一种海洋适冷内切β-木聚糖酶XynB及其表达基因xynB与应用

摘要

本发明涉及一种海洋适冷内切β-木聚糖酶及其表达基因xynB与应用，属于生物技术技术领域。一种海洋适冷内切β-木聚糖酶XynB，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。以及编码上述海洋适冷内切β-木聚糖酶XynB的基因xynB，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所述的β-木聚糖酶XynB在0-35℃具有比较高的催化效率，应用于纸浆漂白，木寡糖生产，面粉改性等可在室温下进行，可以省去传统工艺的升温步骤，从而节约能源。

说明书

技术领域

本发明涉及一种海洋适冷内切β-木聚糖酶及其表达基因xynB与应用，属于生物技术技术领域。

背景技术

β-木聚糖酶是由细菌和真菌分泌的能够降解木聚糖的糖苷水解酶，绝大多数属于糖苷水解酶第10家族和第11家族，近几年发现少数β-木聚糖酶属于第5，7，8和43家族。其中第8家族大部分是纤维素酶，也包括一部分几丁质酶和木聚糖酶，目前经过性质研究的第八家族木聚糖酶只有2个，分别是来自Pseudoalteromonas.haloplanktis TAH3a的pXyl和来自环境基因组文库的Xyn8。根据对pXyl的晶体结构分析结果，第8家族木聚糖酶可能折叠成扭曲的(a/a)₆桶状结构，由外层和内层各6个a螺旋围绕而成，这种拓扑结构也曾在第9家族内切葡聚糖酶，第15家族淀粉酶和第65家族麦芽糖磷酸化酶中发现。与第11家族木聚糖酶类似，第8家族木聚糖酶含有一个较大的底物结合裂缝，能容下至少6个木糖残基，起催化作用的氨基酸残基是谷氨酸和天冬氨酸，两者相距很近且位于三维结构裂缝的中央位置。与第10和11家族木聚糖酶的retaining催化机制不同，第8家族木聚糖酶采取相反的inverting的方式。根据已有的研究结果，第8家族木聚糖酶作用的底物专一性比较强，一般只对木聚糖有水解作用，对纤维素等其它聚糖类没有作用。

β-木聚糖酶在造纸、食品和饲料等行业中有着广泛的应用前景。在制浆造纸行业中，β-木聚糖酶的使用可以减少纸浆漂白过程中酸性漂白剂(如氯气、二氧化氯)的用量，降低污染。在食品行业中，β-木聚糖酶可以从棉籽壳、甘蔗渣和玉米芯等天然半纤维素中分解得到低聚木糖，该糖是当前最受众人瞩目的一种功能性低聚糖。其甜度为蔗糖的40％，食用后不会导致血浆中葡萄糖水平大幅度上升。用低聚木糖可制成不同甜度的食品，可代替葡萄糖，作为糖尿病人的疗效食品。在饲料行业中β-木聚糖酶的使用可以将饲料中的非淀粉多糖转化为营养性物质，消除其抗营养作用，从而提高饲料的转化率。将β-木聚糖酶应用于苎麻脱胶，可以减少环境污染，降低脱胶工艺对纤维的损伤。

由于β-木聚糖酶的广泛用途，对β-木聚糖酶的研究和开发一直都被世界各国科学家所重视。开发具有新的用途的新型β-木聚糖酶具有非常重要的理论意义和应用价值。自20世纪70年代以来，随着基因重组技术和分子生物学的发展，许多β-木聚糖酶的编码基因和一级结构被详细研究，并且有少数酶被结晶。

在β-木聚糖酶中适冷木聚糖酶由于在低温下具有很高的活性，因此在纸浆漂白，木寡糖生产，面粉改性以及饲料等行业比中温木聚糖酶更具优越性，已经受到研究者的广泛关注。近些年的研究表明，极地存在着大量的微生物，这些微生物长期生长在低温的极端环境下，形成了适应低温的特殊结构和特殊机制，因此，极地微生物是发现新型适冷酶的好材料。但由于采样和培养等困难，目前对极地微生物的研究相对地较少。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种海洋适冷内切β-木聚糖酶XynB及其表达基因xynB与应用。

