汉赛巴尔通体17-kDa蛋白的表达及间接ELISA方法的建立

摘要

为探讨我国猪群中是否存在巴尔通体感染情况,本研究将汉赛巴尔通体17-kDa蛋白基因按大肠杆菌密码子偏嗜性改造后进行全基因人工合成,然后将目的基因克隆到原核表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28a-17kDa,导入大肠杆菌BL21感受态细胞中,进行诱导表达并用Ni-NTA纯化试剂进行纯化;纯化后的蛋白应用his单抗进行鉴定。以17-kDa蛋白作为包被抗原及优化ELISA反应条件,建立检测抗汉赛巴尔通体17-kDa蛋白抗体的间接ELISA方法。结果显示，抗原包被量0.4μg/mL,37℃包被2h后4℃过夜,1％BSA37℃封闭3h,待检血清稀释度1:100后37℃孵育1h,二抗1:15000稀释,37℃作用30 min,抗体临界值为OD450≥0.392判为阳性,OD450≤0.3326判为阴性,介于二者之间为可疑。与猪嗜血支原体、猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪口蹄疫病毒等血清抗体无交叉反应,批间和批内重复性较好,对379份血清样品进行检测,抗体阳性检出率达51.72％。说明该方法可用于汉赛巴尔通体抗体检测和流行病学调查。