高产甘氨酸菌株的筛选及其在腈类化合物转化中的应用

摘要

本发明属生物技术领域，具体涉及高产甘氨酸霉菌的筛选及其在腈类化合物转化中的应用。甘氨酸广泛应用于食品化工医药等领域，采用生物转化方法替代合成法进行甘氨酸生产是国内外发展趋势。本发明提供了一种高产甘氨酸菌株的筛选方法，并首次筛选到了一株高产甘氨酸的霉菌菌株H3，结合形态、生理生化特性以及18S、ITS和28S rDNA基因测序，将其鉴定为尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)。该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏编号CGMCC No.3829)。本发明筛选获得的尖孢镰孢H3具有生长快，转化效率高，生产周期短，应用于工业生产甘氨酸，具有反应条件温和，产率高，生产成本低，环境友好等特点，且产品后处理过程方便快捷，无需使用大量酸或碱。

说明书

技术领域

甘氨酸高产菌株的筛选方法和其应用，本发明涉及利用微生物转化甘氨腈生产甘氨酸的方法，属于生物技术领域。

背景技术

甘氨酸，又称为氨基乙酸，白色无味晶体，无毒，溶于水，不溶于有机溶剂。是常见的20种氨基酸中结构最简单的一种，是中性的脂肪族氨基酸，为人体非必需氨基酸。甘氨酸同时作为世界上用量最大的农药-草甘膦合成的主要原料，其需求量非常大；另外也可作为食品中的调味剂、增香剂以及高血压、肝损伤等药物制备的中间体，在食品、医药及化工等领域应用十分广泛。

目前甘氨酸的生产全部采用化学法，如氯乙酸氨解法，Strecker法等。这些方法存在反应时间长、需高温高压、产品收率较低、产品回收纯化需加入大量酸或碱、工艺较复杂、对环境不友好等特点。如采用氯乙酸氨解法虽然工艺简单、对设备要求不高，但氯化铵等产品难分离，导致甘氨酸产率较低，精制则提高了生产成本，另外作为反应催化剂的乌洛托品无法回收，资源浪费严重；日本MITSUI TOATSU化学公司的专利US5258550公开了以羟基乙腈为原料，在水的存在下与二氧化碳、氨首先于80-120℃预反应0.5-1h，然后在150-200℃进行主反应的甘氨酸化学合成新方法，但该法需高温高压、能耗大、对设备要求较高、环境污染较严重。

随着生物技术的迅猛发展，采用生物转化法制备有机酸或氨基酸正备受关注。因此，通过微生物转化或微生物催化生产甘氨酸的高效、绿色环保工艺的开发显得十分必要，顺应了当前的迫切形势。生物转化法主要是利用微生物游离细胞或纯化酶等催化载体将底物甘氨腈转化为甘氨酸。目前，国外关于生物转化制备甘氨酸已申请了较多专利，但国内尚无生物转化法生产甘氨酸的相关研究报道。国外，日本NITTO化工公司的专利US5238827公开了采用红球菌、节杆菌、乳酪杆菌、肠杆菌等菌属的细菌菌株作为催化酶转化甘氨腈为甘氨酸的方法，ASAHI化学公司的专利WO0148234分别公开了采用不动杆菌、棒杆菌、产碱杆菌、分枝杆菌、红假单胞菌和假丝酵母等细菌及酵母菌属的微生物水解甘氨腈制备甘氨酸的方法以及回收纯化甘氨酸的方法，如，EP1243657，US20030040085，CN1433479，CN1840522。这些都为进一步研究生物转化生产甘氨酸奠定了基础。虽然，国外报道了较多用于生产甘氨酸的菌株，然而未见霉菌，尤其是尖孢镰孢Fusarium oxysporum生产甘氨酸的相关报道。

