蒜头果仁凝集素及其制备方法

摘要

本发明提供一种蒜头果仁的凝集素及其制备方法，通过将蒜头果仁粉碎，经冷水搅拌浸泡，用硫酸铵分级沉淀、超滤除盐和浓缩、离子交换层析纯化、超滤除盐和浓缩、冷冻干燥得到精制蒜头果凝集素。所得的蒜头果凝集素分子量约60kd、电泳纯度90%以上，可使兔、猪、鸡、鸭、鼠的红细胞凝集，效价1:105以上。抑制HIV病毒感染细胞的IC50为1:105，可用于预防HIV感染。

说明书

技术领域

本发明涉及一种铁青树科蒜头果仁凝集素及其制备方法，属植物凝集素提取或制备工艺技术领域。

背景技术

凝集素是一类由动植物及微生物细胞分泌的非酶和非免疫的蛋白质或多价糖结合蛋白，因一般能凝集某些细胞(如红细胞)而称之，其家族成员不断增加，功能复杂多样，如促有丝分裂、病毒的毒力决定、凝集恶性细胞、精子、骨髓细胞等。由于凝集素具有高度的糖结合专一性，已成为研究生物学和临床医学非常有用的工具，用于分离纯化和确定糖复合体、细胞分裂、鉴定微生物、肿瘤诊断、治疗及预防骨髓移植等，某些凝集素具有阻断HIV攻击CD4细胞能力，如乳杆菌凝集素（徐进等:中国生物制品学杂志,2008,9:792-795）、黄精凝集素（CN200610005577）等。不同来源的凝集素有不同的凝集谱和应用价值（刘雪兰等:中华绒螯蟹血清凝集素的生物学特性,中国水产科学2006,3:335-340），有不同的提取制备工艺和方法，如亲和层析法（CN028243196）等。

蒜头果（Malana oleifera）又名马兰后（广西壮语音）、米民、猴子果、唛厚、山桶果等，属铁青树科蒜头果属，是我国特有单种属稀有植物，国家二级保护树种。主要分布在广西西部和云南东南部的狭窄地带，是典型的油料作物，种仁含油率高达64.5%，油脂既可食用，又是合成麝香酮(muscone)、昆虫信息素等的工业原料（赵劲平,欧乞鍼:蒜头果仁油的应用研究,中国油脂,2010,7:12-16）。迄今为止，前人已在蒜头果果油脂肪酸组成和含油量、濒危原因和保护、果油脂肪酸和木材的开发利用、生态适应特征、组织培养等方面取得一定的研究成果，但总体水平还停留在起步阶段。发明专利200510010633将蒜头果在不高于4℃的低温条件下捣碎，过滤，上清液用30-100%硫酸铵分级沉淀，透析，再通过蛋白质分离专用的色谱仪器纯化，获得SDS-PAGE电泳纯、分子量32kD和23kD的两个亚基构成的55kd抗癌蛋白。然而，直至目前，尚无蒜头果仁凝集素研究及应用的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种从蒜头果属植物中提取的凝集素及其制备方法。

本发明提供一种蒜头果仁凝集素，包括下列质量组分：

蛋白质 60～80%，       多糖 15～30%。

所述蒜头果仁凝集素用于兔、猪、鸡、鸭、鼠的红细胞凝集，抗HIV活性。

本发明的另一目的在于提供一种蒜头果仁凝集素的制备方法，经过下列各工艺步骤：

A．将干燥的蒜头果仁粉碎，按固液比为1︰3～8溶解于水中，水温为0～10℃，在0～10℃温度下搅拌10～48h，然后将此混合物进行过滤，得到黄色透明滤液；

B．向滤液中加入硫酸铵粉末，并搅拌溶解直至硫酸铵饱和度达25～40%时停止加入，在0～10℃下静置1～2小时后，于0～10℃、转速为1000～8000rpm下进行离心分离，取其上清液继续加入硫酸铵粉末至饱和度达60～75%，静置1～2小时后，于0～10℃、转速为1000～8000rpm下进行离心分离，去除上清液，取其沉淀物，即为凝集素粗品；

C．将步骤B所得凝集素粗品用蒸馏水溶解后进行超滤或透析除盐，得浓缩液；

D．将步骤C所得浓缩液经过离子交换层析，用0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液挂柱，使样品吸附，用0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液与浓度从0.1%NaCl线性逐渐升高到6%NaCl的盐溶液进行线性浓度梯度洗脱，用兔红细胞检测凝集活性，收集有凝集活性的组分，再经超滤或透析除盐、浓缩、冷冻干燥，即得蒜头果仁凝集素，其包括下列质量组分：蛋白质 60～80%，多糖 15～30%。

所述步骤A中干燥的蒜头果仁粉碎粒度为40～200目。

所述步骤C和D中超滤或透析除盐的膜透过分子量≤10kd。

步骤D所得蒜头果仁凝集素SDS-PAGE变性电泳呈单一条带(即未见杂蛋白条带)、分子量60kd，蛋白含量80～90%(凯氏定氮法)，糖含量5～10%（硫酸苯酚法）,可使兔、猪、鸡、鸭、鼠的红细胞凝集的效价达1:10⁶以上(即≤1 μg/ml)，抗HIV活性IC₅₀≤50μg/ml。

