可用于检测汉赛巴尔通体的17-kDa多肽的重组片段和合成肽

摘要

本发明内容描述了汉赛巴尔通体的重组和合成多肽以及用于检测对汉赛巴尔通体特异的抗体的相关方法和试剂盒。17-kDa多肽、方法和试剂盒可用于检测最近的和/或正在发生的汉赛巴尔通体感染，它们可以用于诊断猫抓病(CSD)。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§1.119(e)要求于2008年8月22日申请的美国临时申请号61/189,802和于2009年5月5日申请的61/215,420的优先权权益，它们的全部公开内容通过引用并入于此。

技术领域

本发明总体上涉及用于检测哺乳动物包括人中的传染原的诊断测定领域。本文公开的具体实施方案包括17-kDa蛋白的新型重组片段和合成多肽，它们可用于汉赛巴尔通体(Bartonella henselae)的检测中。

背景技术

汉赛巴尔通体是猫抓病(CSD)的病原体(Bass等，1997；Branley等，1996；Chomel，2000)并且也可以导致免疫低下患者中的杆菌性血管瘤病(BA)(Arvand等，1998；Asharaf和Letha，2002；Birtles等，1991；Chomel，1996)。CSD常见于被受感染的家猫抓伤或咬伤的儿童和年轻人(Chomel，2000)并且其特征是发热和近卫淋巴结病(regional lymphadenopathy)。正常情况下，该病在约三(3)个月内自行消退。然而，在免疫低下患者中，巴尔通体感染经常表现为更加严重且威胁生命的疾患，包括BA、心内膜炎、脑病和肺病(Margileth和Baehren，1998；Regnery和Tappero，1995)。BA的特征是皮肤和皮下血管病变，其中细菌侵袭内皮细胞导致血管瘤。BA最初描述于感染人免疫缺陷病毒的患者中并且已经延伸至包括患有累及不同器官诸如骨、肝和脾的增生性血管病变的患者(Regnery和Tappero，1995)。

汉赛巴尔通体通过分子和血清学检测进行鉴定(Eskow等，2001)。通过PCR扩增对细菌基因进行分子鉴定仅适用于具有适当设备、专家和质量控制规程的实验室。PCR可用于早期感染期间的检测，其中细菌仍然存在于外周血流中。通过PCR的分子检测被推荐用于手术切除的感染的心脏瓣膜，但对于外周血样品不太灵敏，其原因是病原体生物可利用度低。

血清学目前是用于确定巴尔通体感染的最常用的诊断测试(Houpikian和Raoult，2002，2003；Sander等，2001)。通过培养对此难养生物(fastidiousorganism)进行细菌分离很困难，因为过长的孵育期导致低灵敏度，尤其对于接受抗生素治疗的患者(Agan和Dolan，2002；La Scola和Raoult，1999)。

免疫荧光测定(IFA)是用于检测汉赛巴尔通体接触的最常用的血清学测试。其是高度主观的测试，并且因此易于由那些执行测试的人作出错误的解释。在不同实验室中观察的差异性的灵敏度常常导致血清学结果解释的变化(Amerein等，1996；Bergmans等，1997；Fournier等，2002)。

缺少关于表征汉赛巴尔通体的抗原的信息已经极大地阻碍了开发用于检测汉赛巴尔通体的灵敏的和特异的测定。美国专利号5,736,347描述了17-kDa蛋白的鉴定(Anderson等，1995；Sweger等，2000)，所述蛋白代表汉赛巴尔通体中据信在人中诱发抗体应答的少数已表征的抗原之一。然而，‘347专利未能提供全长17-kDa蛋白的灵敏度和特异性。仅进行了PCR斑点印迹杂交和IFA检测测定，因此不能肯定地确定17-kDa蛋白可能是ELISA测定中的良好的检测抗原，尤其对于IgM。因此，17-kDa蛋白是否能够用作检测IgM应答的抗原远未明确，更不用说17-kDa蛋白上负责免疫原应答的一个或多个结构域。

因此，对于改进的用于检测汉赛巴尔通体的测定和方法一直存在需求。本发明解决了现有技术的不足之处并且提供了出人意料的发现，即17-kDa蛋白C-末端上的长度跨越～10个氨基酸的单个结构域，对于结合获自感染汉赛巴尔通体的患者的IFA血清阳性的血清中存在的抗体是必不可少的。

发明内容

本发明提供了可用于检测汉赛巴尔通体的汉赛巴尔通体的多肽片段。本发明提供了重组和合成多肽以及在检测对汉赛巴尔通体特异的抗体中使用它们的方法。所述多肽、方法和试剂盒可用于检测最近的和/或正在发生的汉赛巴尔通体感染，它们可以用于诊断猫抓病(CSD)。

在一个方面，本发明提供了一种具有如SEQ ID NO：22中所示的氨基酸序列的合成多肽，其中所述合成多肽当在ELISA测定中进行测定时与来自感染汉赛巴尔通体的患者的IFA血清阳性的血清反应且不与IFA血清阴性的血清反应。SEQ ID NO：22的多肽含有10个氨基酸的区段(即，EKLEKSDVRL)，该区段被认为对于SEQ ID NO：22多肽与来自感染汉赛巴尔通体的患者的IFA血清阳性的血清反应但不与IFA血清阴性的血清反应是必不可少的(但非足够的)。

在另一个方面，本发明提供了合成多肽，其中所述合成多肽包含氨基酸置换、缺失或添加。所述置换可以是保守氨基酸置换。所述置换、缺失或添加可以涉及单个氨基酸或多个氨基酸。优选的实施方案包括具有氨基酸置换、缺失或添加的SEQ ID NO：22。更优选地，本发明提供合成多肽的氨基酸修饰(即，SEQ ID NO：24、25、26、27、28、29、30、31和32)。

在另一个方面，本发明提供了具有选自由SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26组成的组的氨基酸序列的合成多肽。

在另一个方面，本发明提供了具有如SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列的合成多肽。

在另一个方面，本发明提供了具有如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的合成多肽。

在另一个方面，本发明提供了具有选自由SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31组成的组的氨基酸序列的合成多肽。

还在另一个方面，本发明提供了一种包含如SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列的重组多肽，其中所述重组多肽当在ELISA测定中进行测定时与来自感染汉赛巴尔通体的患者的IFA血清阳性的血清反应且不与IFA血清阴性的血清反应。

在另一个方面，本发明提供了重组多肽，其中所述重组多肽包含氨基酸置换、缺失或添加。所述置换可以是保守氨基酸置换。所述置换、缺失或添加可以涉及单个氨基酸或多个氨基酸。优选的实施方案包括具有氨基酸置换、缺失或添加的SEQ ID NO：10。更优选地，本发明提供重组多肽的氨基酸修饰(即，SEQ ID NO：42、43、44和45)。

在另一个方面，本发明提供了具有选自由SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43组成的组的氨基酸序列的重组多肽。

在另一个方面，本发明提供了具有如SEQ ID NO：44中所示的氨基酸序列的重组多肽。

在另一个方面，本发明提供了具有如SEQ ID NO：45中所示的氨基酸序列的重组多肽。

还在另一个方面，本发明提供了包含具有如SEQ ID NO：9中所示的核苷酸序列的分离的多核苷酸的载体。所述载体还包含与所述分离的多核苷酸可操作地连接的DNA转录启动子。

在另一个方面，所述载体选自由pET、pENTR和pCR8/GW/TOPO组成的组，且所述启动子选自由lac启动子、trp启动子和tac启动子组成的组。

在另一个方面，本发明提供了包含载体的宿主细胞，所述载体包含具有如SEQ ID NO：9中所示的核苷酸序列的分离的多核苷酸。优选地，所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。示例性的大肠杆菌包括NovaBlue、BL21(DE3)或BL21pLsS(DE3)。

还在另一个方面，本发明提供了一种制备具有如SEQ ID No：10、SEQ IDNO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45中所示的氨基酸序列的重组多肽的方法，其包括以下步骤：

(a)将分离的多核苷酸引入至宿主细胞中，所述分离的多核苷酸具有如SEQID NO：9中所示的多核苷酸序列；和

(b)使所述宿主细胞在培养基中在合适的条件下生长以容许产生所述重组多肽；和

(c)分离所述重组多肽。

在另一个方面，本发明提供了一种检测来自哺乳动物的生物样品中对汉赛巴尔通体特异的抗体的方法。示例性的检测来自哺乳动物的生物样品中对汉赛巴尔通体特异的抗体的方法包括下列的步骤：使根据本公开的重组多肽结合在固相载体上；使结合的重组多肽与所述样品接触，如果所述样品中存在所述抗体，则形成抗体-抗原复合物；洗掉未结合的免疫球蛋白；并检测任何形成的抗原-抗体复合物的存在，诸如通过使这样的复合物与能够引起可视化反应的二抗接触，所述可视化反应诸如底物的颜色改变。