发明内容

本发明的发明人从土样中分离筛选获得一株产甘氨酸的尖孢镰孢H3，并对这株菌进行了发酵研究。本发明提供的菌株是从国内某化工厂取得土样分离筛选获得一株霉菌，根据生理形态特征，以及18S、ITS和28S rDNA基因序列测定，该菌株分类命名为尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)，编号H3，于2010年5月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3829。

本发明提供的菌株尖孢镰孢(Fusarium oxysporum H3，CGMCC No.3829)的生理形态及分子鉴定特征如下：

菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上采用打孔器接种法接种，孔径0.5cm，在30℃培养4d后菌落直径为4.9cm，平均生长直径为12.2mm/d；培养7d后，菌落边缘呈白色，中间呈紫红色，可产生紫红色色素；在米饭培养基上生长后呈粉红色；气生菌丝生长良好，为疏松的棉絮状，气生菌丝分枝，透明，直径1.6-4.4μm，在气生菌丝上有粘孢团，粘孢团无色，小型分生孢子生于气生菌丝中，假头状着生，小型分生孢子近卵形，无隔，光滑，大型分生孢子镰刀形、椭圆形弯曲。

利用真菌通用引物尖孢镰孢(Fusarium oxysporum H3，CGMCC No.3829)的18S、ITS和28S rDNA基因序列进行PCR扩增，分别得到1768bp、558bp和925bp大小的片段。通过在NCBI网站应用BLAST软件与数据库中的已有序列进行相似性比较分析，得出该菌株的18S rDNA序列与镰孢属Fusarium(AB110910，GQ166777)，冬虫夏草属Cordyceps(AB067700)和赤霉属Gibberella(AB237662，AB250414)有高度的同源性；根据28S rDNA基因序列分析表明它与镰孢属Fusarium(EF590327)具有较高的类似性。因此，根据18S和28S rDNA基因序列分析得出该菌株属于镰孢属Fusarium。由该菌株的ITS序列分析得出，它与尖孢镰孢Fusarium oxysporum(DQ002550)具有100％的同源性。结合形态特征和生理生化特性，将其鉴定为尖孢镰孢(Fusarium oxysporum H3，CGMCC No.3829)。

本发明还提供了一种甘氨酸生产菌的筛选方法，其特征如下：

采集土样，根据甘氨酸与溴百里香酚蓝的显色反应，在平板上挑出具有变色圈的菌株；初筛，将纯化好的菌株转接至营养丰富的液体培养基中，通过纸层析法测定上清液中甘氨酸浓度；复筛，首先进行种子培养，以1％的接种量接入液体培养基，培养结束后采用高效液相色谱法检测转化后上清液中甘氨酸的浓度。

所述土样来源于生产腈类化合物的化工厂厂房周围土壤中，采集5-15cm处的土样。

所述平板筛选方法如下：

取1g土样，放入含有生理盐水的锥形瓶(20mL/250mL)中，剧烈震荡10min，静置；取1mL土壤悬浮液，注入无菌的平板上，往平板中倾注25mL经灭菌并冷却至40-50℃的固体筛选培养基；待培养基完全冷却凝固后，将平板置于恒温培养箱倒置培养，30℃培养3d；挑取产生蓝色变色圈的的单菌落，转接至新鲜的培养基划线分离，转接3-5代。

所述固体筛选培养基的组成为：葡萄糖5.0g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸亚铁0.02g/L、氯化钙0.02g/L、氯化钠1.0g/L、甘氨腈1.0g/L、溴百里香酚蓝0.2g/L、琼脂20.0g/L、pH7.0。

所述初筛方法如下：

培养基组成为：葡萄糖5.0g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸亚铁0.02g/L、氯化钙0.02g/L、氯化钠1.0g/L、甘氨腈1.0g/L、pH7.0；培养方法为：250mL三角瓶装液量25mL，摇床转速120rpm，30℃培养4d；发酵液处理方法为：将发酵液12000rpm离心10min，取出菌体得到发酵上清液用于甘氨酸含量的测定。

