Au NPs-CeO2@PANI纳米复合材料及制法和以此材料制作的葡萄糖生物传感器

摘要

本发明公开了一种AuNPs-CeO2@PANI纳米复合材料及制法和以此材料制作的葡萄糖生物传感器。首先以二氧化铈纳米颗粒（CeO2）、苯胺单体(An)和金纳米粒子(AuNPs)复合成AuNPs-CeO2@PANI纳米复合材料，再以AuNPs-CeO2@PANI纳米复合材料固定葡萄糖氧化酶制得葡萄糖生物传感器。本发明制备的纳米复合材料生物相容性好，利于生物酶的固定且制备方法成本低，简单快捷。本发明制作的生物传感器灵敏度高，稳定性好，线性范围宽，具有一定的抗干扰能力，可广泛应用到糖尿病诊断和食品工艺监测等方面。对葡萄糖检测的线性范围为6.2×10-6~2.8×10-3M，检出限为1.0×10-6M。

说明书

技术领域

本发明属于电化学生物传感器及其制作技术领域，具体的说是一种Au NPs-CeO₂@PANI纳米复合材料及制法和以此材料制作的葡萄糖生物传感器。

背景技术

近年来，随着纳米科学的发展和纳米材料制备技术的不断发展，纳米材料以其独特的物理化学特性而被广泛的应用于生物传感器的研制，人们一直致力于寻找具有良好生物相容性的新型纳米材料以提高生物传感器的电化学性能。到目前为止，众多的纳米材料如：Au 、Ag、Pt 等贵重金属以及碳纳米管、导电聚合物薄膜等均已被成功地用于固定葡萄糖氧化酶。在这些纳米材料中，导电聚合物以其能有效的转移电子、稳定性好、易于构建独特的化学结构等优点，成为科学家在生物传感器研究领域关注的热点材料之一。而在导电聚合物中，聚苯胺因合成条件简单，成本低廉，无毒，性能稳定更是成为人们研究热点中的热点。然而，聚苯胺的氧化还原反应只有在酸性环境下才能有效地进行，这就限制了它在生物传感器领域的使用。因而，近年来人们致力于导电聚苯胺与无机纳米材料复合的研究，因为这些复合材料不仅具有优良的电化学性能，而且可以使导电聚苯胺在中性环境下可有效的进行氧化还原反应，这就拓展了导电聚苯胺在生物传感器领域的使用。在与导电聚苯胺复合的无机材料中，纳米半导体材料和金纳米粒子常被关注，这是因为纳米半导体材料具有巨大的比表面积、良好的电子传递和光电催化性质，在固定酶方面，它们可以很好的保持酶的生物活性，并提高了酶活性中心和电极之间的直接电子传递的效率。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种具有良好生物相容性的Au NPs-CeO₂@PANI纳米复合材料。

本发明的第二个目的是提供一种工艺简单、耗材少成本低的制备Au NPs-CeO₂@PANI纳米复合材料的方法。

本发明的第三个目的是提供以Au NPs-CeO₂@PANI纳米复合材料制作的葡萄糖生物传感器。

本发明Au NPs-CeO₂@PANI纳米复合材料的制备方法，是由二氧化铈纳米颗粒（CeO₂）、苯胺单体(An)和金纳米粒子(Au NPs)复合而成。

本发明Au NPs-CeO₂@PANI纳米复合材料的制备方法，由以下步骤组成：

A.制备二氧化铈纳米颗粒和金纳米粒子，用常规方法即可制得；

取30mL 0.15mol/L Ce(NO₃)₃溶液，加入6mL3%H₂O₂，再边搅拌边加入2mol/L氨水，成黄色沉淀，至pH值大于9，使沉淀完全。将此沉淀离心两次，每次约15min。在沉淀中加入稀HNO₃(1mol/L)调pH至1.4，在60℃的水浴温度下进行胶溶，形成浅黄色透明的CeO₂水溶胶。将CeO₂水溶胶蒸干后得到的样品在550℃下焙烧2h，既得纳米CeO₂粉末；

将3 mL柠檬酸三钠溶液（0.034 mol/L）加入到盛有100 mL水的三口烧瓶中，加热至沸腾，搅拌下快速注入1 mL氯金酸溶液（0.024 mol/L），调节热源使反应体系保持微沸，搅拌3~5min，溶液从浅黄色变成无色、灰色，最后变成酒红色，移去热源，停止搅拌，冷却至室温后既得金纳米粒子；

B.将二氧化铈纳米颗粒超声分散在20mL 1 mol·L^-1盐酸溶液中，再加入苯胺单体，超声分散30 min，形成悬浮液X，其中二氧化铈纳米颗粒与苯胺单体摩尔比在1:0.5~2之间；

