部分接种鉴定烟草病毒病抗性的方法

摘要

本发明公开了部分接种鉴定烟草病毒病抗性的方法，包括：(1)择地：选择相对平整、均匀，排灌方便，与周围环境有隔离措施，周围50m内不种植其它茄科作物的地块；(2)种植：每个品种重复种植10株，单行区排列；随机区组，设4个重复；四周设双行保护；(3)接种：在移栽后10～15天，选择气温20℃～30℃、无雨的下午对各小区每个品种进行部分接种；(4)鉴定：根据调查记载、病情指数计算，按相应烟草病害调查、烟草品种抗病性鉴定的行业标准划分烟草品种的抗性等级。本方法有效控制田间发病率在30％～80％，各品种对病毒病抗病、感病特征表现明显，显著提高病毒病田间鉴定准确性；有效解决了传统田间鉴定自然发病或全部接种时，发病率过高过低的问题。

说明书

技术领域

本发明涉及烟草的育种、栽培，具体来说，涉及鉴定烟草病毒病抗性的方法。

背景技术

烟草上发生的主要病毒病包括烟草普通花叶病毒(TMV)病、黄瓜花叶病毒(CMV)病、马铃薯Y病毒(PVY)病等。烟草品种病毒病抗性田间鉴定，是不一种不可替代的抗病性鉴定方法，田间鉴定是烟草品种在自然环境下多种因素综合作用的抗病性表现，是最直接、最真实的抗病性反映。但烟草品种病毒病抗性田间鉴定存在发病率难于控制的问题，烟草品种病毒病抗性田间鉴定通常采用自然发病法、或人工接种病毒法。自然发病法经常出现发病率很低的情况；而人工接种法则会出现全部烟草发病的情况。这两种情况会导致抗病品种与感品种都不发病或都发病，这样就难以准确区分不同品种间的抗病性差异。

中国专利数据库中涉及烟草抗性鉴定的技术方案有200610048657.0号《一种烟草普通花叶病抗性的苗期鉴定方法》、200610048658.5号《一种烟草黑胫病抗性的苗期鉴定方法》、200910094173.3号《一种烟草黑胫病抗性的病圃鉴定方法》、200910094174.8号《一种烟草青枯病抗性的苗期鉴定方法》、200910041164.8号《一种烟草普通花叶病抗性的离体快速鉴定方法》和201010280169.9号《一种烟草黑胫病抗性的苗期恒温水培鉴定方法》等，但迄今为止，未见针对可有效控制田间发病率、多种烟草病毒病抗性田间鉴定的方法专利。

发明内容

本发明的目的在于提供部分接种鉴定烟草病毒病抗性的方法，以控制烟草的田间发病率，解决鉴定烟草品种对病毒病抗性的难题。

本发明提供的部分接种鉴定烟草病毒病抗性的方法，是在田间进行的，具体做法是：(1)择地：选择相对较平整、均匀的地块，该地块满足以下条件：排灌方便，与周围环境有隔离措施，周围50m内不种植烟草以外的其它茄科作物；(2)种植烟草：每个品种每重复种植10株，单行区排列；随机区组，设4个重复；四周设双行保护行；(3)接种：在移栽后的10～15天，选择气温20℃～30℃、无雨的下午对各个小区的每个品种进行部分人工接种，每个品种均按鉴定株数的30％接种(即对田间每行的第2、5、8、株进行人工接种)，注意避免叶面潮湿；(4)鉴定：根据调查记载、病情指数计算，按相应烟草病害调查、烟草品种抗病性鉴定的行业标准划分烟草品种的抗性等级。

发明人指出：接种时间如遇烟草生长缓慢或无适宜天气等问题，可适当推后。

上述第3步中，具体的接种方法是：将已鉴定、纯化的烟草病叶(TMV、CMV、PVY)进行仔细研磨，用双层沙布滤除残渣，最终浓度以病叶质量与水的体积之比计为1∶20；在病毒液中直接加入质量分数为2％经灭菌的600目金刚砂混匀，作为接种时创造微伤口的介质；采用人工摩擦接种法，每株待接种烟株接种3cm以上两片新生叶；接种时，用手托起叶背，用已灭菌砂布蘸已制备的病毒汁液，在叶正面由内侧向外轻轻摩擦接种。

