小麦赤霉病扩展抗性接种鉴定新方法及其应用

摘要

小麦赤霉病(Fusarium head blight，FHB)是世界温暖潮湿和半潮湿地区广泛发生的一种小麦毁灭性病害，培育和推广抗病品种是最有效的防治方法。对小麦材料进行赤霉病抗感表型的准确评价对基因精细定位和培育抗病品种至关重要。目前报道的赤霉病抗性评价方法有自然鉴定法、孢子迷雾鉴定法、土表接种法、组织叶片离体鉴定法和单花滴注法。这些方法在一定程度上都有着缺陷和不足，其中单花滴注法(简称SFI)是目前用于赤霉病抗性接种鉴定最为常见的方法。我们发展了一种新的接种鉴定方法“基部穗轴注射法”（简称BRDI）。BRDI法是在小麦抽穗后，将赤霉菌孢子液注射到穗基部节间内部，根据第1病小穗出现的时间以及接种后第22-25天的病小穗率，综合评价小麦的赤霉病扩展抗性。
　　本研究主要是在温室和大田条件下，在Fhb1近等基因系、已知抗感品种和重组近交系群体中验证优化后的BRDI方法的可行性，从感染率、病小穗率、毒素含量、侵染路径等方面与传统的单花滴注法进行比较，旨在进一步提高赤霉病表型评价方法的可靠性。
　　对温室条件下种植的近等基因系和不同抗感品种用两种接种方法的分析比较发现，BRDI法接种的成功率高达88.2％-100％，SFI法的成功率为30％-77.8％。如果是抗性品种，从接种之日到鉴定之时只有穗轴褐化，但无小穗出现感病症状;如果是感病品种，则在接种后8-12天出现明显可见的感病小穗，但出现的时间因品种而异。BRDI法在判定品种的抗感性上总体优于SFI法，但缺点是无法将抗病品种不同抗性水平的严重度进行分级，而SFI接种方法易出现假抗性（假阴性）结果。BRDI法不能完全替代单花滴注，而是与单花滴注法有很好的互补性，用两种方法同时接种可以大大增加表型鉴定的可靠性。
　　经过对大田RIL群体和回交群体用两种接种方法的分析比较发现，BRDI法的鉴定结果与Fhb1位点标记基因型吻合度都高于SFI法，则BRDI法相较于SFI法更可以有效明确的鉴定该品系是否携带Fhb1或者携带与Fhb1具有相似的功能基因。
　　经过对SFI和BRDI两种不同接种方法下DON浓度和病小穗率差异及其相关性的分析，我们发现BRDI方法下的总体病小穗率低于或显著低于SFI法，但BRDI接种条件下籽粒中仍然积累较高的DON毒素，推测穗轴可能是诱导毒素产生的重要组织，进一步说明病小穗率低的品种，毒素含量未必一定低;进一步以籽粒中DON含量与病小穗率最低、抗性最好的品种NP-77(BSYH)为对照（标准），综合考虑BRDI和SFI两种接种方法下的DON含量与病小穗率，采用基于马氏距离的综合评价方法，分析各个品种与对照之间的差异，实现了对各个品种的综合评价，并筛选到DON含量和病小穗率在两种接种方法下表现为双低型的品种，其中NP-154、NP-89、NP-90、NP-70与NP-77的总体抗性优于苏麦3号。
　　为了了解抗病和感病品种（系）在BRDI法接种下的侵染过程，我们采用带GFP荧光的赤霉菌孢子液接种，结合徒手切片和激光共聚焦技术，观察比较BRDI法侵染抗、感品种（系）的侵染的时空差异，发现皮层细胞在小麦防御反应中可能起重要的作用。
　　BRDI方法最大的优点是不论在大田或温室环境，接种后均无需采取保湿措施，发病的湿度条件由植株自身体内水分来保证，解决了传统单花滴注法鉴定需要套袋或喷雾、喷水等保湿的问题。同时，单花滴注一般只在扬花期进行，需要接种的时间比较集中，劳动强度大;穗轴注射法在小麦抽穗后-扬花期-灌浆早期（扬花后10天内）均可进行，且不会改变评价结果，因此可接种时间弹性大，可有效缓解劳动力紧张等因素。与传统单花滴注法相比，穗轴注射法接种效率更高但成本更低，提高了发病普遍率，并使品种抗、感表型差异最大化，更有利于普通技术人员判断小麦品种的赤霉病扩展抗性。

目录

摘要

第1章 文献综述

1．1 小麦赤霉病概况

1．1．1 小麦赤霉菌的生物学特性

1．1．2 小麦赤霉病危害部位及症状

1．1．3 小麦赤霉病的流行条件

1．1．4 小麦赤霉病病原菌侵染过程

1．2 小麦赤霉病防治方法的研究

1．2．1 农业防治

1．2．2 化学防治

1．2．3 生物防治

1．3 我国小麦赤霉病育种现状

1．4 QTL定位和利用进展

1．5 小麦赤霉病抗源

1．6 抗赤霉病分子育种

1．7 赤霉病表型鉴定和评价体系

1．8 本实验的主要内容、目的及意义

第2章 温室条件下BRDI方法和SFI方法的比较

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 材料的种植

2．2．3 禾谷镰刀菌Fg65菌株的培养和菌液制备

2．2．4 单花滴注法(SFI)接种及鉴定

2．2．5 穗基部茎秆注射法(BRDI)接种及鉴定

2．2．6 严重度分级

2．3．1 2015年度抗病品种两种接种方法的比较

2．3．2 2015年度温室感病品种两种接种方法的比较

2．3．3 2016年度抗病品种两种接种方法的比较

2．3．4 2016年度感病品种两种接种方法的比较

2．3．5 两种方法鉴定结果与已知赤霉病抗性水平品种抗感的吻合度

2．3．6 温室条件下两种接种方法抗感品种之间的差异分析

2．3．7 两年度两种接种方法的相关性分析

2．4 结论与讨论

第3章 大田条件下BRDI方法和SFI方法的比较

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．2．1 材料的种植

3．2．2 材料的接种方法

3．2．3 基因组DNA的提取

3．2．4 基因型分析

3．3 结果与分析

3．3．1 NCL群体表型与基因型的吻合度

3．3．2 两年度NCL群体两种接种方法的相关性分析

3．3．3 RIL群体和回交群体表型与Fhb1标记基因型的吻合度

3．3．4 NCL群体两种接种方法抗感品种之间的差异性分析

3．3．5 回交群体两种接种方法抗感品种之间的差异性分析

3．3．6 不同群体BRDI法鉴定结果与期望值的比较

3．4 结论与讨论

第四章 BRDI和SFI方法下的DON毒素分析

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 试验材料

4．2．2 试验方法

4．3 结果与分析

4．3．1 两种不同接种方法下的DON浓度及病小穗率变异分析

4．3．2 两种不同接种方法下的DON浓度及病小穗率差异分析

4．3．3 基于DON浓度和病小穗率的综合评价

4．4 小结与讨论

第五章 BRDI法接种赤霉菌的细胞学分析

5．1 引言

5．2 材料和方法

5．2．1 植物材料

5．2．2 菌种材料

5．2．4 镜检

5．3 结果分析

5．3．1 菌丝侵染表型鉴定

5．3．2 BRDI方法接种抗感材料的细胞学比较

5．4 结论与讨论

全文结论

参考文献

致谢

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