在另一个方面，本发明提供了一种检测来自哺乳动物的生物样品中的汉赛巴尔通体的方法，其包括以下步骤：

(a)将合成多肽固定在固相载体上，其中所述合成多肽具有选自由SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30、SEQID NO：31和SEQ ID NO：32组成的组的氨基酸序列；

(b)将生物样品加入至所述载体上以容许存在于所述生物样品中的抗体结合于所述固定的合成多肽；

(c)洗涤以去除任何未结合的抗体；和

(d)检测所述结合的抗体，

其中所述结合的抗体的存在指示所述哺乳动物被汉赛巴尔通体感染。优选地，所述哺乳动物是人。

还在另一个方面中，本发明提供了一种检测来自哺乳动物的生物样品中的汉赛巴尔通体的方法，其包括以下步骤：

(a)将重组多肽固定在固相载体上，其中所述重组多肽具有如SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列；

(b)将生物样品加入至所述载体上以容许存在于所述生物样品中的抗体结合于所述固定的合成多肽；

(c)洗涤以去除任何未结合的抗体；和

(d)检测结合的抗体，

其中结合的抗体的存在指示所述哺乳动物被汉赛巴尔通体感染。优选地，哺乳动物是人。

在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒。根据示例性实施方案的试剂盒包含根据本公开的肽和在根据本公开的方法中使用所述肽的说明书。

在另一个方面，本发明提供了一种可用于检测汉赛巴尔通体的试剂盒，所述试剂盒包含：

(a)具有如SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列的多肽；和

(b)在ELISA测定中使用所述多肽的说明书。

附图说明

图1描绘了汉赛巴尔通体中17-kDa蛋白的核苷酸和氨基酸序列。

图2描绘了在巴尔通体细菌(Bartonella bacteria)中IV型分泌系统的组装的示意图(摘自Shamaei-Tousi等，J.Bact.186(14)：4796-4801，2004)。根据此模型，virB2蛋白的主体存在于外膜外，并且17-kDa(即，virB5)蛋白包埋在周质膜内部。

图3描绘了显示全长17-kDa蛋白的可接近性图(accessibility plot)。显示了不同重组片段之间的关系和它们的可接近性。

图4描绘了汉赛巴尔通体中17-kDa蛋白的重组片段1的核苷酸和氨基酸序列。

图5是用于克隆和表达其中表达的17-kDa片段的重组多肽的载体的示意图。

图6是pET30EK/LIC载体中的17-kDa片段的1％琼脂糖凝胶分析，显示来自转化的大肠杆菌细胞的环状和线性化质粒DNA样品的移动。

图7描绘了汉赛巴尔通体中17-kDa蛋白的重组片段2的核苷酸和氨基酸序列。

图8描绘了汉赛巴尔通体中17-kDa蛋白的重组片段4的核苷酸和氨基酸序列。

图9描绘了本发明的汉赛巴尔通体中17-kDa蛋白的重组片段3的核苷酸和氨基酸序列。

图10是显示转化的大肠杆菌细胞中重组片段3的诱导表达的考马斯蓝染色的SDS电泳凝胶。

图11描绘了表达后17-kDa重组蛋白片段的纯化图解。

图12是来自小规模纯化重组片段3蛋白的每个步骤的洗脱样品的考马斯蓝染色的SDS PAGE凝胶。

图13是来自大规模纯化重组片段3蛋白的每个步骤的洗脱样品的考马斯蓝染色的SDS PAGE凝胶。

图14A是使用作为包被抗原的重组片段3和IFA阴性血清的ELISA测定的光学读出数据的图。

图14B是使用作为包被抗原的重组片段3和IFA阳性血清的ELISA测定的光学读出数据的图。

图15是比较作为包被抗原的重组片段3与12个IFA阳性血清和6个IFA阴性血清中的全长17-kDa蛋白的ELISA测定的光学读出数据的图。

图16描绘了多种合成多肽和重组17-kDa蛋白片段之间的关系。

图17是用IFA阳性和IFA阴性血清比较作为包被抗原的肽3C(A)和肽3C-CS1(B)的ELISA测定的光学读出数据的图。

图18描绘了图示在ELISA测定中每个患者的血清对(固定的)17-kDa多肽的反应性的散点图(dot plot)((A)描绘了肽3C；(B)描绘了肽3C-CS3；(C)描绘了肽3C-Del；和(D)描绘了肽3C-RD)。

图19是合成多肽3B、3C和3D的受试者工作特征曲线比较(ROC)。

图20是全长17-kDa、重组片段3、合成肽3B、3C和3D的受试者工作特征曲线比较(ROC)。

图21描绘了图示每个患者的血清对合成多肽肽3C(A)和肽3E(B)的反应性的散点图。

图22描绘了NCBI和本发明之间17-kDa片段3的氨基酸序列的比较。

图23描绘了17-kDa片段3及其突变体的氨基酸序列。

图24是通过Kpn I限制性酶线性化的17-kDa片段3突变克隆质粒的琼脂糖凝胶。

图25是显示不同的转化大肠杆菌克隆(A和B)中17-kDa片段3各种突变的诱导表达的考马斯蓝染色的SDS电泳凝胶。

图26是显示17-kDa片段3和突变蛋白(可溶的相对于包含体)的纯化的考马斯蓝染色的SDS PAGE。

图27是显示17-kDa片段3保守突变E(13)D的Ni-NTA纯化的考马斯蓝染色的SDS PAGE。

图28是显示17-kDa片段3保守突变L(16)V的Ni-NTA纯化的考马斯蓝染色的SDS PAGE。

图29是显示17-kDa片段3缺失突变ΔQ(11)的Ni-NTA纯化的考马斯蓝染色的SDS PAGE。

图30是显示17-kDa片段3插入突变+V(17-18)的Ni-NTA纯化的考马斯蓝染色的SDS PAGE。

图31描绘了图示在ELISA测定中每个患者的血清对17-kDa多肽、17-kDa片段3保守突变(固定的)的反应性的散点图((A)描绘了17-kDa全长；(B)描绘了保守突变E(13)D；(C)描绘了保守突变L(16)V；和(D)描绘了所有三种多肽的ROC)。

图32描绘了图示在ELISA测定中每个患者的血清对17-kDa多肽、17-kDa片段3、和缺失突变(固定的)的反应性的散点图((A)描绘了17-kDa全长；(B)描绘了17-kDa片段3；(C)描绘了缺失突变ΔQ(11)；和(D)描绘了所有三种多肽的ROC)。

图33描绘了图示在ELISA测定中每个患者的血清对17-kDa多肽、17-kDa片段3、和插入突变(固定的)的反应性的散点图((A)描绘了插入突变+V(17-18)；(B)描绘了所有三种多肽的ROC)。

具体实施方式

从下面对优选实施方案的描述并结合附图可以更好地理解本发明。对于本领域那些技术人员应当显而易见的是本文提供的本发明的所述实施方案仅是示例性的和说明性的且非限制性的。其改型的大量实施方案被认为包括在本发明及其等同形式的范围内。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献的全部内容通过引用合并。

定义：

贯穿本说明书使用的多个术语应当具有本文给出的定义。

如本文所使用，术语“17-kDa”是指具有如SEQ ID NO：2(登记号YP_034054)中所示的氨基酸序列的多肽。该多肽代表汉赛巴尔通体Houston-1株中的virB5蛋白(IV型分泌性蛋白系统中的12种蛋白质之一)。本发明人显示在ELISA测定中17-kDa多肽结合存在于巴尔通体患者血清中的抗体。

如本文所使用，汉赛巴尔通体Houston-1株中的17-kDa基因具有如SEQ IDNO：1(登记号U23447)中所示的核苷酸序列。

如本文所使用，术语“ELISA”是指“酶联免疫吸附测定”且是一种用于检测样品中抗体或抗原的存在的生化技术。

如本文所使用，术语“IFA”是指免疫荧光测定。“来自患者的IFA血清阳性的血清”是指针对已经感染了汉赛巴尔通体的细胞显示阳性免疫荧光染色的血清(获自患者)。“来自患者的IFA血清阴性的血清”是指针对已经感染了汉赛巴尔通体的细胞显示阴性免疫荧光染色的血清(获自患者)。