本方法的“部分接种”即是需鉴定抗病性的烟草在田间对部分烟株进行接种。例如一个品种田间种植10株，只对30％的烟草进行接种，即人工接种病毒3株烟，其余7株不接种，由其自然发病。接种的3株烟的作用，一是观察接种烟株是否对接种病毒有抗病性；二是使其成为田间自然传染源，观察其它未接种烟株的抗病性。对需接种烟草的确定，是以这3株烟能成为另外7株烟均等传染源为原则。即接种烟草较为均匀的分布在未接种烟草的中间(以距离计算)。以10株一行为列，通常接种第2、5、8株烟。各品种间接种方法、接种烟株保持一致，各品种间有可比性即可。

发明人指出：病毒接种即是采用人工手段使病毒进入烟草活细胞内，并在烟草细胞内开始繁殖，致使烟草发病的过程。其关键在于使病毒进入“活细胞”。这需要在烟草表皮细胞上制造出一点“微伤口”这些伤口应该是肉眼看不到的，是在活细胞上的伤口，这样的微伤口才能让病毒进入细胞，而细胞也不会死亡，这样才能接种成功。如无伤口则病毒无法侵入、而伤口过大则会使细胞死亡，病毒无法繁殖，这两种情况都会导致接种失败。600目金刚砂是一种极细的无化学作用的颗粒，病毒汁液混入金刚砂后，通过手的摩擦，金刚砂可划破烟草表皮细胞，造成微伤口，使病毒进入活细胞。传统方法是采用400～500目金刚砂，先用金刚砂摩擦叶片划出伤口，再用病毒汁液涂摸接种。600目金刚砂混入病毒汁液一次接种比传统方法减少步骤，并因颗粒细度的提高而使接种效果明显提高。

本发明采用部分接种的方法鉴定烟草病毒病抗病性，可有效控制田间发病率在30％～80％之间，各品种对病毒病抗病、感病特征表现明显，显著提高病毒病田间鉴定准确性。有效解决了传统田间鉴定自然发病或全部接种时，田间发病率过高过低的问题。使用1∶20的烟草病毒汁液，混入600目金刚砂接种，可提高病毒接种成功率及接种效率。

具体实施方式

实施例

2009年贵州省烤烟品种区域试验马铃薯Y病毒(PVY)抗性鉴定，需鉴定烟草品系14份，对照品种2份，计16个品种(系)。

田间试验地在海拔1000m的贵州省烟科所福泉实验基地进行。田间试验设4重复，随机排列，每小区每品种10株。试验地5月20日移栽，除不采摘烟叶外其余管理按田间生产规范进行。

田间鉴定于移栽后18天，对各个小区的每个品种(系)的第2、5、8三株烟草进行病毒汁液人工摩擦接种，作为传染源。每株接种两片叶，接种浓度以病叶质量与水的体积之比计为1∶20。将已鉴定、纯化的PVY病叶进行仔细研磨，用双层沙布滤除残渣，最终浓度以病叶质量与水的体积之比计为1∶20。在病毒液中直接加入2％灭菌600目金刚砂混匀。采用人工摩擦接种的方法，每株待接种烟株接种3cm以上两片新生叶。接种时，用手托起叶背，用已灭菌砂布蘸已制备的病毒汁液，在叶正面由内侧向外轻轻摩擦接种。

田间记载分在打顶后10天一次记载，调查所有烟株，病级分级按相关标准执行。计算病情指数后进行抗病性初判。

病害严重度分级(以株为单位分级调查)：

0级：全株无病。

1级：心叶脉明或轻微花叶，病株无明显矮化。

3级：1/3叶片花叶但叶不变形，或病株矮化为正常株高的3/4以上。

5级：1/3～1/2叶片花叶，或少数叶片变形，或主脉变黑，或病株矮化为正常株高的2/3～3/4。

7级：1/2～2/3叶片花叶，或变形或主侧脉坏死，或病株矮化为正常株高的1/2～2/3。

9级：全株叶片花叶，严重变形或坏死，或病株矮化为正常株高的1/2以上。

病情指数(D)计算公式：

D＝∑(各级病株数×该病级数)×100/(调查总株数×最高级数)

抗性评价分级标准：

免疫  病指为0

抗病  病指为0.1～20

中抗  病指为20.1～40

中感  病指为40.1～60

感病  病指为60.1～80

高感  病指为80.1～100

感病对照的病情指数不低于60时方可认为试验及评价有效。

结果：PVY抗病对照TN90病指为0，对照K326病指为60，实验发病程度属正常范围。在鉴定材料中其余均表现为感病至中感。

各材料鉴定结果见下表：