱体积的缓冲液A洗柱子；所述缓冲液A为20mM NaH₂PO₄，0.15M NaCl，pH 7.2； 

b、用pH 3.0的0.1M柠檬酸钠作缓冲液B线性梯度洗柱子，直至有洗脱峰的出现； 

c、收集洗脱峰液体，同时用pH8.0、1M的Tris-HCl做中和缓冲液，调节洗脱液至pH7.2左右； 

d、然后将收集的洗脱液用透析袋置于PH7.2的PBS缓冲液在4摄氏下透析，将透析的收集液冻干即得骨髓瘤细胞多克隆抗体。 

本发明还提供了上述骨髓瘤细胞多克隆抗体在制备检测或诊断多发性骨髓瘤的试剂中的用途。 

本发明还提供了上述骨髓瘤细胞多克隆抗体在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的用途。 

本发明还提供了纯化上述骨髓瘤细胞多克隆抗体的方法，该方法为： 

将含骨髓瘤细胞多克隆抗体的血清上样于用10倍柱体积的Buffer A(20mM NaH₂PO₄，0.15M NaCl，pH 7.2pH 9.0)平衡的XK16/40柱子，填料为Mabselect，再用5倍柱体积的BufferA洗柱子； 

用Buffer B(0.1M柠檬酸纳，pH 3.0)线性梯度洗柱，直至有洗脱峰的出现； 

收集洗脱峰液体，同时用中和Buffer(1M Tris-HCl，pH8.0)调节洗脱液pH7.2左右； 

然后将收集的洗脱液用透析袋置于PBS缓冲液(PH7.2)在4摄氏度下透析，将透析的收集液冻干即得骨髓瘤细胞多克隆抗体。 

本发明还提供了制备上述骨髓瘤细胞多克隆抗体的方法，该方法包括以下步骤： 

a、首次用1×10⁶～5×10⁷个活的骨髓瘤细胞与完全弗氏佐剂免疫动物； 

b、然后每隔7～14天加强免疫一次，加强免疫用不完全弗氏佐剂与活的骨髓瘤细胞混合免疫；每次免疫前均检测血清抗体滴度，当抗体滴度达到1∶10000～50000以上终止免疫； 

c、终止免疫后取血于室温下放置2～3h后于4摄氏度过夜，然后取上清离心得到含骨髓瘤细胞多克隆抗体的血清，从血清纯化制得骨髓瘤细胞多克隆抗体。 

进一步的上述方法中所述的从纯化过程为： 

将含骨髓瘤细胞多克隆抗体的血清上样于用10倍柱体积的Buffer A(20mM NaH₂PO₄，0.15M NaCl，pH 7.2pH 9.0)平衡的XK16/40柱子，填料为Mabselect； 

再用5倍柱体积的Buffer A洗柱子；用Buffer B(0.1M sodium citrate，pH 3.0)线性梯度洗柱，直至有洗脱峰的出现；收集洗脱峰液体，同时用中和Buffer(1M Tris-HCl，pH8.0)调节洗脱液pH7.2左右； 

将收集的洗脱液用透析袋置于PBS缓冲液(PH7.2)在4摄氏度下透析，将透析的收集液冻干即得骨髓瘤细胞多克隆抗体。 

本发明以上方法适用各种小鼠或人骨髓瘤细胞作为抗原免疫动物提取血清后用亲和层析制备多克隆抗体。所用的骨髓瘤细胞系可为小鼠MPC-11或人ARH-77细胞，或者其它人骨髓瘤细胞系(如U266、J41MT、ARP-1、OPM1、OPM-2、KM3、RPMI8226等)，或者从临床骨髓瘤患者外周血中分离的骨髓瘤细胞、免疫的目标动物可为本领域制备抗体所用的各种常用动物，如兔、马、牛等。 

本发明的有益效果是：由于本发明是针对活的全骨髓瘤细胞表面抗原制备的多克隆抗体，从而保证了对骨髓瘤细胞的特异性和广谱性，从而有利于对潜在患病风险的检测以及对骨髓 瘤患者的治疗。而且，也对骨髓瘤细胞新的治疗靶点探索奠定了基础。 

附图说明

图1.是本发明用于ELISA结果照片。 

图2.是本发明用于免疫印迹的照片。上样为小鼠骨髓瘤细胞系MPC-11，SP2/0和NS-1细胞全蛋白，从图中可以发现，本发明抗体除了能够有效识别MPC-11蛋白外，还能识别其他小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0和NS-1。 