所述初筛过程中采用纸层析的方法测定上清液中甘氨酸浓度，纸层析方法如下：

将转化后的发酵液点样于层析滤纸(点样量0.2-1.0μL)上，放置于层析缸中，上行展开。待层析液上行至距滤纸顶端1.0cm左右时，取出置于115℃烘干后，均匀喷洒显色剂，再次放于115℃烘箱中显色5-10min，斑点显出后，剪下甘氨酸显色斑点于带塞的玻璃试管中，用2-5mL的硫酸铜的乙醇溶液洗脱10-30min，然后在紫外分光光度计上测定其吸光值。

所述复筛方法如下：

培养基组成：种子培养基，牛肉膏10.0g/L、蛋白胨10.0g/L、酵母膏10.0g/L、葡萄糖10.0g/L、氯化钠5.0g/L，pH 7.0；

筛选培养基，葡萄糖5.0g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸亚铁0.02g/L、氯化钙0.02g/L、氯化钠1.0g/L、甘氨腈1.0g/L、pH7.0；

培养方法：种子培养方法，250mL三角瓶装液量25mL，摇床转速120rpm，30℃培养3d；液体发酵培养，以1％的接种量将种子接入发酵培养基，

发酵培养方法，250mL三角瓶装液量25mL，摇床转速120rpm，30℃培养4d；培养结束后，取该培养液12000rpm离心10min收集菌体用于生物转化甘氨腈，采用高效液相色谱法检测转化后上清液中生成的甘氨酸浓度。转化液处理方法为：将转化液14000rpm离心15min，取出菌体得到发酵上清液用于甘氨酸含量的测定。

所述过程中甘氨酸采用高效液相色谱法检测，色谱条件为：Agilent 1100型高效液相色谱仪，采用柱前衍生化方式，衍生试剂为邻苯二甲醛(OPA)和氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)，色谱柱为Hypersil AA-ODS C18柱(250×4.6mm，5μm)，柱温40℃，流速为1.0mL/min，紫外检测波长338nm，流动相A相为乙酸钠-醋酸-三乙胺溶液，B相为乙酸钠-醋酸-乙腈-甲醇溶液，洗脱方式采用梯度洗脱。

本发明提供一种甘氨酸生产菌株的应用方法，其特征如下：

将尖孢镰孢(Fusarium oxysporum H3)接入营养丰富的培养基，获得高活性高生物量的发酵液；将发酵

液进行处理，得到菌体，在一定条件下，利用菌体对甘氨腈进行生物转化。

所述营养丰富的培养基组成为：甘油10-20g/L，酵母膏1.0-10g/L，蛋白胨1.0-10g/L，硫酸镁0.1-0.5g/L，磷酸二氢钾1.0-5.0g/L，氯化钠0.5-1.0g/L，硫酸亚铁0.01-0.1g/L，己内酰胺0.5-1.0g/L，pH 5.0-8.0。

所述发酵液的处理方法为：6000-15000rpm离心5-20min，以收集经培养得到的菌体，用0.01-0.5M的磷酸缓冲液(pH 5.0-9.0)，洗涤菌体2-4次，并将菌体重新悬浮于该缓冲液中。

所述甘氨酸底物的制备方法为：配制5-100g/L的甘氨腈溶液，用0.5-5.0M的氢氧化钠或盐酸溶液调节pH至5.0-9.0。

所述生物转化条件为：将菌悬液与底物溶液混匀，控制反应pH保持在5.0-9.0，反应温度保持在20-60℃，转速50-250rpm，反应时间6-48h。

本发明的优点和有益效果：

在甘氨酸生产菌株的筛选过程中首次提出以甘氨腈为唯一氮源、以溴百里香酚蓝作为指示剂的甘氨腈-溴百里香酚蓝固体筛选培养基，建立了快速筛选能转化甘氨腈生产甘氨酸的菌株培养体系和对目的菌株的检测方法；经过初筛、复筛得到一株生产甘氨酸的菌株——尖孢镰孢(Fusarium oxysporum H3，CGMCCNo.3829)，该菌株具有生长周期短，转化效率高，转化周期短等特点，大大降低了甘氨酸的生产成本，特别适合甘氨酸的大规模生产；本工艺还具有反应条件温和，产率高，生产成本低，对环境友好等特点，而且后处理过程无需加入大量酸或碱，产品分离及应用方便快捷。