本发明使用的技术术语：

1.CTAB/NaCl法：是指针对含多糖类物质较多的细菌，在提取细菌基因组DNA常规方法基础上，加入CTAB(溴化十六烷三甲基铵)和氯化钠来去除多糖类物质，从而达到较好的提取效果的一种方法。

2.PCR技术：链式聚合酶反应，利用DNA聚合酶，模板，引物以及dNTP进行体外扩增特定DNA片段的技术。

3.CDD分析软件：NCBI网站上提供的一种用来推测和分析特定氨基酸序列形成的结构域信息的软件。

一种海洋适冷内切β-木聚糖酶XynB，氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。

编码上述海洋适冷内切β-木聚糖酶XynB的基因xynB，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种含有SEQ ID No.2所示核苷酸序列的表达载体。

含有上述SEQ ID No.2所示核苷酸序列或上述表达载体的重组细胞。

上述海洋适冷内切β-木聚糖酶XynB和/或上述基因xynB在纸浆漂白、木寡糖生产、面粉改性或饲料生产行业中水解燕麦木聚糖、山毛榉木聚糖、桦木木聚糖方面的应用。

本发明海洋适冷内切β-木聚糖酶的基因xynB是从保存于德国微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为15026的细菌Glaciecola mesophila KMM241提取的基因组DNA。Glaciecolamesophila KMM241是从北极海水无脊椎动物体内分离得到的。根据与Glaciecola mesophilaKMM241的16S rDNA序列相似性最高的一株细菌Pseudoalteromonas atlantica T6c的基因组中一个第八家族木聚糖酶基因序列设计引物，利用PCR技术从Glaciecola mesophilaKMM241的基因组DNA中克隆了编码海洋适冷内切β-木聚糖酶xynB的基因。对该基因的核酸序列进行了测定。测序结果表明获得的DNA片段中含有一个具有2739个核苷酸的开放阅读框架，该开放阅读框架即是编码木聚糖酶XynB的基因xynB，共编码912个氨基酸。因此，木聚糖酶XynB是一个含有912个氨基酸的多肽。木聚糖酶XynB的前体的结构包括信号肽和成熟酶两部分。成熟酶含有869个氨基酸，是糖苷水解酶第八家族中的一个尚未报道的具有新的序列的木聚糖酶。

有益效果：

1、本发明所述的β-木聚糖酶XynB在0-35℃具有比较高的催化效率，应用于纸浆漂白，木寡糖生产，面粉改性等可在室温下进行，可以省去传统工艺的升温步骤，从而节约能源；

2、本发明所述的β-木聚糖酶XynB是一种严格的内切酶，水解木聚糖可产生木三糖，木四糖等寡糖，可广泛应用于木寡糖的生产过程中；

3、本发明所述的β-木聚糖酶XynB在低温下有较高酶活性，中高温下极不稳定，中温就可以使其完全失活，从而保证了其使用的安全性。

附图说明

图1、提取的Glaciecola mesophila KMM241的基因组DNA的电泳图；

其中：1、Glaciecola mesophila KMM241的基因组DNA，2、DNA分子量标记(marker)；

图2、通过PCR扩增克隆的编码XynB的基因片段的电泳图；

其中：1、DNA分子量标记(marker)，2、扩增的DNA片段；

图3、在大肠杆菌中进行异源表达和纯化的适冷β-木聚糖酶XynB电泳图；

M、蛋白质分子量标记(marker)；1、含表达质粒的大肠杆菌BL21经IPTG诱导表达菌体超声波破碎后的上清液电泳图；2、上清液经过阴离子交换层析后的电泳图；3、样品经过镍柱亲和层析纯化后的纯β-木聚糖酶XynB电泳图；

图4、是适冷β-木聚糖酶XynB的酶活温度曲线；

图5、是适冷β-木聚糖酶XynB的酶活pH曲线；

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

实施例1：

一种海洋适冷内切β-木聚糖酶XynB，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码上述海洋适冷内切β-木聚糖酶XynB的基因xynB，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