C.将与苯胺单体摩尔比为1:1的过硫酸铵溶解在5 mL 1 mol·L^-1 盐酸溶液中，形成溶液Y；

D.用滴液漏斗将Y缓慢滴加到X中，在磁力搅拌下反应12 h；反应结束后离心分离，分别用0.1 mol·L^-1盐酸溶液、乙醇和二次水洗涤产物至离心液为无色，60 ℃真空干燥24 h，得到CeO₂@PANI纳米复合材料；

E.将经过步骤D所得的具有核-壳结构的CeO₂@PANI纳米复合材料在浓度为1.0 mg·mL^-1金纳米粒子的溶胶中搅拌12h后，离心分离，并将产物真空干燥，既得Au NPs-CeO₂@PANI纳米复合材料。

本发明Au NPs-CeO₂@PANI纳米复合材料制作的葡萄糖生物传感器，以Au NPs-CeO₂@PANI纳米复合材料固定葡萄糖氧化酶。

一种实施方式是将Au NPs-CeO₂@PANI纳米复合材料、壳聚糖、葡萄糖氧化酶混合均匀后滴于清洁好的基底电极表面，室温放置晾干，从而制得葡萄糖生物传感器。

具体实施方式可以是将Au NPs-CeO₂@PANI纳米复合材料溶于去离子水中，其溶液浓度为0.5~1.5mg/mL，超声1h；将Au NPs-CeO₂@PANI纳米复合材料、1mg/μL葡萄糖氧化酶及质量分数为1.0%壳聚糖按体积比为3:3:1充分混匀后滴于电极表面。其中，二氧化铈纳米颗粒被完全包埋在聚苯胺中，形成核-壳结构；壳层聚苯胺的厚度大约为25 nm，被包埋的二氧化铈纳米颗粒核平均粒径在10 nm左右，金纳米粒子平均粒径为5nm。

本发明制备的纳米复合材料生物相容性良好，利于生物酶的固定。该制备方法工艺简单，耗材少，成本低。

本发明合成Au NPs-CeO₂@PANI纳米复合材料，并将其修饰于电极上，为葡萄糖氧化酶提供较大的固定化表面积，实现了对葡萄糖的直接电化学传感检测，拓宽了对葡萄糖检测的线性范围。

本发明采用Au NPs-CeO₂@PANI纳米复合材料固定生物酶，利用Au NPs-CeO₂@PANI纳米复合材料良好的电催化活性和生物相容性等优势，提高了修饰电极对酶的相容性，制得的传感器有效保持了葡萄糖氧化酶的生物活性，提高了生物传感器的灵敏度、线性范围及稳定性等。从而提高生物传感器的综合性能指标。制得的生物传感器灵敏度高，稳定性好，线性范围宽，具有一定的抗干扰能力，可广泛应用到糖尿病诊断和食品工艺监测等方面。该方法制作的葡萄糖生物传感器对葡萄糖的检测线性范围是6.2×10^-6 ~ 2.8×10^-3M，检出限为1.0×10^-6 M，在实际分析检测方面具有较好的应用前景。

下表一为Au NPs-CeO₂@PANI纳米复合材料与其他常用纳米材料固定葡萄糖氧化酶的检测线性范围对比表。

表一

固定酶所用材料CeO₂聚苯胺纳米管聚苯胺纳米纤维AuNPs-CeO₂@PANI检测线性范围1.39~8.33mM0.01~5.5mM0.01~1mM0.006~2.8mM

通过表一说明Au NPs-CeO₂@PANI纳米复合材料固定葡萄糖氧化酶制作的葡萄糖生物传感器，其检测线性范围较单一材料固定葡萄糖氧化酶制作的葡萄糖生物传感器的宽，而且检测下限低。

附图说明

图1是二氧化铈和苯胺不同配比下制备的Au NPs-CeO₂@PANI纳米复合材料固定葡萄糖氧化酶后在0.2M pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中对葡萄糖催化的循环伏安图。

图2是Au NPs-CeO₂@PANI纳米复合材料的电子透射显微镜图。

图3是Au NPs-CeO₂@PANI纳米复合材料的X射线衍射谱图。

图4是三种材料的傅立叶变换红外光谱（FT-IR）图，其中，a为掺杂态聚苯胺，b为Au NPs-CeO₂@PANI纳米复合材料（CeO₂含量36.5%）c为二氧化铈。