附图说明：

图1是本发明提供的菌株Fusarium oxysporum H3发酵过程中生物量和酶活的变化过程。

具体实施方式

实施例1  尖孢镰孢(Fusarium oxysporum H3)的分离鉴定以及菌株的保存

(1)尖孢镰孢(Fusarium oxysporum H3)的富集筛选过程。

采集腈类化合物生产厂房周围的土样，采样时先用小铲子去除表层土，采集5-15cm处的土样。取1g土样，放入含有生理盐水的锥形瓶(20mL/250mL)中，剧烈震荡10min，静置。取1mL土壤悬浮液，注入无菌的平板上，往平板中倾注25mL经灭菌并冷却至40-50℃的固体筛选培养基。待培养基完全冷却凝固后，将平板置于恒温培养箱倒置培养，30℃培养3d。固体筛选培养基的组成为：葡萄糖5.0g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸亚铁0.02g/L、氯化钙0.02g/L、氯化钠1.0g/L、甘氨腈1.0g/L、溴百里香酚蓝0.2g/L、琼脂20.0g/L、pH 7.0，产生蓝色变色圈的单菌落为甘氨酸产生菌。挑取产生蓝色变色圈的的单菌落，转接至新鲜的培养基划线分离，转接3-5代。

挑取25株纯化好的菌株转接至营养丰富的液体培养基中进行培养。液体筛选培养基的组成为：葡萄糖5.0g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸亚铁0.02g/L、氯化钙0.02g/L、氯化钠1.0g/L、甘氨腈1.0g/L、pH 7.0，装液量25mL/250mL，摇床转速120rpm，30℃培养4d。培养结束后离心去除菌体，采用纸层析法测定上清液中的甘氨酸浓度。

再进行复筛，首先进行种子培养，以1％的接种量接入液体培养基，每株3瓶，培养结束后，取该培养液12000rpm离心10min收集菌体用于生物转化甘氨腈，采用高效液相色谱法检测转化后上清液中生成的甘氨酸浓度。得到产量最高的一株菌株，命名为尖孢镰孢(Fusarium oxysporum H3，CGMCC No.3829)。

种子培养基：牛肉膏10.0g/L、蛋白胨10.0g/L、酵母膏10.0g/L、葡萄糖10.0g/L、氯化钠5.0g/L，pH 7.0。装液量25mL/250mL，培养条件为30℃，120rpm培养3d。

(2)尖孢镰孢(Fusarium oxysporum H3)的形态

尖孢镰孢(Fusarium oxysporum H3)菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上采用打孔器接种法接种，孔径0.5cm，在30℃培养4d后菌落直径为4.9cm，平均生长直径为12.2mm/d；培养7d后，菌落边缘呈白色，中间呈紫红色，可产生紫红色色素；在米饭培养基上生长后呈粉红色；气生菌丝生长良好，为疏松的棉絮状，气生菌丝分枝，透明，直径1.6-4.4μm，在气生菌丝上有粘孢团，粘孢团无色，小型分生孢子 生于气生菌丝中，假头状着生，小型分生孢子近卵形，无隔，光滑，大型分生孢子镰刀形、椭圆形弯曲。

(3)尖孢镰孢(Fusarium oxysporum H3)的分子鉴定

收集在马铃薯葡萄糖固体培养基平板上生长的菌丝体，用真菌基因组DNA提取试剂盒提取总DNA。扩增引物分别为18S的通用引物、ITS序列的通用引物及28S rDNA序列扩增的通用引物。