本发明的优点和效果：提取纯化工艺简便快速，特别是超滤可兼有除盐、除杂、浓缩、分离等多重作用，易于线性放大；所得蒜头果仁凝集素可使兔、猪、鸡、鸭、鼠的红细胞凝集效价高达1:10⁶以上(即≤1 μg/ml)；有较高的抗HIV活性，IC₅₀ ≤50μg/ml；在抗HIV感染、生物检测、疾病诊断和治疗等方面有着广泛的应用前景；实现了蒜头果资源的综合高效利用。

附图说明

图1为蒜头果仁凝集素经Sepharose XL离子交换柱层析洗脱曲线(仅B3组分有凝集活性)；

图2为精制蒜头果仁凝集素的SDS-PAGE电泳图；

图3为蒜头果仁凝集素对HIV-1 Ba-L（R5病毒）的抑制活性的剂量-反应曲线；

图4为蒜头果仁凝集素对TZM-b1细胞毒性的剂量-反应曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步描述。

实施例1

A．将干燥的蒜头果仁粉碎至100目，称取100g粉末，溶解于800g的水中，水温为4℃，在4℃温度下搅拌24h，然后将此混合物进行过滤，得到黄色透明滤液；

B．向滤液中加入硫酸铵粉末，并搅拌溶解直至硫酸铵饱和度达40%时停止加入，在4℃下静置2小时后，于0℃、转速为8000rpm下离心分离，取其上清液继续加入硫酸铵粉末至饱和度达70%，静置2小时后，于4℃、转速为4000rpm下进行离心分离，去除上清液，取其沉淀物，即为凝集素粗品；

C．将步骤B所得凝集素粗品用蒸馏水溶解后进行透析除盐，膜透过分子量≤10kd，得浓缩液；

D．将步骤C所得浓缩液经离子交换柱纯化，用0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH=7.0）挂柱，使样品吸附，用0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH=7.0）与浓度从0.1～6%的NaCl溶液进行线性梯度洗脱，用兔红细胞检测凝集活性，收集有凝集活性的组分，再经超滤除盐，膜透过分子量≤10kd，冷冻干燥，即得蒜头果仁凝集素0.63g。

所得蒜头果仁凝集素经SDS-PAGE电泳测定分子量约60kd、电泳纯度90%以上，可使兔、猪、鸡、鸭、鼠的红细胞凝集，效价1:10⁶以上(0.478 μg/ml)。利用合胞体抑制实验测定抑制HIV病毒感染细胞的IC₅₀为50μg /ml，故可用于预防HIV感染。

实施例2

A．将干燥的蒜头果仁粉碎至200目，称取100g粉末，溶解于300g的水中，水温为0℃，在0℃温度下搅拌48h，然后将此混合物进行过滤，得到黄色透明滤液；

B．向滤液中加入硫酸铵粉末，并搅拌溶解直至硫酸铵饱和度达25%时停止加入，在0℃下静置1小时后，于4℃、转速为1000rpm下以离心分离，取其上清液继续加入硫酸铵粉末至饱和度达75%，静置1小时后，于0℃、转速为1000rpm下进行离心分离，去除上清液，取其沉淀物，即为凝集素粗品；

C．将步骤B所得凝集素粗品用蒸馏水溶解后进行透析除盐，膜透过分子量≤10kd，得浓缩液；

D．将步骤C所得浓缩液经离子交换柱纯化，用0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH=7.0）挂柱，使样品吸附，用0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH=7.0）与浓度从0.1～6%的NaCl溶液进行线性梯度洗脱，用兔红细胞检测凝集活性，收集有凝集活性的组分，再经透析除盐，膜透过分子量≤10kd，冷冻干燥，即得蒜头果仁凝集素0.59g。

所得蒜头果仁凝集素经SDS-PAGE电泳测定分子量约60kd、电泳纯度95%以上，可使兔、猪、鸡、鸭、鼠的红细胞凝集，效价1:10⁶以上(0.381 μg/ml)。利用合胞体抑制实验测定抑制HIV病毒感染细胞的IC₅₀为26 μg /ml，故可用于预防HIV感染。

实施例3

A．将干燥的蒜头果仁粉碎至40目，称取100g粉末，溶解于500g的水中，水温为10℃，在10℃温度下搅拌10h，然后将此混合物进行过滤，得到黄色透明滤液；

B．向滤液中加入硫酸铵粉末，并搅拌溶解直至硫酸铵饱和度达30%时停止加入，在10℃下静置1.5小时后，于10℃、转速为4000rpm下以离心分离，取其上清液继续加入硫酸铵粉末至饱和度达60%，静置1.5小时后，于10℃、转速为8000rpm下进行离心分离，去除上清液，取其沉淀物，即为凝集素粗品；

C．将步骤B所得凝集素粗品用蒸馏水溶解后进行超滤除盐，膜透过分子量≤10kd，得浓缩液；

D．将步骤C所得浓缩液经离子交换柱纯化，用0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH=7.0）挂柱，使样品吸附，用0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH=7.0）与浓度从0.1～6%的NaCl溶液进行线性梯度洗脱，用兔红细胞检测凝集活性，收集有凝集活性的组分，再经超滤除盐，膜透过分子量≤10kd，冷冻干燥，即得蒜头果仁凝集素0.61g。

所得蒜头果仁凝集素经SDS-PAGE电泳测定分子量约60kd、电泳纯度95%以上，可使兔、猪、鸡、鸭、鼠的红细胞凝集，效价1:10⁶以上(0.953 μg/ml)。利用合胞体抑制实验测定抑制HIV病毒感染细胞的IC₅₀为41μg /ml，故可用于预防HIV感染。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为了清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。