图3.是本发明用于MPC-11细胞免疫荧光显微照片。 

图4.是本发明用于小鼠骨髓瘤细胞系免疫荧光细胞流式照片。上排小鼠骨髓瘤细胞系，从左到右：MPC-11，SP2/0，NS-1，下排人源骨髓瘤细胞系，从左到右：Raji，U266，ARH-77。 

图5.是多克隆抗体治疗的腹腔肿瘤模型，从图中我们可以看出多克隆抗体治疗组明显抑制MCP-11的生长。 

图6.是多克隆抗体治疗组，对照抗体组和生理盐水组小鼠的心，肝，脾，肺和肾的HE照片，从图中我们可以看出，给予多克隆抗体组小鼠与对照组小鼠相比，主要脏器没有明显的病理学改变。 

图7.是多克隆抗体治疗组，对照抗体组和生理盐水组小鼠的心，肝，脾，肺和肾的HE照片，从图中我们可以看出，给予多克隆抗体组小鼠与对照组小鼠相比，主要脏器没有明显的病理学改变。 

图8.是多克隆抗体对正常小鼠脾细胞的MTT分析，从图中我们可以看出多克隆抗体对于正常小鼠的脾细胞作用与生理盐水和对照抗体处理效果基本一致，未表现出任何的细胞毒性效应。 

具体实施方式

以下结合附图通过具体实施方式对本发明做进一步的阐述。 

细胞系和动物 

骨髓瘤细胞系(小鼠MPC-11或人ARH-77)购于美国ATCC(American TyPe CultureCollection)。 

6-8周龄雌性BALB/c小鼠和新西兰大白兔源于四川大学华西实验动物中心； 

6-8周龄雌性SCID小鼠源于南京大学模式动物中心。 

主要试剂 

Mabselect填料：购自美国GE(通用)公司。 

Hoechest染料：购自德国Hearst(赫司特)公司。 

多聚赖氨酸：购自美国Sigma(西格玛)公司。 

蛋白质分子量标准品：购自加拿大MBI Fermentas(富酶泰斯)公司。 

蛋白质定量试剂(protein assay)购自美国Bio-Rad(伯乐)公司。 

聚偏二氟乙烯PVDF膜：购自瑞士Roche(罗氏公司)公司； 

RPMI1640培养基胎、牛血清(FCS)：购自美国Gibico BRL公司； 

MTT：3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazol ium bromide，3-(4，5)二甲苯噻唑-2，5联苯四唑溴，购自美国Sigma(西格玛)公司； 

辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG：购自北京中山生物技术有限公司，进口分装； 

FITC标记羊抗兔IgG：购自北京中山生物技术有限公司，进口分装； 

DAB显色试剂盒：购自武汉博士德生物工程有限公司； 

其他试剂均为进口或国产分析纯产品。 

实验仪器和设备 

低速离心机：Megaufgel.0，购自德国Heraeus(贺利氏)公司； 

高速离心机：eentriufge5415C，购自德国Eppendorf(艾本德)公司； 

高速低温离心机：Biofuge28RS，购自德国Heraeus(贺利氏)公司； 

超低温冰箱(-80℃)：购自日本Sanyo(三洋)公司； 

恒温培养箱：购自日本Sanyo(三洋)公司； 

纯水仪：EASYPure UF07412，购自Millipore公司(密理博，美国)； 

高压灭菌锅：LaboAut℃lave，购自Sanyo公司(三洋，日本)； 

垂直电泳系统：MiniPROTEAN2&3Cell，购自美国Bio-Rad(伯乐)公司； 

倒置显微镜：Lx50 Olympus，购自日本Olympus(奥林巴斯)公司； 

蛋白纯化系统： explorer，购自美国GE(通用)公司。 

实施例一.兔抗小鼠或人全骨髓瘤细胞的多克隆抗体的制备和鉴定 

1、兔抗小鼠或人全骨髓瘤细胞的多克隆抗体的制备 

运用活的骨髓瘤全细胞(小鼠MPC-11或人ARH-77)与完全弗氏佐剂免疫新西兰大白兔，7～14天后从新西兰大白兔的耳缘静脉取血1ml，凝固后离心取血清，ELISA方法检测多克隆抗体的滴度，为1∶2000，后每隔7～14天用不完全弗氏佐剂与活的全骨髓瘤细胞混合加强免疫，每次免疫前均从耳缘静脉取血1ml，ELISA方法检测抗体滴度。当抗体滴度达到1∶10000～1∶50000以上，从每只新西兰大白兔颈动脉取血80m盛于玻璃三角烧瓶(250ml)，室温下放置2～3h，然后4摄氏度冰箱过夜。次日，吸取三角烧瓶里的上清，2000离心10分钟，取上清，在次10000rpm离心10分钟，取上清进行抗体纯化，或者-80摄氏度冻存至抗体纯化。 

抗体IgG的纯化按照Mabselect说明书进行。简言之，柱子选取XK16/40，填料选用Mabselect。纯化系统运用 explorer系统。结合Buffer A(20mM NaH₂PO₄，0.15M NaCl， pH 7.2)离心收集抗体血清分装，采用Mabselect纯化兔血清中免疫球蛋白IgG，Bio-Rad法测定抗体浓度达20mg/ml，分装后冻干机冻干，并保存-80℃。 

具体纯化方法为： 

用10倍柱子体积的Buffer A(20mM NaH₂PO₄，0.15M NaCl，pH 7.2pH 9.0)平衡XK16/40柱子； 

上样免疫兔血清或者对照空白兔血清(50ml)； 

再用5倍柱体积的BufferA洗柱子； 

用线性梯度Buffer B(0.1M柠檬酸纳，pH 3.0)洗柱，直至有洗脱峰的出现； 

收集洗脱峰液体，然后立即用中和Buffer(1M Tris-HCl，pH8.0)调节洗脱液体pH7.2左右。 

然后将收集的洗脱液用透析袋至于PBS(PH7.2)在4摄氏度层析柜中透析过夜。 

将透析过夜的收集液用冷冻机冻干得到纯化的IgG粉末，-80摄氏度冰箱保存。 

以上方法适用各种小鼠或人骨髓瘤细胞作为抗原免疫动物尤其是兔亲和层析提取多克隆抗体的制备。 

2、兔抗小鼠或人全骨髓瘤细胞的多克隆抗体的鉴定 

1)细胞ELISA：将骨髓瘤细胞按10000的量铺在多聚赖氨酸包被的96孔板里，并将未免疫兔IgG和多克隆抗体(免疫兔IgG)按1∶2000，1∶5000，1∶10000，1∶20000作一抗体梯度，做ELISA；(图1) 

结果见图1，结果表明本发明抗体组结合骨髓瘤细胞能力是对照抗体结合能力的8～10倍，而且具有剂量依赖效应，随着稀释比例的增加抗体组结合骨髓瘤能力有所降低。 

2)免疫印迹：收集10⁶细胞裂解液按不同浓度上样电泳，转膜，5％脱脂奶粉作为封闭液，室温封闭蛋白电转膜1小时，兔抗人全骨髓瘤细胞多克隆抗体浓度为5μg/μl作为一抗，1∶1000～1∶5000稀释，室温孵育2小时或者4℃孵育过夜，1×TBST缓冲液要洗3次，每次5分钟；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG作为二抗，1∶5000稀释，室温孵育60分钟，1×TBST缓冲液摇洗3次，每次5～15分钟，辣根过氧化物底物显色，压片并冲片曝光。 

结果见图2，结果表明多克隆抗体能够有效识别不同的多发性骨髓瘤细胞系，然而从蛋白条带表明多克隆抗体的识别不同骨髓瘤细胞系能力不同(从左到右：MPC-11，SP2/0，NS-1)。 

3)细胞免疫荧光染色：将10⁶细胞用100μl4％多聚甲醛固定，然后涂片于多聚赖氨酸处理过 的载玻片上，10％山羊血清室温封闭细胞1小时，兔抗人全骨髓瘤细胞多克隆抗体浓度为5μg/μl稀释，室温反应30～60分钟，1×PBS摇洗3次，每次5～15分钟；用FITC标记的绿色荧光羊抗兔的二抗1∶500稀释，室温反应30～60分钟，二抗封闭结束前5分钟，hoechest染核，1×PBS摇洗3次，每次5～15分钟；封片镜下观察；(图3) 