如本文所使用，术语“多肽”、“肽”或“蛋白”可互换使用。

如本文所使用，术语“重组多肽”是指经由使用已经通过引入异源核酸被修饰的载体由宿主细胞重组表达的多肽。如本文所使用，“合成多肽”是指经化学合成的多肽(非天然存在的多肽)。为了本发明的目的，这些多肽意在包涵多肽变体，只要它们在ELISA测定中仍然具有结合存在于巴尔通体感染患者中的抗体的能力。本领域普通技术人员要理解的是，这些多肽的氨基酸序列变体可以包括氨基酸的(i)保守置换，(ii)置换，(iii)添加和(iv)缺失。要进一步理解的是，具有充分高的％氨基酸序列同一性(例如，＞90％)的多肽变体意在包涵在本发明的范围内，条件是该多肽保持其抗体结合能力。

如本文所使用，术语“％氨基酸序列同一性”被定义为与17-kDa多肽中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于测定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域熟练技术人员公知的多种方式来实现，例如，使用公共可获得的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。

如本文所使用，术语“哺乳动物”是指哺乳动物纲的任何脊椎动物，其具有或多或少地被毛发遮盖的身体，用来自乳腺的乳抚养幼仔，并且生出活幼仔，不包括产卵的单孔目动物。优选地，哺乳动物是人。

如本文所使用，术语“引物”是指可以通过模板引导的聚合而延伸的核苷酸序列。为了本申请的目的，术语“核苷酸序列”意在包括DNA或其修饰体。

如本文所使用，术语“生物样品”可以包括但不限于来自哺乳动物诸如人或家畜的血液(例如，全血，血清，等)、脑脊液、滑液等。从生物样品中提取核酸对于本领域熟练技术人员来说是已知的。

如本文所使用，术语“ROC”是指受试者工作特征分析(Receiver OperatingCharacteristics Analysis)。ROC分析是用于评价临床检验的标准统计学工具。对于假定为判定阈(即，区分两组响应的截止值)的判别变量的每个观察值ROC根据“灵敏度”和“1-特异性”评估系统的性能。对于ELISA，截止值可以在一定范围的观察值(即，OD₄₅₀nm读数)内变换，并且可以对这些值的每一个建立灵敏度和1-特异性。灵敏度和特异性的最佳配对是在西北方向上具有最大距离的点。

本发明提供了重组多肽和合成多肽，它们当在ELISA测定中测定时与来自感染汉赛巴尔通体的患者的IFA血清阳性的血清反应且不与IFA血清阴性的血清反应。

17-kDa蛋白上的C-末端结构域和抗体识别

在某些实施方案中，17-kDa多肽的蛋白序列通过亲水性分析来表征(例如，Hopp和Woods，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：3824)。17-kDa的亲水性图用来鉴定疏水和亲水区域，其指示隐匿在折叠的多肽内部的区域，和在多肽的外部上可接近的区域。可以使用本领域中可获得的计算机软件程序来实现对预测结构的操作。ELISA测定中抗体结合程度提供关于结构同源性的信息，和关于与用来生成在抗体识别中具有特异性的片段的多肽部分对应的区域的可接近性的信息。

本发明人已经在17-kDa蛋白的C-末端上鉴定了10个氨基酸的区域，该区域拥有所需的结合IFA阳性血清中存在的抗体的能力。在一个实施方案中，本发明提供了具有EKLEKSDVRLA(SEQ ID NO：33)的氨基酸序列的多肽。因此，包含这10个氨基酸残基的多肽代表可以在汉赛巴尔通体的检测中例如，在ELISA测定中使用的活性多肽。SEQ ID NO：33的多肽本身不足以获得结合IFA阳性血清中存在的抗体的能力。然而，SEQ ID NO：22的多肽(其包含SEQ ID NO：33的10个氨基酸)拥有结合IFA阳性血清中存在的抗体的能力。因此，SEQ ID NO：33的10个氨基酸是必不可少的但不足以获得结合IFA阳性血清中存在的抗体的能力。

重组多肽

本发明具体地考虑了重组多肽和合成多肽的表达和制备，它们的特征在于能够结合IFA阳性患者血清中存在的抗体。在一个实施方案中，因此本发明包括具有图1中所示的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)的分离的核酸，和其简并变体，和其片段。由本文所述的核酸表达的重组蛋白包括图1中所示的那些蛋白(SEQ IDNO：2)，以及包含修饰的氨基酸的变体。本文所述的重组蛋白拥有结合IFA阳性血清中存在的抗体(且不与IFA阴性血清反应)的能力，并且它们含有10个氨基酸残基(SEQ ID NO：33)。

在一个实施方案中，本发明提供了包含如SEQ ID NO.10中所示的氨基酸序列的重组多肽。

要理解，这些重组多肽包括变体。一种类型的变体包括重组多肽的氨基酸修饰；诸如，例如，氨基酸的置换、缺失或添加。另一种类型的变体包括SEQ IDNO：10的片段。变体保留了针对来自感染巴尔通体的患者的IFA血清阳性的血清的抗体结合能力并且不与来自感染巴尔通体的患者的IFA血清阴性的血清反应。这样的重组多肽包涵在本发明的范围内。在一个实施方案中，可以采用保守氨基酸置换，例如，用天冬氨酸置换谷氨酸；用亮氨酸置换异亮氨酸；用丙氨酸置换甘氨酸或缬氨酸、或任何不同氨基酸(divergent amino acid)，用组氨酸置换精氨酸或赖氨酸，和用色氨酸置换酪氨酸和/或苯丙氨酸。在另一个实施方案中，可以采用单个氨基酸的添加和缺失。本领域普通技术人员还要理解，在不改变当在ELISA测定中测试时肽结合抗体的能力的情况下，可以从多肽的每一端或两端，或从多肽的内部包含或缺失几个氨基酸。

17kDa的重组表达：载体和宿主

转录和翻译控制序列是DNA调控序列，诸如启动子、增强子、终止子等，它们提供编码序列在宿主细胞中的表达。

当表达控制序列控制和调节DNA序列的转录和翻译时，该DNA序列与该表达控制序列“操作性连接”或“可操作地连接”。术语“操作性连接”包括在要表达的DNA序列前面具有适当的起始信号(例如，ATG)并且保持正确的阅读框从而容许在该表达控制序列的控制下表达该DNA序列并产生由该DNA序列编码的所需产物。如果期望插入至重组DNA分子中的基因不包含适当的起始信号，这样的起始信号可以插入至基因的上游(5′)并位于该基因的阅读框中。

“启动子序列”是能够结合细胞中的RNA聚合酶并且启动下游(3′方向)编码序列的转录的DNA调控区。为了定义本发明的目的，启动子序列通过转录起始位点结合在其3′末端并且向上游(5′方向)延伸以包含以本底之上的可检测水平启动转录所必需的最小数目的碱基或元件。在启动子序列内会发现转录起始位点(例如，通过用核酸酶S1作图方便地确定)，以及负责结合RNA聚合酶的蛋白结合结构域(共有序列)。

在一个实施方案中，本发明提供了本文公开的DNA序列的表达。如本领域中所公知的，DNA序列可以通过将它们操作性地连接至合适的表达载体中的表达控制序列并且采用该表达载体来转化合适的单细胞宿主来表达。当然，本发明的DNA序列与表达控制序列的这种操作性连接包括在DNA序列上游的正确阅读框中提供起始密码子ATG(如果尚未是DNA序列的一部分的话)。可以采用大量的宿主/表达载体组合来表达本发明的DNA序列。例如，可用的表达载体可以由染色体、非染色体和合成DNA序列的区段组成。合适的载体包括pET、pENTR和pCR8/GW/TOPO等。启动子包含lac启动子、trp启动子和tac启动子。

在一个实施方案中，宿主细胞包含载体，所述载体包含本发明的分离的多核苷酸。示例性的宿主细胞包括大肠杆菌(E.coli.)。各种大肠杆菌菌株包括，例如，NovaBlue株、BL21(DE3)或BL21pLsS(DE3)。

要理解的是，并非所有载体、表达控制序列和宿主都将同样良好地发挥作用以表达本发明的DNA序列。然而，在不背离本发明的范围的前提下，本领域熟练技术人员将能够选择适宜的载体、表达控制序列和宿主，无需过多地进行试验来实现所需的表达。例如，在选择载体时，必需考虑宿主，因为载体必需在其中发挥作用。也要考虑载体的拷贝数，控制该拷贝数的能力，和由该载体编码的任何其他蛋白诸如抗生素标志物的表达。在选择表达控制序列时，通常要考虑多种因素。这些因素包括，例如，体系的相对强度，其可控性，和其与待表达的特定DNA序列或基因的相容性，特别地关于可能的二级结构。选择合适的单细胞宿主要考虑，例如，它们与所选择的载体的相容性，它们的分泌特性，它们正确地折叠蛋白的能力，和它们的发酵要求，以及由待表达的DNA序列编码的产物对宿主的毒性，和表达产物的纯化的简易性。考虑到这些和其他因素，本领域熟练技术人员将能够构建多种载体/表达控制序列/宿主组合，这些组合将在发酵时或在大规模动物培养时表达本发明的DNA序列。