基因xynB共2739bp，其中含有一个2739bp的开放阅读框架编码适冷内切木聚糖酶XynB，起始密码子位于1bp，终止密码子位于2737bp，共编码912个氨基酸。

实施例2：基因xynB的克隆方法

菌种来源：Glaciecola mesophila KMM241购自德国微生物菌种保藏中心(DSM)，菌种保藏号为：15026。

具体步骤如下：

1.适冷内切木聚糖酶XynB编码基因的克隆

1.1 Glaciecola mesophila KMM241基因组DNA的提取参照《精编分子生物学实验指南》：

(1)培养50ml细菌培养物至饱和状态，取15ml的培养物12000g离心5min；

(2)沉淀物加入5670μl TE，用吸管反复吹打使之重悬，然后，加入300μl 10％SDS和30μl 20mg/mL蛋白酶K，混匀，37℃温育2.5-3h；

(3)加入1000μl 5M NaCl，充分混匀，再加入800μl CTAB/NaCl溶液，混匀，于65℃温育30-60min；

(4)加入等体积的混合液(该混合液由氯仿/异戊醇按体积比24∶1混合制得)，混匀，4℃，12000g离心20min，将上清液转入一个新管中；

(5)加入等体积的混合液(氯仿/异戊醇按体积比24∶1混合)，混匀，4℃，14000g离心30min，将上清转到一只新管中；

(6)加入等体积的混合液(氯仿/异戊醇按体积比24∶1混合)，混匀，4℃，16000g离心30min，将上清转到一只新管中；

(7)加入0.6倍体积异丙醇，轻轻混合(缓慢上下颠倒3min)，置于4℃冰箱中保持10min，用一细弯玻棒将絮状沉淀沟出，转入一5ml的离心管中；

(8)用3ml的70％乙醇洗涤2次，再用无水乙醇洗涤2次，各12000g离心2min，弃上清，沉淀即为DNA，DNA在超净工作台上风干；

(9)加入100-200μl TE缓冲液，4℃过夜溶解DNA；

(10)加10mg/ml RNase至终浓度为50μg/mL，37℃温育1h；

(11)加等体积酚/氯仿/异戊醇(按体积比1∶1∶1混合)抽提1次，上清液再用氯仿/异戊醇(按体积比1∶1∶1混合)抽提1次；

(12)向上清中加入1/10体积3M NaAc(pH5.2)和2倍体积预冷的无水乙醇，倒置混合；

(13)离心后轻轻弃去上清，DNA沉淀用70％乙醇和无水乙醇各洗涤1次，稍干后溶于适量TE buffer中，用紫外分光光度计测定DNA浓度及纯度后置于4℃冰箱保存(可于-20℃长期保存)。

1.2引物设计与合成

根据数据库中已有的Pseudoalteromonas atlantica T6c菌的β-木聚糖酶基因序列设计两条特异性引物F8X1：ATGAGCACTTTATCAGTCAG(SEQ ID NO.3)；F8X4：TTATTCAGGCTCGTTTTC(SEQ ID NO.4)，该引物由上海生工生物技术公司合成；

1.3利用PCR进行基因序列扩增

(1)以F8X1和F8X2为引物，以基因组DNA为模板，做PCR扩增。PCR反应条件为：95℃，5分钟；然后95℃，1分钟；50℃，1分钟；72℃，4分钟，32个循环后，72℃，延伸10分钟。

(2)对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果表明获得一条约2700bp的DNA片段。然后用Omega公司的DNA回收试剂盒按照其说明回收扩增DNA片段。

2.基因序列测定

(1)DNA片段与克隆载体连接

将回收DNA片段连接到Promega公司的pGEMT载体上。连接反应体系：

连接酶Buffer        1μl

载体pGEMT           1μl

外源DNA片段         3μl

T₄连接酶            1μl

补加ddH₂O           至10μl

盖紧盖子，手指轻弹离心管，混匀样品，在离心机上转2秒，把样品集中在管底，16℃连接过夜。

(2)按《分子克隆实验指南》上制备大肠杆菌感受态的方法制备大肠杆菌DH5α感受态。

(3)按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法将连接好的重组pGEMT载体转至大肠杆菌DH5α感受态。