图5是不同修饰电极在0.2M pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中的循环伏安扫描图。

图6是传感器对葡萄糖响应的电流-时间曲线。

具体实施方式

下面的实施例可以进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。

实验过程中使用的水均为二次蒸馏水，实验所用的试剂均为分析纯。实验均在室温下进行。

本实施例所使用的仪器与试剂

复合材料表征：JEM-100SX型电子透射显微镜(日本电子公司)；D/MAX-3C型X射线衍射仪(日本Rigaku公司)；FTS3000FX型的傅立叶变换红外光谱（美国DIGILAB公司），KBr压片。

电化学实验：LK-2005A型电化学工作站（天津兰力科化学电子有限公司），电化学测量采用三电极体系，酶修饰电极为工作电极，铂片电极为对电极，饱和甘汞电极（SCE）为参比电极。

试剂：苯胺单体（An），分析纯（使用前减压蒸馏）；硝酸铈（Ce(NO₃)₃·6H₂O），氯金酸（HAuC1₄），柠檬酸三钠（C₆H₅O₇Na₃·2H₂O），过硫酸铵（(NH₄)₂S₂O₈，APS），盐酸 (HCl)，硝酸 (HNO₃)，乙醇 (C₂H₆O)，以上试剂均购于上海化学试剂厂，均为分析纯；水为二次蒸馏水。壳聚糖（Chitosan），优级纯，购于美国ICN公司；葡萄糖氧化酶（GOD）由本实验室提取，属于常规工艺。

实施例1：制备Au NPs-CeO₂@PANI纳米复合材料，

A、制备二氧化铈纳米颗粒和金纳米粒子；

取30mL 0.15mol/L Ce(NO₃)₃溶液，加入6mL3%H₂O₂，再边搅拌边加入2mol/L氨水，成黄色沉淀，至pH值大于9，使沉淀完全。将此沉淀离心两次，每次约15min。在沉淀中加入稀HNO₃(1mol/L)调pH至1.4，在60℃的水浴温度下进行胶溶，形成浅黄色透明的CeO₂水溶胶。将CeO₂水溶胶蒸干后得到的样品在550℃下焙烧2h，既得纳米CeO₂粉末；

将3 mL柠檬酸三钠溶液（0.034 mol/L）加入到盛有100 mL水的三口烧瓶中，加热至沸腾，搅拌下快速注入1 mL氯金酸溶液（0.024 mol/L），调节热源使反应体系保持微沸，搅拌3~5min，溶液从浅黄色变成无色、灰色，最后变成酒红色，移去热源，停止搅拌，冷却至室温后既得金纳米粒子；

B、取0.103g CeO₂ 纳米颗粒超声分散在20mL 1 mol·L^-1 HCl溶液中，再加入1 mL An（CeO₂与An摩尔比为1:1），超声分散30 min，形成悬浮液X；

C、将2.49 g (NH₄)₂S₂O₈溶解在5 mL 1 mol·L^-1 盐酸溶液中，形成溶液Y；

D、用滴液漏斗将Y缓慢滴加到X中，在磁力搅拌下反应12 h；反应结束后离心分离，分别用0.1 mol·L^-1盐酸溶液、乙醇和二次水洗涤产物至离心液为无色，60℃真空干燥24 h，得到CeO₂@PANI纳米复合材料；

E、将经过步骤D所得的具有核-壳结构的CeO₂@PANI纳米复合材料在浓度为1.0 mg·mL^-1金纳米粒子的溶胶中搅拌12 h后，离心分离，并将产物真空干燥，既得Au NPs-CeO₂@PANI纳米复合材料，其中CeO₂@PANI纳米复合材料与金纳米粒子摩尔比为1:3。

实施例2：以Au NPs-CeO₂@PANI纳米复合材料固定葡萄糖氧化酶制作葡萄糖生物传感器。

（1）直径为2mm的铂基底电极用0.3和0.5μm的Al₂O₃抛光粉打磨成镜面后，依次用丙酮、无水乙醇和去离子水超声清洗5min；

（2）在0.5% H₂SO₄中进行电化学预处理，将（1）中处理好的基底电极在-0.4～+1.0V下以50mV/s的扫速循环伏安扫描30圈至稳定；

（3）将制备好的Au NPs-CeO₂@PANI溶于去离子水中，浓度为1mg/mL，超声1h；取3μL Au NPs-CeO₂@PANI与3μL 1mg/μL葡萄糖氧化酶（GOD）及1μL 1.0%壳聚糖(Chit)，充分混匀后滴于经上述（2）步骤处理好的铂盘电极表面，室温放置晾干，从而制得葡萄糖生物传感器。采用循环伏安技术评估该修饰电极对葡萄糖氧化酶的催化行为，如图1(a)。