合成多肽

本发明提供了合成多肽，所述合成多肽具有结合IFA阳性患者血清中存在的抗体并且不与IFA阴性血清反应的特性。在一个实施方案中，本发明包括具有至少SEQ ID NO：33中所示的氨基酸结构的合成多肽。要理解该合成多肽的长度可以为～10至～30个氨基酸。优选地，合成多肽可以包含15至25个氨基酸。优选合成多肽可以包含18个氨基酸残基。

优选地，合成多肽具有SEQ ID NO：22中所示的氨基酸序列及其变体。合成多肽变体可以包含氨基酸的置换、缺失或添加。优选地，置换可以包括保守氨基酸置换。优选地，缺失或添加可以包括单个氨基酸或若干个氨基酸。在一个实施方案中，合成多肽是SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26、SEQID NO：27、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32。

本文所述的合成蛋白拥有结合IFA阳性血清中存在的抗体(且不与IFA阴性血清反应)的能力，并且它们包含10个氨基酸残基(SEQ ID NO：33)。

ELISA测定

对IFA血清阳性的血清中的抗体结合的检测可以通过本领域中已知的技术来实现，例如，ELISA(酶联免疫吸附测定)、Western印迹等。在一个实施方案中，抗体结合通过检测一抗上的标记来评估。在另一个实施方案中，一抗通过检测二抗或二级试剂与一抗的结合来评估。在另外的实施方案中，标记二抗。本领域中已知有许多方式用于在免疫测定中检测结合，且这些方式包括在本发明的范围内。例如，为了选择重组或合成的多肽的特异性表位，可以在ELISA测定中评估抗体结合，其中所述多肽或其片段包含这样的表位。

采用重组和合成的17-kDa多肽的诊断试剂盒

本发明提供了一种用于诊断CSD的试剂盒。在一个实施方案中，该试剂盒是包含本文所述的重组多肽或合成多肽、包括一抗或二抗在内的检测试剂、和包括酶底物和显色试剂在内的其他必需试剂的ELISA试剂盒。可以与这样的试剂盒一起存在的其他组分包括说明书，所述说明书详细说明了使用本发明的重组/合成多肽对汉赛巴尔通体的检测步骤。本发明的诊断试剂盒还包括阳性和阴性血清对照。本发明的诊断试剂盒开可以用于诊断涉及汉赛巴尔通体的其他感染性疾病诸如杆菌性血管瘤病(bacillary angiomatosis)。

作为说明且不作为限制地提供下列的实施例。

试验研究

实施例1 17-kDa重组片段

17-kDa基因(图1)最初在1995年被克隆(Anderson等，1995)；然而，关于该蛋白的功能了解很少。17-kDa基因位于与土壤杆菌属(Agrobacterium)中的virB毒力操纵子同源的基因簇内(Padmalayam等，2000)。编码的17-kDa蛋白是汉赛巴尔通体中的IV型分泌系统(TIVSS)的一种成分(图2)，并且其是已知介导内皮细胞的侵袭、促炎活化和抗凋亡保护的膜结合蛋白复合物(Schmid等，2004)。从其氨基酸序列(图1)，推断17-kDa蛋白缺少跨膜结构域，不拥有信号序列，并且被认为是一种可溶性蛋白。在汉赛巴尔通体侵袭人内皮细胞后证明在其中有17-kDa蛋白的诱导(Schmiederer等，2001)。设计使用酵母双杂交系统来阐明TIVSS的亚基之间的相互作用的研究证明virB5(即，17-kDa)和virB7之间的物理结合作用(Shamaei-Tousi等，2004)。

以前已经显示全长17-kDa多肽可以在Western印迹(美国专利号5,736,347)和ELISA测定(Loa等，2005)中用于检测对汉赛巴尔通体特异的抗体。因为对此人类病原体鉴定的其他免疫原性抗原非常少，因此对此蛋白的一个或多个表位进行进一步的分析以努力设计更有效的用于检测汉赛巴尔通体感染的方法、测定和试剂盒。

使用电脑模拟(in silico)的方式，生成％可接近性图(Accessibility Plot)(参见，图3)。该图显示了具有高％可接近性的两(2)个区域的图形表示，表明这两个区域可能暴露在17-kDa蛋白表面上。具有高％可接近性的第一个区域包括从约#20至约#80的氨基酸；并且具有高％可接近性的第二个区域包括从约#110至约#140的氨基酸。跨越约#80至约#110氨基酸的区域显示低％可接近性。

基于％可接近性图，制备两个(2)重组片段，并且它们跨越这两个具有高％可接近性的区域。然后在ELISA测定中使用这两个制备的重组片段来测定它们结合感染汉赛巴尔通体的患者(即，IFA血清阳性)中存在的抗体的能力。因为跨越氨基酸#20至#80的区域具有最高的％可接近性，通过PCR克隆制备重组片段1(参见，图3和4；详见下面的实施例2)。片段1跨越氨基酸#13至氨基酸#74(从N末端计)并且含有总计62个氨基酸。片段1的核苷酸和氨基酸序列(分别为SEQID NOs：3和4)绘制在图4中。

另外，制备片段2以跨越高％可接近性区域。片段2跨越氨基酸#63至氨基酸#133。片段2的核苷酸和氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：5和6)描绘在图7中。制备片段4以覆盖低％可接近性区域，作为对照。片段4跨越氨基酸#81至氨基酸#109。片段4的核苷酸和氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：7和8)描绘在图8中。

与片段2相比，制备片段3以覆盖具有高％可接近性的第二区域。片段3含有17-kDa蛋白的C-末端的最后15个氨基酸。当与片段2比较时，片段3缺少片段2的N-末端的14个氨基酸。片段3跨越氨基酸#77至氨基酸#148。片段3的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NOs：9和10)描绘在图9中。

实施例2 17-kDa重组片段的克隆

生成总计四个(4)重组片段(参见，图3)。基于编码17-kDa蛋白(SEQ ID NO 2)的基因的DNA序列(SEQ ID NO 1)，制备四(4)组正向和反向引物以从汉赛巴尔通体的基因组DNA中扩增17-kDa蛋白的4个片段(参见，表1)。每个引物包括5′端和3’端上的LIC延伸以促进定向和框内克隆至pET30Ek/LIC载体中(在下面详述)。表1列举了这四(4)组正向和反向引物的核苷酸序列。

表1 用于生成编码汉赛巴尔通体的17-kDa蛋白的四(4)个重组片段的多核苷酸的引物

使用表1中列举的引物组在聚合酶链式反应(PCR)程序中制备包括编码四(4)个重组片段的多核苷酸的克隆插入物。简言之，对于片段1，基因组汉赛巴尔通体模板DNA在94℃下变性2分钟。然后使用表1中对于片段1列举的引物进行标准的PCR程序，使用30个循环，每个循环在94℃变性30秒，在54℃退火30秒，并且在68℃延伸1分钟。在PCR程序后，样品在68℃下温育10分钟以完成DNA合成。通过琼脂糖凝胶电泳确认预期的扩增子大小为218个碱基对。

对于片段2，使用递减PCR(touchdown PCR)来产生克隆插入物。简言之，基因组汉赛巴尔通体模板DNA在94℃下变性3分钟。然后使用表1中对于片段2列举的引物进行标准的PCR程序，使用多个循环，每个循环在94℃变性30秒，在递减的退火温度下进行30秒，并且在72℃延伸90秒。初次循环中的退火温度为64℃，并且每个循环降低1℃，并且在每个退火温度下重复3次。此过程重复29次；最终的递减退火温度为54℃。在PCR程序后，样品在72℃下温育5分钟以完成DNA合成。通过琼脂糖凝胶电泳确认预期的扩增子大小为245个碱基对。

使用上述对于片段1的相同PCR条件制备片段3的克隆插入物。通过琼脂糖凝胶电泳确认预期的扩增子大小为248个碱基对。

使用上述对于片段2的相同PCR条件制备片段4的克隆插入物。通过琼脂糖凝胶电泳确认预期的扩增子大小为119个碱基对。

如图3和表2中所示，汉赛巴尔通体Houston-1株中的全长17-kDa蛋白由148个氨基酸构成。片段1跨越氨基酸#13至氨基酸#74(从N-末端计)并且含有总计62个氨基酸。片段2跨越氨基酸#63至氨基酸#133并且含有总计71个氨基酸。片段3跨越氨基酸#77至氨基酸#148并且含有总计72个氨基酸。片段4跨越氨基酸#81至氨基酸#109并且含有总计29个氨基酸(参见，图16)。