PCR反应采用50μL反应体系，

10×buffer(Mg²⁺)             5.0μL

dNTPs(2.5mM)                 4.0μL

正向引物(20μM)              2.0μL

反向引物(20μM)              2.0μL

ExTaq DNA聚合酶(5U/μL)      1.0μL

模板DNA                      2.0μL

ddH₂O                        34μL

PCR扩增条件：94℃预变性4min；94℃变性60s，55℃退火60s，72℃延伸90s，共30个循环，最后72℃终延伸10min。PCR扩增产物的纯化按上海生工生物技术公司的小量胶回收PCR产物纯化试剂盒说明进行，测序由上海华大基因完成。

经测序后获得的18S、ITS和28S rDNA基因序列，在Genbank中进行BLAST比对确定其种属。

实施例2  尖孢镰孢(Fusarium oxysporum H3)发酵生产甘氨酸的方法

本实例说明对尖孢镰孢(Fusarium oxysporum H3)接入营养丰富的培养基进行了培养获得高活性高生物量的菌体，以及生物转化甘氨腈生成甘氨酸的方法。

培养基的组成：甘油10.0g/L，酵母膏1.0g/L，蛋白胨1.0g/L，硫酸镁0.1g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，氯化钠0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，己内酰胺0.5g/L，pH 7.5；

将尖孢镰孢(Fusarium oxysporum H3)以1％的接种量接入培养基中，30℃，120rpm好养培养3d，即培养结束，12000rpm离心10min收集培养好的菌体，用0.5M的磷酸缓冲液洗涤菌体2次，并将菌体重新悬浮于该缓冲液中制成菌悬液。

配制7.8g/L的甘氨腈溶液，用2.0M的氢氧化钠或盐酸溶液调节pH至5.0，以此作为催化反应的底物。将该底物溶液与菌悬液混匀，使最终菌体量为1％，并控制混合体系pH为7.2，在温度30℃，转速120rpm的条件下反应48h，反应液中甘氨酸浓度为6.6g/L，产率达到了60％以上。

实施例3  改变发酵条件，尖孢镰孢(Fusarium oxysporum H3)发酵生产甘氨酸

本实施例采用与实施例2相同的方法，改变反应时间。

通过离心从培养液中收集菌体，并用0.5M的磷酸缓冲液洗涤2次，重新悬浮制成菌悬液，与7.8g/L 的甘氨腈溶液混匀，在30℃，120rpm的条件下反应12h，反应液中甘氨酸浓度为8.5g/L，产率达到了80％。

实施例4  改变发酵条件，尖孢镰孢(Fusarium oxysporum H3)发酵生产甘氨酸

本实施例的方法与实施例2相同，改变所用方法参数。

培养基组成：甘油10.0g/L，酵母膏5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，硫酸镁0.1g/L，磷酸二氢钾4.0g/L，氯化钠1.0g/L，硫酸亚铁0.02g/L，己内酰胺1.0g/L，pH 7.5；

将尖孢镰孢(Fusarium oxysporum H3)以2％的接种量接入培养基中，30℃，120rpm好养培养3d，即培养结束，12000rpm离心10min收集培养好的菌体，用0.5M的磷酸缓冲液洗涤菌体2次，并将菌体重新悬浮于该缓冲液中制成菌悬液。

配制23.4g/L的甘氨腈溶液，作为催化反应底物。将该底物溶液与菌悬液混匀，并控制pH为7.2，在温度30℃，转速120rpm的条件下反应12h，反应混合物中的甘氨腈几乎全部转化，甘氨酸的产量达到了24.6g/L。

实施例5  改变发酵条件，尖孢镰孢(Fusarium oxysporum H3)发酵生产甘氨酸

本实施例的方法与实施例2相同，改变所用方法参数。

配制46.8g/L的甘氨腈溶液，作为催化反应底物。将该底物溶液与菌悬液混匀，接种量为1％，并控制pH为7.2，在温度30℃，转速120rpm的条件下反应12h，底物甘氨腈几乎全部转化，甘氨酸的产量达到了39.8g/L。