结果见图3，结果表明，运用本发明抗体组，在MPC-11细胞表面能够看见绿色荧光，而对照正常兔血清免疫球蛋白则未能见到绿色荧光。因此本发明的抗体能够特异性识别MPC-11细胞表面抗原，而对照正常兔血清免疫球蛋白不能识别。 

4)细胞流式：将对数生长期的骨髓瘤细胞10⁶用兔抗人全骨髓瘤细胞多克隆抗体5μg/μl室温孵育30～60分钟，1×PBS摇洗3次，每次5～15分钟；用FITC标记的绿色荧光羊抗兔的二抗1∶500稀释，室温反应30～60分钟，二抗封闭结束用1×PBS摇洗3次，每次5～15分钟，至少10000个细胞上流式细胞仪检测。(图4) 

结果见图4，灰线代表本发明鼠源或者人源抗体组分别与相对应鼠源或者人源多发性骨髓瘤细胞反应，黑线代表对照抗体分别与鼠源或者人源多发性骨髓瘤细胞反应作为阴性对照，结果表明，本发明抗体组荧光强度均有向右偏移，证明本发明抗体组能有效识别多种多发性骨髓瘤细胞。(上排小鼠骨髓瘤细胞系，从左到右：MPC-11，SP2/0，NS-1，下排人源骨髓瘤细胞系，从左到右：Raji，U266，ARH-77) 

实施例二抗骨髓瘤细胞的多克隆抗体的体内抑瘤效果 

首先将21只Babl/c小鼠腹腔接种10⁶左右的MPC-11细胞，5天后将其分为三个组，空白对照组(PBS)；对照抗体组(未免疫的兔IgG，)；实验组(免疫的兔IgG即多克隆抗体组)，每组7只。然后分别腹腔注射PBS，未免疫兔IgG(200μg/ml)或者多克隆抗体(200μg/ml)，每隔一天注射一次，一共六次。第六次注射后，第二天处死小鼠，尸体解剖计算腹腔内肿瘤结节数。(图5) 

结果见图5，对照抗体和生理盐水组小鼠腹腔结节数明显多于本发明抗体组小鼠腹腔结节数，而且腹腔结节数更大，大小范围在0.2～1.5cm左右，而本发明抗体组小鼠腹腔结节大小范围在0.1～0.6cm左右，结果表明本发明抗体具有明显抑制多发性骨髓瘤在小鼠体内生长的作用。 

实施例三.异种移植抗骨髓瘤细胞的多克隆抗体的体内抑瘤效果 

首先将21只SCID小鼠右背腹部皮下接种10⁶左右的人源多发性骨髓瘤细胞ARH-77，当 能扪及肿瘤结节时将其随机分为三个组，空白对照组(NS)；对照抗体组(未免疫的兔IgG，)；实验组(免疫的兔IgG即多克隆抗体组)，每组7只。然后分别尾静脉注射NS，未免疫兔IgG(200μg/ml)或者多克隆抗体(200μg/ml)100微升，每隔一天注射一次，一共六次。为了验证本发明抗体组对异种移植肿瘤的体内抑制效果，用游标卡尺测量肿瘤体积，每隔一天测量一次，绘制肿瘤生长曲线。 

结果见图6，◆，■，▲分别代表NS，对照抗体和本发明组抗体处理小鼠肿瘤生长体积，结果表明，本发明抗体组处理小鼠能明显抑制肿瘤体内生长。 

实施例四本发明抗骨髓瘤细胞的多克隆抗体安全性评价 

取接受多克隆抗体治疗(200μg/ml)组，与给予对照抗体组和生理盐水组的小鼠的心，肝，脾，肺和肾组织，进行HE染色，观察给予多克隆抗体治疗后主要脏器是否有损伤。进一步通过用MTT方法 

结果见图7，结果表明本发明抗体组小鼠心，肝，脾，肺和肾组织与对照抗体组和生理盐水组相比，并没有明显的病理特征改变。 

取正常小鼠脾细胞，分别给予生理盐水、相同浓度的对照抗体和多克隆抗体(200g/ml)处理，48小时后通过MTT分析，观察多克隆抗体处理对正常小鼠脾细胞的细胞毒性。 

结果见图8，本发明抗体对正常小鼠的脾细胞作用与生理盐水和对照抗体处理效果基本一致，未表现出任何的细胞毒性效应。