图1是CeO₂和An不同配比下制备的Au NPs-CeO₂@PANI纳米复合材料固定葡萄糖氧化酶后在0.2M pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中对葡萄糖催化的循环伏安图。其中，a是CeO₂与An摩尔比为1:1，b是CeO₂与An摩尔比为1:0.5，c是CeO₂与An摩尔比为1:2。

纳米复合材料的表征如下（参见图2-图6）

图2是Au NPs-CeO₂@PANI纳米复合材料的电子透射显微镜（TEM）图。从图中可看出颜色较深的无机物CeO₂纳米颗粒被完全包埋在颜色较浅的无定形的有机物聚苯胺中，形成了核-壳结构；壳层聚苯胺的厚度大约为25 nm，而被包埋的CeO₂核平均粒径在10 nm左右。TEM图中像小蓖麻一样的小黑点为金纳米颗粒，这些金纳米粒子均被牢牢地吸附在聚苯胺的表面。在图中没有观察到有机相与无机相两相分离的现象，这说明无机物CeO₂、Au与有机物PANI之间存在着强相互作用（可以由样品的IR结果得到证实），阻止了两相分离。

据Au NPs-CeO₂@PANI纳米复合材料的合成步骤及TEM图的现象推测CeO₂、Au与PANI三者的复合物应按以下过程形成：首先，苯胺单体被吸附在已分散好的CeO₂纳米颗粒的表面，当加入氧化剂APS时，苯胺单体就在其表面原位聚合形成了具有核-壳结构的CeO₂/PANI复合物。然后，当CeO₂/PANI复合物长时间在金溶胶中浸泡时，采用柠檬酸钠还原法制备的表面带有负电性的金溶胶由于静电作用就很容易吸附到带氨基的聚苯胺表面，最终形成了Au NPs-CeO₂@PANI纳米复合材料。

图3是Au NPs-CeO₂@PANI纳米复合材料的X射线衍射（XRD）谱图。在2θ=15.48°、20.30°和25.10°处出现了宽的衍射峰为结晶态聚苯胺的特征衍射峰；在2θ=28.4°、32.3°、46.7°、55.9°、 58.1°和67.5°处出现的衍射峰与立方晶系CeO₂的标准谱图（JCPDS卡号No.34-0394）一致；另外在2θ=37.1°、 44.2°、 63.4°、和77.8°的四处衍射峰与立方晶系Au的标准谱图（JCPDS卡号No.01-1172）一致，这表明该样品是由聚苯胺、CeO₂和Au组成的。根据Scherrer公式D=kl/βcosθ(k取0.89，l为0.154 nm)，由2θ=28.4°处半峰宽计算出样品中CeO₂粒子的粒径为10.5 nm，这与TEM结果基本一致。

图4是三种材料的傅立叶变换红外光谱（FT-IR）图。其中，a为掺杂态PANI，b为Au NPs-CeO₂@PANI纳米复合材料（CeO₂含量36.5%），c为CeO₂。

在图4c CeO₂的IR谱中，3437 cm^-1附近的吸收峰可归结为吸附水的特征峰；594 cm^-1处及以下的吸收峰为CeO₂中M-O的振动特征吸收峰。在掺杂态PANI的IR谱（图4(a)）中，3446 cm^-1附近的吸收峰对应于N-H伸缩振动，在1571和1487 cm^-1处吸收峰分别对应于醌式环及苯环的C=C伸缩振动，1300 cm^-1为聚苯胺骨架的C-N振动，1247 cm^-1处出现了掺杂态聚苯胺的特征峰，是由C-N 伸缩振动引起，1138 cm^-1处出现的宽而强的吸收峰对应于由质子化过程引起的C-H 面内弯曲振动(N＝Q＝N，N＝N+H-B，B-N+H-B)，812 cm^-1对应于C-H 面外弯曲振动。对比图4(a)和(b)可看到：Au NPs-CeO₂@PANI纳米复合材料的IR光谱与聚苯胺（PANI）基本相似，但所有特征吸收峰均发生了不同程度的红移；而在595 cm^-1处出现的CeO₂特征吸收峰很弱，虽CeO₂含量很高，但因其被PANI包覆而受到影响。以上现象出现，这是由于在CeO₂与PANI复合过程中, 它们之间产生的键合作用使聚苯胺分子链上的电子云密度下降，影响了PANI分子中相结合原子间的振动频率，降低原子间的力常数，链中电子、电荷的离域化作用增强，从而导致复合物中PANI特征吸收峰的红移。