表2 多肽的氨基酸和核苷酸位置

  蛋白质名称  蛋白质位置(aa)  DNA位置(bp)  17-kDa全长  1-148  1-444  17-kDa片段1  13-74  37-222  17-kDa片段2  63-133  187-399  17-kDa片段3  77-148  229-444  17-kDa片段4  81-109  241-327  合成肽1  15-32  43-96  合成肽3A  81-98  241-294  合成肽3B  111-128  331-384  合成肽3C  131-148  391-444  合成肽3D  123-138  367-414  合成肽3E  139-148  415-444

使用PCR，获得四个(4)片段插入物。使用琼脂糖凝胶电泳，确认片段1的长度为218个碱基对，片段2的长度为245个碱基对，片段3的长度为248个碱基对，且片段4的长度为119个碱基对(参见，图16)。这些片段包括侧翼序列。在用于克隆的制备时使用Wizard PCR Clean-up试剂盒(Promega)去除过多的引物和DNA聚合酶。

对于克隆和表达，选择pET30Ek/LIC载体，因为其能够提供蛋白表达，并且通过His.Bind树脂色谱法提供对表达蛋白的快速纯化。

图5是pET30表达载体的示意图。作为制备性步骤，每种纯化的PCR产物(即，218bp、245bp、248bp和119bp)用T4DNA聚合酶处理以生成与表达载体互补的突出端。简言之，对于每种PCR产物以20μl的最终反应体积制备由纯化的PCR产物、T4DNA聚合酶缓冲液、dATP、DTT和T4DNA聚合酶(LIC-合格的)组成的反应物。通过加入酶开始反应，然后在室温下温育30分钟。为了使反应结束，将反应混合物在75℃下温育20分钟来灭活T4DNA聚合酶。

为了连接pET30载体和Ek/LIC插入物，建立由pET-30Ek/LIC载体、T4DNA聚合酶处理的Ek/LIC插入DNA构成的反应物。反应物初始在室温下温育5分钟。然后加入25mM EDTA，然后将反应物在室温下另外温育5分钟。然后处理的PCR产物与pET30Ek/LIC载体一起温育从而允许退火。

然后连接反应产物转化至NovaBlue大肠杆菌中。简言之，20μl等分试样的NovaBlue大肠杆菌感受态细胞从-80℃中取出。将等分试样在冰上复温数分钟，然后加入1μl复性产物并轻轻搅拌。混合物在冰上孵育5分钟，然后在42℃水浴中加热30秒。下一步，将样品立即放置回冰上2分钟。为了使大肠杆菌从热休克中恢复，加入80μl SOC(在室温下)，并且将混合物在37℃孵育并摇动(250rpm)1小时。最后，转化的大肠杆菌接种至含有30μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上并在37℃下孵育过夜。

使用Wizard Plus SV Minipreps DNA纯化系统(Promega)根据生产厂商推荐的方案从转化的大肠杆菌中分离质粒DNA。DNA质粒的纯度通过光度计读数(OD₂₆₀/OD₂₈₀比率)来鉴定。为了检查质粒DNA的大小，环状DNA用Kpn I线性化或用EcoR I消化。在琼脂糖凝胶电泳中质粒DNA的移动位置通过与标准分子量标志物比较来确认。

如图6中所示，每种重组质粒的线性DNA根据DNA标志物在5-6kb之间移动。此119-248bp对应于预期的克隆大小，因为pET30载体(5,439bp)加上插入物为约5,558-5,687bp。最后，每个片段ORF的每个碱基对通过使用3130遗传学分析仪DNA测序装置进行DNA测序和Lasergene序列比对分析确认正确。

使用对NovaBlue大肠杆菌系统所述的程序将克隆载体转化至表达系统BL21(DE3)大肠杆菌中，不同之处在于将1μl质粒DNA(100ng/μl)与20μl BL21(DE3)大肠杆菌孵育。

实施例3 17-kDa重组片段的表达

使用过夜表达自诱导系统(Overnight Express Autoinduction System)来诱导克隆片段的表达。该系统设计用于高水平蛋白表达并且不需要监测细胞生长。复合培养基制备为1ml OnEx溶液1、2.5ml OnEx溶液2、0.05ml OnEx溶液3、46.45ml LB肉汤和50μl 30mg/ml卡那霉素。在无菌条件下加入用于复合培养基的所有组分并混合。为了开始培养，用pET30-17-kDa片段质粒转化的BL21(DE3)的储备液接种至2ml含卡那霉素的LB肉汤中。起子培养物在37℃下孵育并以250rpm摇动至大约0.5的OD₆₀₀。然后将1ml起子培养物(OD₆₀₀＝0.5)加入至50ml o/n复合培养基上，在37℃下以250rpm摇动约17小时。通过以10,000xg在4℃下旋转10分钟而收获大肠杆菌细胞。在纯化前靶蛋白的表达通过SDSPAGE确认为阳性。

a)片段1、2和4的重组表达失败

出乎意料，片段1不能表达，片段2和4也不能表达。设计这些片段的原因是它们拥有高％可接近性并且预期它们拥有抗体结合位点。对于缺少重组表达的原因排除了低溶解度。失败的确切原因目前尚不知晓；我们推测密码子偏倚(codon bias)或这些片段对大肠杆菌的毒性可能负面地影响了重组表达。因此，这些重组片段可能拥有阻止它们被重组表达的独特特性。

b)片段3的成功重组表达

我们意外地发现使用过夜表达自诱导系统I可以成功地表达片段3。在片段2和片段3之间的多核苷酸序列具有密切的相似性的情况下，完全令人惊奇的发现是仅能表达片段3。

在SDS电泳凝胶中含有His-标签的重组片段3的移动质量为约15kDa(图10)。确定此片段几乎100％的作为不溶的结构存在于胞质包含体中(图10，泳道3&4)。此包含体的形成可能是由于过表达的靶蛋白聚集引起的。为了从大肠杆菌全溶胞产物中纯化诱导的蛋白，用8M尿素变性和溶解包含体沉淀物，并且样品在相同的变性条件(8M尿素)下通过His.Bind树脂柱。

表3给出了转化细胞中重组片段1、2、3和4的表达诱导的定性评估。使用过夜表达自诱导系统I仅成功地表达片段3(表4，图10，泳道1-2)。尝试片段1、2和4的IPTG表达诱导，但也证明是不成功的。

表3 转化细胞中重组17-kDa片段的表达诱导的定性评估

  17-kDa重组多肽  过夜诱导  IPTG诱导  片段1  -  -  片段2  -  -  片段3  +++  ^*NT  片段4  -  -

^*NT＝未检测

实施例4 17-kDa重组片段的纯化

因为重组片段3在BL21(DE3)大肠杆菌中表达后在包含体中形成聚集物，我们采取了步骤来溶解重组片段3蛋白。在变性条件下进行此重组蛋白的纯化。使用镍螯合亲和色谱法经由与末端上的6x his标签(即，组氨酸标签)的相互作用来俘获蛋白。简言之，使用BugBuster MasterMix(Novagen)从细胞中释放重组蛋白。旋转沉淀的细胞沉淀物通过轻轻地吹吸混合重新悬浮在5ml BugBusterMasterMix中。通过将其在BugBuster中温育并在室温下旋转混合20分钟来完成细胞溶解。混合物在4℃下使用SS-34转子以11,800rpm离心20分钟从而从可溶组分中分离不溶部分。可溶级分和不溶级分两者均转移至新试管中用于SDSPAGE分析。

为了纯化包含体(包含聚集的蛋白)，不溶的沉淀物级分重新悬浮在相同体积(5ml)的BugBuster MasterMix中。将混合物轻轻地吹吸至均匀的悬浮液，然后将其在室温下温育5分钟。加入20ml BugBuster MasterMix(1∶10稀释在水中)，然后轻轻地混合悬浮液。不溶级分在4℃下以5,000x g离心15分钟而沉淀。沉淀物重新悬浮在15ml稀释的BugBuster MasterMix中，吹吸混合，并且在4℃下以5,000x g离心15分钟。重复此步骤，然后将沉淀物重新悬浮在10ml不含尿素的结合缓冲液中。纯化的包含体在4℃下以16,000x g离心15分钟而沉淀。向沉淀物中加入2.5ml含8M尿素的结合缓冲液，并且在4℃温育并旋转1至2小时以完全溶解蛋白。不溶物质通过在4℃下以16,000x g离心30分钟而去除。然后将上清液通过His.Bind树脂柱。等分试样的纯化的包含体级分在SDS PAGE凝胶上分析。