(4)转化的大肠杆菌DH5α涂于含100μg/L氨苄青霉素的麦康凯培养基，37℃过夜培养，挑选白色转化子作为模板，用F8X1和F8X2作为引物，通过菌落PCR验证白色转化子中质粒是否含有PCR扩增的DNA片段。

(5)将质粒含有PCR扩增的DNA片段的转化子送上海生工生物技术有限公司测序。因此，获得木聚糖酶XynB编码基因xynB的序列2739bp。序列如SEQ ID NO.1所示。通过NCBI网站的blastX软件分析发现其中含有一个2739bp的编码木聚糖酶XynB的开放阅读框架。起始密码子位于1bp，终止密码子位于1270bp，共编码912个氨基酸。

实施例3：木聚糖酶XynB的异源表达与纯化

3.基因xynB在大肠杆菌中的表达

3.1表达载体pet-22b-xynB的构建

(1)利用小剂量质粒提取试剂盒，按照说明书的步骤，从含有重组pGEMT质粒的转化子中提取重组质粒pGEMT-xynB.

(2)根据测序结果设计两条特异性引物

XYB1：CGACGGATCCGAGCACTTTATCAGTCAG(SEQ ID NO.5)用下划线标出的是BamHI酶切位点。XYB2：CGACGCTCGAGTTCAGGCTCGTTTTC(SEQ ID NO.6)用下划线标出的是XhoI酶切位点。上述引物由上海生工生物技术公司合成。

(3)利用PCR进行基因序列扩增，以XYB1和XYB2为引物，以重组pGEMT质粒为模板，做PCR扩增。PCR反应条件为：95℃，5分钟；然后95℃，1分钟；50℃，1分钟；72℃，4分钟，32个循环后，72℃，延伸10分钟。

(4)对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果表明获得一条约2700bp的DNA片段。然后用Omega公司的DNA回收试剂盒按照其说明回收扩增DNA片段。

(5)用限制性内切酶BamHI和XhoI对回收片段和质粒pet-22b进行双酶切。酶切反应体系如下：

酶切缓冲液      2μl       酶切缓冲液     2μl

内切酶BamHI     1μl       内切酶BamHI    1μl

内切酶XhoI      1μl       内切酶XhoI     1μl

回收DNA片段     10μl      质粒pet-22b    6μl

补加ddH₂O       至20μl    补加ddH₂O      至20μl

放在37℃水浴中反应3个小时。对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后用Omega公司的DNA回收试剂盒按照其说明回收扩增DNA片段。

(6)将经过双酶切的xynB基因片段连接到pet-22b载体上。连接反应体系：

连接酶Buffer        1μl

载体pet-22b         1μl

xynA基因片段        3μl

T₄连接酶            1μl

补加ddH₂O           至10μl

盖紧盖子，手指轻弹离心管，混匀样品，在离心机上转2秒，把样品集中在管底，16℃摇床中连接过夜。

(7)按《分子克隆实验指南》上制备大肠杆菌感受态的方法制备大肠杆菌DH5α感受态；

(8)按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法将连接好的重组pet-22b载体转至大肠杆菌DH5α感受态；

(9)将转化后的大肠杆菌DH5α涂于含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃过夜培养；

(10)在平板上挑取单菌落，接于5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养；

(11)收集3mL菌液，12000g离心2min，得到菌体，用试剂盒提取重组质粒pet-22b-xynB。置于-20℃保存。

3.2表达载体pet-22b-xynB转化到大肠杆菌BL21(DE3)中

(1)按《分子克隆实验指南》上制备大肠杆菌感受态的方法制备大肠杆菌BL21感受态；

(2)按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法将连接好的重组pet-22b载体转至大肠杆菌BL21感受态；

(3)将转化的大肠杆菌BL21涂于含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃过夜培养。

3.3基因xynB在大肠杆菌中诱导表达与纯化

(1)在平板上挑取单菌落，接于20mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养；

(2)1％接种量转接到含100μg/mL氨苄青霉素的新鲜LB培养基中，37℃培养至菌浓度OD0.8，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，继续在15℃摇床培养20h；