该IR谱图充分证明了利用前述的方法可以成功地实现苯胺单体在CeO₂纳米粒子表面的原位聚合，得到二者之间以化学键结合的CeO₂@PANI纳米复合物。

以Au NPs-CeO₂@PANI纳米复合材料固定葡萄糖氧化酶制作葡萄糖生物传感器的电化学表征

图5是不同修饰电极在0.2M PBS (pH 7.0) 中的循环伏安扫描图，扫速为50mVs^-1。其中，(a) Chit/GOD，(b) Chit/CeO₂-PANI/GOD，(c) Chit/Au-PANI/GOD，(d) Chit/Au-CeO₂-PANI/ GOD。

由图中可看出，GOD修饰的电极没有氧化还原峰（图5(a)），表明酶与电极间的电子转移无法实现；Chit/CeO₂-PANI/GOD及 Chit/Au-PANI/GOD修饰的电极氧化还原峰不明显（图5(b)、(c)），表明这些材料修饰的电极上酶与电极间的电子转移较难实现；而Chit/Au-CeO₂-PANI /GOD 修饰电极出现了对称的氧化还原峰（图5(d)），峰电势分别为在0.55和0.03V，说明此修饰电极使酶与电极间的电子转移容易实现，并且葡萄糖氧化酶在电极上保持了良好的生物活性。Au NPs-CeO₂@PANI 纳米复合材料在中性条件下有良好的氧化还原活性，且有效的实现了酶与电极之间的直接电子转移，这主要是因为聚苯胺能很好的提高氧化还原性酶(葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶等)的活性，将葡萄糖氧化酶固定在聚苯胺膜内能表现出很好的电化学活性，当纳米结构的聚苯胺负载酶时，由于巨大的比表面积给酶提供了一个更大的平台，而本文中合成出的聚苯胺与无机纳米半导体材料CeO₂和金纳米粒子的复合材料不仅使聚苯胺在酶适应的环境中表现出很好的电化学活性而且又兼具了CeO₂和Au两种材料的优点，三者协同作用，使得Au NPs-CeO₂@PANI 纳米复合材料实现酶的高活性固定，能在酶电极之间有效地传递电子，从而提高酶的催化活性，增强传感器的电化学响应。

图6是传感器对葡萄糖响应的电流-时间曲线；插图为电极电流响应与葡萄糖浓度的线性关系图。

图6示出在0.55V电位下底物中连续加入不同浓度葡萄糖时Chit/Au-CeO₂-PANI /GOD修饰电极的计时安培动力学曲线。由图可见，氧化峰电流随着葡萄糖的加入呈台阶式增加，电极电流响应时间为5s，表明Chit/Au-CeO₂-PANI复合膜吸附固定的GOD对葡萄糖具有优良的催化氧化能力，可在电极表面迅速建立氧化还原平衡反应。在6.2×10 ^-6 ~ 2.8×10^-3 M范围内，电极电流响应与葡萄糖浓度呈线性关系（图6插图），检出限为1.0×10^-6M，线性方程：I (μA) = 0.118+5.065C (mM)， 相关系数为0.9968。随着葡萄糖浓度的进一步增加，电流到达平台期，遵从Michaelis-Menten kinetics 动力学方程的特性。

实施例3：制备Au NPs-CeO₂@PANI纳米复合材料，

取0.206g CeO₂ 纳米颗粒超声分散在20mL 1 mol·L^-1 HCl溶液中，再加入1 mL An（CeO₂与An摩尔比为1:0.5），超声分散30 min。其他制备步骤同实施例1。采用循环伏安技术评估该修饰电极对葡萄糖氧化酶的催化行为，如图1(b)。对比图1(a)、(b)，(b)图中峰电流较(a)相比明显较低，这是因为过量的CeO₂的加入，使得复合材料的导电性降低，从而降低了葡萄糖氧化酶对葡萄糖的催化能力。

实施例4：制备Au NPs-CeO₂@PANI纳米复合材料，

取0.103g CeO₂ 纳米颗粒超声分散在20mL 1 mol·L^-1 HCl溶液中，再加入2 mL An（CeO₂与An摩尔比为1:2），超声分散30 min。其他制备步骤同实施例1。采用循环伏安技术评估该修饰电极对葡萄糖氧化酶的催化行为，如图1(c)。对比图1(a)、(c)，(c)图中峰电流较(a)相比也明显较低。苯胺在酸性条件下聚合，过量的苯胺在聚合过程中需要掺杂大量的酸性介质，导致葡萄糖氧化酶处于酸性环境中，抑制了酶的活性，从而使峰电流降低。