在变性条件(8M尿素)下进行靶蛋白的小规模纯化。来自50ml过夜诱导培养物的包含体沉淀物重新悬浮在2.5ml结合缓冲液(8M尿素)中。向此混合物中加入250μl充电制备(charge prepared)的His.Bind淤浆(Novagen)中。在旋转振荡器上在室温下轻轻地混合悬浮液0.5小时。将此溶胞产物-树脂混合物置于柱子中，然后将该柱置于15-ml圆锥形试管中。收集流通物并且保存用于凝胶分析。之后，用2x 1.25ml结合缓冲液(8M尿素)洗涤柱子。然后用2x 1.25ml洗涤缓冲液(8M尿素)洗脱/洗涤柱子。5x 0.125ml含有250mM咪唑的洗脱缓冲液I(8M尿素)通过该柱以从His.Bind树脂中提取重组蛋白。使用0.125ml洗脱缓冲液II(pH 5.9，8M尿素)和0.125ml洗脱缓冲液III(pH 4.5，8M尿素)按顺序进行两个洗脱步骤以确认从His.Bind树脂中完全回收了靶蛋白。

图12给出了对重组片段3蛋白的小规模纯化的每个步骤进行的考马斯蓝染色的SDS凝胶SDS PAGE分析。

在变性条件(8M尿素)下也成功地进行了从包含体大规模纯化片段3。通过向柱子负载1ml His.Bind树脂淤浆来制备His.Bind树脂。树脂用3ml蒸馏的纯水来洗涤。使5ml充电缓冲液(charge buffer)通过，并且树脂用3ml结合缓冲液平衡。

来自500ml过夜(o/n)诱导培养物的包含体沉淀物重新悬浮在15ml结合缓冲液(8M尿素)中。1ml充电制备的His.Bind淤浆加入至此混合物中。在旋转振荡器上在室温下温和地混合悬浮液30分钟。将溶胞产物-树脂混合物负载于置于15-ml圆锥形试管上方的相同柱子上，并且使该混合物流过柱子。用2x 5ml结合缓冲液(8M尿素)洗涤柱子。2x 4ml洗涤缓冲液(8M尿素)通过相同的柱子。用6x 0.5ml洗脱缓冲液I(8M尿素)洗脱重组蛋白。图13是对重组片段3的大规模纯化的每个步骤进行的考马斯蓝染色的SDS凝胶SDS PAGE分析。

在小规模和大规模纯化中，SDS-PAGE分析均显示分子质量为约15kDa的主要蛋白条带，类似于包含与组氨酸标签偶联的重组片段3的预期融合蛋白。

实施例5 17-kDa重组片段的IgG ELISA分析

(I)重组片段1(氨基酸#20至#80)、2(氨基酸#63至#133)和4(氨基酸#81至#109)不能进行蛋白表达

重组片段1跨越17-kDa蛋白上的一个高％可接近性区域，并且重组片段2跨越另一个高％可接近性区域(参见图3)。遗憾的是，这些重组片段的表达没有成功。在可溶或不溶(包含体)级分中均未观察到可检测量的重组片段1和2。采取了多次努力来优化这些重组片段的表达。这包括：(i)改变IPTG浓度；(ii)改变诱导的持续时间；(iii)使用不同的表达系统(即，过夜自诱导表达系统)，该系统使用不同的诱导物(即，葡萄糖)。所有这些尝试证明均不成功。

在分离自用每一种重组片段转化的宿主细胞的质粒上进行菌落PCR以确认宿主细胞被重组载体转化。因为pET30载体携带有卡那霉素抗生素抗性基因，因此在抗生素存在的条件(加入至LB培养基中)下宿主细胞的生长确认这些细胞成功地被重组载体转化。此外，重组片段1和2的成功转化的另一种确认是两种片段的测序。这在正向和反向两个方向上进行，并且确认每个插入物内的开放阅读框(ORF)是正确的且处于his-标签序列的适当的框内。因此，缺少表达不能归因于(1)不能将插入DNA克隆进载体中，(2)未成功地转化宿主细胞，(3)存在框内终止密码子导致产生截短的蛋白(带有或不带有组氨酸标签)。推测无法预测的因素，包括17-kDa蛋白的固有性质，可能是重组片段表达失败的原因。

尽管付出了最多的努力，重组片段1和2没有被表达。这两个重组片段一起跨越了17-kDa蛋白全长的大部分(即，～90％)区域。我们下一步进行了另一次尝试以确定重组片段4(氨基酸#81至#109)(主要是难以接近的氨基酸；参见图3)是否可能拥有抗体结合活性。类似于重组片段1和2，重组片段4不能被表达。

(II)重组片段3(氨基酸#77至#148)

上述的研究清楚地表明重组片段1、2和4不能被表达。鉴于片段1和片段2一起跨越了17-kDa蛋白的全长的大部分区域(133/148；～90％)，得出结论该重组片段方式可能是失败的。

具体地，预期C-末端处的最后15个氨基酸不能挽救被表达的片段2的能力，更不用说这15个氨基酸对抗体结合活性的作用了(即，17-kDa上的活性区域)。

因为15个氨基酸长度太短以致于不能被克隆，因此制备重组片段3。此重组片段包含C-末端处的该15个氨基酸。然后我们在ELISA测定中测试了该片段结合抗体的能力。

在ELISA测定中，纯化的片段3蛋白在包被缓冲液中稀释至250ng/ml的终浓度。通过在每孔中涂布100μl此溶液并在4℃下温育18小时，使抗原粘附在96孔板上。通过用PBST洗涤缓冲液将该板洗涤3次以去除未包被的抗原。洗涤后，在22℃下在各孔中用300μl封闭试剂General Blocker BB1处理1小时完成包被后处理(post-coating)。在每孔1∶100样品稀释缓冲液中的来自100μl血清的一级多克隆抗体在22℃下与包被的抗原反应1小时。用PBST洗涤缓冲液进行5个洗涤步骤后，各孔与100μl过氧化物酶交联的山羊抗人IgG(KPL，在样品稀释缓冲液中从1mg/ml储备液稀释1∶20,000)在22℃下温育30分钟。也用PBST洗涤缓冲液通过5次洗涤步骤去除过量的二抗。反应通过加入100μl底物3，3′5，5′-四甲基联苯胺溶液并在22℃下温育15分钟进行可视化。通过每孔加入100μl 0.5M H₂SO₄终止反应，然后获取OD_450nm测量值。使用MedCalc程序采用二项分布结合95％置信区间计算受试者工作特征曲线(ROC)分析。

意外地发现重组片段3(与片段2稍有不同)(参见图16)能够表达。此外，出人意料的发现是在IgG ELISA中此重组片段结合针对汉赛巴尔通体的抗体。C-末端处的15个氨基酸赋予该17-kDa蛋白其识别阳性血清中的抗体的能力(参见图16)。

图14A和14B给出了重组片段3的ELISA分析结果。在100ng/ml至16ng/ml的包被浓度和1∶100的血清稀释度下IFA血清阳性的血清和IFA阴性血清之间出现显著差异，而当血清稀释1∶200以上时该差异消失。在16ng/ml至500ng/ml的较高包被浓度下重组蛋白区分阳性血清与阴性血清的能力得到增强。从此分析中，确定250ng/ml包被抗原(重组片段3)足以灵敏地特异性鉴定抗体。

实施例6在汉赛巴尔通体的检测中全长17-kDa蛋白与重组片段3的比较

应该注意到此重组片段3在氨基酸位置147处具有突变，该氨基酸不同于野生型17-kDa(登记号：gi|49476013|ref|YP_034054.1|)。具体地，此重组片段3在该位置处具有氨基酸置换(即，谷氨酰胺)，而野生型17-kDa具有为精氨酸的氨基酸(参见，图22)。因此，此重组片段3是突变的重组片段。

此重组片段3当与全长17-kDa蛋白比较时，即使不比其好，也显示相同的结合抗体的能力。

在此系列研究中，使用各种抗原作为包被抗原通过ELISA评价包含12个IFA阳性血清样品和6个IFA阴性血清样品的测试组。图15给出了此ELISA分析的结果。任一种抗原均不与任一个IFA阴性血清样品反应。事实上，在检测阳性血清时重组片段3显示的灵敏度比全长抗原好。在检测高度阳性血清样品的能力方面在17-kDa全长和重组片段3之间没有观察到差异，但在鉴定中度-低度阳性血清样品#4314和#3835时重组片段3证明具有较高的灵敏度。没有一种抗原结合样品#3508中的抗体。

没有预期到重组片段3具有以与全长抗原相同或更高的特异性检测抗体的能力。这些数据表明不存在由片段3以外的结构域产生的位阻效应。17-kDa蛋白似乎仅具有一个单结构域，该单结构域对于抗体结合活性是足够的。