(3)收集经过IPTG诱导表达的500mL LB培养液，12000g离心10min，收集菌体；

(4)用20mL的Binding缓冲液悬浮菌体；

(5)将重新悬浮的菌液进行超声波破碎(400W，10min)；

(6)将破碎后的菌液12000g离心10min，收集上清液；

(7)将上清液按照说明书的要求进行镍柱亲和层析；

(8)层析后收集的样品用SDS-PAGE检测纯度，证明已经获得木聚糖酶XynB的电泳纯酶(图3)。用20mmol/L的Tris-HCl(pH7.5)缓冲液透析3-4次。最后置于-20℃保存备用。

实施例4：木聚糖酶XynB的性质测定

4.1底物特异性

(1)用50mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7.0)配制浓度为1％的不同底物溶液，包括燕麦木聚糖，山毛榉木聚糖，桦木木聚糖，醋酸纤维素，海藻多糖，甘露聚糖，几丁质，淀粉；

(2)在20mL的定量管中加入0.9mL不同的底物溶液，置于30℃水浴中预热5min，加入0.1mL纯酶液，反应10min，然后加入1.5mLDNS溶液终止反应，将定量管置于沸水浴中加热5min，最后加入蒸馏水定容到15mL；

(3)通过测定550nm处吸光值计算产生的还原糖的量来表征水解程度。该酶对不同底物的水解活性如表1所示。

表1

  底物  相对酶活(％)  山毛榉木聚糖  100

  桦木木聚糖  90.6  燕麦木聚糖  75.5  羧甲基纤维素  0  海藻多糖  0  甘露聚糖  0  几丁质  0  淀粉  0

4.2最适酶活温度

分别在0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60℃条件下测定β-木聚糖酶XynB的酶活，以确定酶的最适反应温度。测定酶活的具体方法为：

90μL 1％的山毛榉木聚糖溶液加入10μL纯酶液，不同温度下反应10min，加入150μLDNS液终止反应，煮沸5min。加入1.25mL蒸馏水混匀，于550nm处测定吸光值。根据木糖标准曲线计算出生成的还原糖的量。结果表明该酶的最适酶活温度35℃(如图4)。

4.3最适pH

分别在pH4.0、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0条件下测定木聚糖酶的酶活，以确定该酶的最适pH。缓冲体系(50mmol/L)：pH 4.0-6.0，柠檬酸缓冲液；pH 6.0-8.0，磷酸缓冲液；pH 8.0-9.0，Tris-盐酸缓冲液；pH 9.0-11.0，甘氨酸-NaOH缓冲液。

具体方法是用上述缓冲液配制不同pH的1％山毛榉木聚糖溶液，然后按照5.3中的方法测定β-木聚糖酶XynB在不同pH条件下的酶活。结果表明该酶的最适pH为7.0(如图5)。

5.结果

利用CTAB/NaCl法提取了Glaciecola mesophila KMM241的基因组DNA(图1)。通过PCR扩增得到编码β-木聚糖酶XynB的基因DNA片段(图2)经过测序获得编码β-木聚糖酶XynB的基因xynB的核酸序列。基因xynB含有一个2739bp的开放阅读框架编码适冷内切木聚糖酶XynB，起始密码子位于1bp，终止密码子位于2737bp，共编码912个氨基酸。利用NCBI网站的CDD软件分析β-木聚糖酶XynB的结构，β-木聚糖酶XynB的前体的结构包括信号肽和催化结构域以及N-端未知功能结构域三部分。将基因xynB在大肠杆菌中进行异源表达和纯化，获得成熟有活性的β-木聚糖酶XynB(图3)。成熟酶β-木聚糖酶XynB含有一个869个氨基酸的催化结构域，是水解酶第8家族中的一个尚未报道的具有新的序列的酶。最适酶活温度为35℃(图4)，最适pH为6.0-7.0(图5)。因此，基因xynB编码的β-木聚糖酶XynB是一个中性适冷内切木聚糖酶。