为了进一步表征重组片段3和全长蛋白结合针对汉赛巴尔通体的抗体的可比较能力，47个血清样品(27个IFA阳性血清样品和20个IFA阴性血清样品)组成的更广泛的测试组通过ELISA进行分析。原始数据在统计学软件MedCalc中用ROC曲线比较来分析。ROC曲线的性能分析显示在图20中。17-kDa片段3ROC曲线下面积(AUC)为0.897(95％置信区间，0.773-0.966)，其高于17-kDa全长的AUC(0.853，CI 0.719-0.939)，表明重组片段3与全长17-kDa相比可以是更好的用于ELISA检测的抗原。

实施例7 17kDa重组片段3突变构建

我们使用QuickChange定点诱变试剂盒(Stratagene，CA)构建了片段3的突变体。含有纯化自BL21(DE3)大肠杆菌的片段3的质粒用作PCR模板用于定点诱变研究。使用表4中的引物扩增突变体E(13)D。这些寡核苷酸引物如下通过PCR延伸和扩增：每个循环在95℃变性30秒，在55℃退火1分钟，和在68℃延伸6分钟和30秒，进行16个循环。

为了去除亲代DNA模板，每个PCR反应混合物与DpnI酶在37℃温育1小时。酶处理的产物然后转化至XL1-Blue大肠杆菌中。

完成所有突变体克隆的序列确认，然后转化至BL21(DE3)大肠杆菌中用于表达(参见，图24)。

表4用于生成编码汉赛巴尔通体的17-kDa片段3的四(4)个重组突变片段的多核苷酸的引物

实施例8 17-kDa片段3突变的克隆、表达、纯化和活性研究

我们使用定点诱变方式制备了4个片段3突变体。简言之，我们在高保真PCR反应中通过使用含有所需突变的特异性引物将点突变引入至片段3的N-末端。每个突变体克隆转化至大肠杆菌BL21(DE3)中用于表达。4个突变体：(1)突变体E(13)D，氨基酸#13处的天冬氨酸置换为谷氨酸；(2)突变体L(16)V，氨基酸#16处的缬氨酸置换为亮氨酸；(3)突变体ΔQ(11)，从C-末端删除氨基酸#11(谷氨酰胺)；(4)突变体+V(17-18)，从N-末端在氨基酸#17和氨基酸#18之间插入氨基酸缬氨酸。

所有片段3突变体均在过夜表达自诱导系统中成功地表达。如SDS PAGE中所示，片段3突变体的移动质量为大约15-kDa。在4个突变体中，保守突变E(13)D具有最高诱导水平，而缺失突变ΔQ(11)具有最低诱导水平(参见，图25)。类似于片段3，突变体表达后均存在于包含体内(参见，图26)。因此，我们使用镍螯合亲和色谱法在变性条件(8M尿素)下纯化突变体，方法与对片段3使用的方法相同(参见，图27、28、29和30)。

一组47个人血清在IgG ELISA中用来评价对片段3突变体的灵敏度和特异性。通过交互式点图分析(interactive dot diagram assay)来分析原始数据(图31和32)。片段3定点突变体、保守突变E(13)D和L(16)V、缺失突变ΔQ(11)和插入突变+V(17-18)，与片段3的结合活性相比均具有类似的结合活性(图31、32和33)。在任一种N-末端突变体中没有观察到相对于片段3的抗体结合活性消失。

实施例9 合成多肽研究

基于上述数据，得出结论，在17-kDa的C-末端附近的单结构域可能拥有足以用于抗体结合的表位。为了进一步研究精确的结构域位置，生成重叠单结构域区域的一组合成肽。

基于对相对抗原性的预测设计多肽。初步制备六(6)种合成多肽(表5和图16)。

使用ELISA测定，我们测试了六(6)种合成多肽并且发现肽3C拥有抗体结合活性。其他合成多肽的任一种均没有任何活性。这些数据表明肽3C的氨基酸序列(即，SEQ ID NO：22；EDLQKQLKEKLEKSDVRL)对于抗体结合是必要的并且是充分的。

表5针对17-kDa蛋白的片段3的五(5)种合成多肽

  合成多肽  肽序列  长度  肽1  ISHAKAQTATLTDEYYKK(SEQ ID NO：19)  18aa  肽3A  EQLQALQIELTLLQAQLQ(SEQ ID NO：20)  18aa  肽3B  QAKDTKTKEELREEQTQK(SEQ ID NO：21)  18aa  肽3C  EDLQKQLKEKLEKSDVRL(SEQ ID NO：22)  18aa  肽3D  EEQTQKKHEDLQKQLK(SEQ ID NO：23)  16aa  肽3E  EKLEKSDVRL(SEQ ID NO：33)  10aa

使用一组47个人血清，包括27个IFA阳性和20个IFA阴性血清。使用ROC分析经OD_450nm来分析结合活性(图19和21)。合成肽的ELISA活性概括在表6中。肽3C、3B、3D和3E的AUC分别为0.9、0.5、0.5和0.8(图19和21)。因为肽3C具有高得多的AUC值(P＜0.001)，因此该肽被认为与肽3B、3D和3E相比拥有较高的灵敏度和特异性。因此，抗体识别位点似乎存在于肽3C上(而不存在于肽3B和3D上)。而肽3E(肽3C的C-末端处的10个氨基酸)不足以完成抗体结合。

表6 合成多肽的ELISA活性

  合成多肽  灵敏度  特异性  AUC  肽3A  N/A  N/A  N/A  肽3B  33.3％  90.0％  0.5  肽3C  77.8％  88.2％  0.9  肽3D  85.2％  25.0％  0.5  肽3E  40.7％  88.2％  0.8

N/A：未获得

实施例10 肽3C的氨基酸修饰

在明确17-kDa蛋白的活性区域位于C-末端(即，包含SEQ ID NO：22)上后，通过修饰氨基酸残基来进行研究并且与它们针对存在于感染汉赛巴尔通体的血清阳性患者中的抗体的结合活性相关联。

在此系列研究中，修饰了肽3C上的活性区域的氨基酸组成。肽修饰包括肽3C内氨基酸残基的(i)保守置换，(ii)置换，(iii)缺失，和(iv)添加。总计制备了九(9)个修饰的肽(参见，表7)。

(i)保守置换：肽3C通过保守置换在三个不同的位置处进行修饰；即，谷氨酸(E)用天冬氨酸(D)置换(肽3C-CS1)；亮氨酸(L)用异亮氨酸(I)置换(肽3C-CS2)，或用缬氨酸(V)置换(肽3C-CS3)。

(ii)置换：肽3C通过置换进行修饰。具体地，置换N-末端的八(8)个残基(肽3C-RD1)，和置换C-末端的十(10)个氨基酸残基(肽3C-RD2)。在肽3C-RD中，肽3C的全长(18个残基)被置换。

(iii)添加：肽3C通过添加进一步进行修饰。具体地，肽3C的N-末端延伸四(4)个氨基酸残基(肽3C-Ext1)或七(7)个氨基酸残基(肽3C-Ext2)。

(iv)缺失：肽3C也通过缺失进行修饰。具体地，使来自肽3C的N-末端的第三个位置(即，亮氨酸)缺失。

基于这些数据，得出结论，序列EKLEKSDVRL(SEQ ID NO：33)可代表抗体识别的核心区域。表7概述了此系列研究的所有氨基酸修饰。修饰的肽由GenScript Corporation(Scotch Plains，NJ)商业化制备；确认它们的纯度＞80％(HPLC)并通过质谱确认分子质量。

表7合成肽的氨基酸修饰

AA：氨基酸

实施例11 氨基酸修饰的多肽的ELISA评价

我们采用IgG ELISA测定并评价修饰的肽针对IgG的结合活性。ELISA程序涉及：(i)用不同浓度(例如，0.2-5μg/ml)的修饰的肽在4℃下包被96孔微量滴定板过夜；(ii)加入5％脱脂乳以封闭非特异性结合；(iii)加入患者的血清从而允许形成抗体-抗原复合物；(iv)检测该抗体-抗原复合物。IFA血清阳性的血清用作阳性对照，IFA血清阴性的血清用作阴性对照。使用辣根过氧化物酶进行抗体-抗原复合物的检测。

个体患者研究：

如图17a中所示，如通过OD_450nm测量，肽3C在针对血清阳性的血清(即，患者#4463)的结合方面显示剂量依赖性增加。这些数据表明肽3C的氨基酸序列负责对存在于IFA血清阳性的血清中的抗体的特异性识别。图17b概述了单个氨基酸置换的作用(即，肽3C的N-末端处的E置换为D)。修饰的肽(3C-CS1)与肽3C相比具有相同的结合活性(图17)。同样，在其他位置处的保守置换具有相同的结合活性(即，在3C-CS2中L置换为I和在3C-CS3中L置换为V)(表7)。总之，这些数据显示肽3C的氨基酸序列的保守置换不改变其对抗体的特异性识别。

基于肽3C的N-末端处置换八(8)个氨基酸修饰的肽(3C-RD1)与肽3C相比具有相同的结合活性。相反，全部置换肽3C的C-末端处的十(10)个氨基酸(3C-RD2)完全去除了结合活性(表7)。这些数据显示肽3C的C-末端对于免疫原性识别来自感染汉赛巴尔通体的患者的血清中的抗体是至关重要的。具体地，数据表明肽3C上C-末端的十(10)个氨基酸是重要的(SEQ ID NO：33)。当全长的肽3C用不同的氨基酸置换时(3C-RD)进一步说明了这10个氨基酸的特异性，修饰的3C-RD肽没有结合活性(表7)。

基于在肽3C的N-末端处添加四(4)个或七(7)个氨基酸修饰的肽(3C-Ext1和3C-Ext2)与肽3C相比具有相同的结合活性(表5)。这些数据与我们的假设相一致，我们假设肽3C的C-末端是抗体识别位点。假定肽3C上存在最小的C-末端结构，向N-末端上添加氨基酸似乎是无关的。

此外，肽3C的单个氨基酸缺失(3C-Del)不改变结合活性(表7)。

总之，肽3C可用于检测患者血清中针对汉赛巴尔通体的抗体的存在。使用氨基酸修饰的研究显示肽3C的C-末端对于此活性是至关重要的。

测试组研究：

一组47个人血清在ELISA测定中用来评价对17-kDa蛋白的合成多肽的灵敏度和特异性。此测试组包含27个IFA阳性血清和20个IFA阴性血清。使用的合成多肽包括氨基酸置换(肽3C-CS3)、添加(肽3C-Ext2)和缺失(肽3C-Del)。抗体结合通过OD_450nm来反映，其通过统计学软件MedCalc中的交互式点图来分析。

肽3C-CS3、3C-Ext2、3C-Del与肽3C相比均具有相同的结合活性(图18)。灵敏度为～80％且特异性为～90％。肽3C-RD、3C-RD2不能结合IFA阳性血清中的抗体(图18)。灵敏度为～11％且特异性为0％。因此，氨基酸#139至#148似乎足以用于抗体结合。

实施例12 17-kDa多肽的IgM ELISA评价

对于IgM俘获测定，纯化的重组17-kDa全长蛋白(1mg/ml)使用Sulfo-NHS生物素试剂盒(Pierce，Rockford IL)进行生物素化。MaxiSorp 96孔板(Nunc，Rochester NY)用1μg/ml浓度的处于包被缓冲液(0.015M Na₂CO₃，0.035MNaHCO₃[pH 9.6])中的抗人IgM(KPL，Gaithersburg，MD)包被并在4℃温育过夜。该板用PBS-Tween 20洗涤并用1％牛血清白蛋白(BSA)在室温下封闭。使用IgM阳性和阴性患者血清。血清在1％BSA中用0.05％Tween 20稀释1∶100，然后一式双份地进行试验，并在室温下与板反应1小时。生物素化的重组17-kDa蛋白以处于稀释缓冲液中的1μg/ml加入至板中并且在室温下温育并摇动1小时。链霉亲和素-HRP(Southern Biotech，Birmingham AL)用来检测板，然后用3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)(Moss，Pasadena，MD)显色30分钟。用2M HCl终止反应，并在5-30分钟的时间后记录450nm下的吸光度。

结果显示汉赛巴尔通体的重组17-kDa全长蛋白能够结合IgM IFA-阳性(n＝13)和IFA-阴性(n＝34)患者样品，其灵敏度和特异性值分别为100％和97.1％。使用受试者工作特征(ROC)曲线分析来评价IgM俘获方法的性能。ROC图可以用来比较所有测试，即使测试具有十分不同的截止值。曲线下面积(AUC)的研究评价(1-特异性)和灵敏度的概率，其是这种曲线的重要统计学特征(即，对于灵敏度＝特异性＝100％的样品，AUC将为1.0)。对校准的斜率的ROC分析揭示AUC为0.998(95％CI，0.919-1.000)。

缓冲液组成和试验方案

(i)结合缓冲液

0.5M氯化钠

20mM Tris-Cl

5mM咪唑；

缓冲液pH调节为7.9

(iii)充电缓冲液

50mM NiSO₄

(iii)含有尿素的结合缓冲液

0.5M氯化钠

20mM Tris-Cl

5mM咪唑

8M尿素；

缓冲液pH调节为7.9

(iv)含有尿素的洗涤缓冲液

0.5M氯化钠

20mM Tris-Cl

20mM咪唑

8M尿素；

缓冲液pH调节为7.9

(v)含有尿素的洗脱缓冲液I

0.5M氯化钠

20mM Tris-Cl

250mM咪唑

8M尿素；

缓冲液pH调节为7.9

(vi)含有尿素的洗脱缓冲液II(pH 5.9)

100mM磷酸盐缓冲液

10mM Tris-Cl

8M尿素；

缓冲液pH调节为5.9

(vii)含有尿素的洗脱缓冲液III (pH 4.5)

100mM磷酸盐缓冲液

10mM Tris-Cl

8M尿素；

缓冲液pH调节为4.5

纯化的17-kDa片段3蛋白的缓冲液更换和重折叠

抗原蛋白在含有高浓度尿素和咪唑的洗脱缓冲液中是不稳定的，因此在蛋白纯化后立即进行缓冲液更换步骤是很重要的。我们还不得不将抗原重折叠回其天然结构以进行ELISA测定；此复原过程也需要缓冲液更换。我们进行了多步骤缓冲液更换透析以去除变性剂：处于1ml含有尿素的洗脱缓冲液中的17-kDa片段3蛋白注入至透析盒(分子量截止值为7kDa)中；该透析盒首先被搅拌漂浮在400ml透析缓冲液1(PBS，6M尿素，pH 7.5)中在4℃下2小时，其次在400ml透析缓冲液2(PBS，4M尿素，pH 7.5)中在4℃下2小时，再次在400ml透析缓冲液3(PBS，2M尿素，pH 7.5)中在4℃下2小时，最后在400ml透析缓冲液4(PBS，1M尿素，pH 7.5)中在4℃下2小时。在此我们使用1mol/L尿素来防止抗原蛋白聚集和/或使不正确折叠的蛋白失稳。

IgG ELISA分析

纯化的蛋白在包被缓冲液中稀释至终浓度250ng/ml。通过在每孔中涂布100μl上面制备的溶液并在4℃下温育18小时，使抗原粘附在96孔板上。通过用PBST洗涤缓冲液将该板洗涤3次以去除未包被的抗原。洗涤后，在22℃下在各孔中用300μl封闭试剂General Blocker BB1处理1小时完成包被后处理。然后在每孔1∶100样品稀释缓冲液中的来自100μl血清的一级多克隆抗体在22℃下与包被的抗原反应1小时。用PBST洗涤缓冲液洗涤5次后，各孔与100μl过氧化物酶交联的山羊抗人IgG(KPL，在样品稀释缓冲液中从1mg/ml储备液稀释1∶20,000)在22℃下温育30分钟。也通过用PBST洗涤缓冲液洗涤5次去除过量的二抗。反应通过加入100μl底物3，3′5，5′-四甲基联苯胺溶液并在22℃下温育15分钟进行可视化。最后，通过每孔加入100μl 0.5M H₂SO₄终止反应，然后获取OD_450nm测量值。使用MedCalc程序采用二项分布结合95％置信区间计算受试者工作特征曲线(ROC)分析。

ELISA缓冲液组成

(i)包被缓冲液(pH 9.6)

0.015M Na₂CO₃

0.035M NaHCO₃

(ii)PBST洗涤缓冲液

磷酸盐缓冲盐水

0.05％Tween-20

(iii)样品稀释缓冲液

磷酸盐缓冲盐水

1％BSA

0.05％Tween-20

肽设计

重组片段使用％可接近性图，使用可在Expasy站点(www.EXPASY.org)处获得的Protscale工具进行设计。其他的工具包括使用可在CVC(癌症疫苗中心(Cancer Vaccine Center))生物信息学站点(http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.html)处获得的在线工具的抗原性分布图，使用Kolaskar和Tongaonkar的方法(FEBS Lett.1990Dec 10；276(1-2)：172-172)和使用可在Expasy站点(www.EXPASY.org)处获得的Protscale工具的疏水性分布图。对于化学合成肽设计，采用其他分析工具。为了预测17-kDa片段3的潜在抗原性区域，采用Jameson和Wolf法(市售的计算机程序)。在此方法中，该计算基于抗原的标度，其利用了氨基酸残基的物化性质和它们在经试验已知的区段表位中的出现频率。

前面的详述提供了本发明的示例性实施方案并且包括实施本发明的最佳方式。对实施方案的描述和图示说明仅意在提供本发明的实施例并不以任何方式限制本发明的范围或其保护。

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