一种检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的试剂盒

摘要

本发明涉及一种检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株RT-PCR引物对和RT-PCR试剂盒，可以特异、敏感地检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征流行病毒株。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术，尤其涉及动物疫病的预防控制。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)主要引起母猪发热、流产，断奶前后的仔猪死亡率升高，不同年龄猪呼吸障碍等为临床特征的疾病。1991年，荷兰学者Terpstra等人在感染猪体内分离到欧洲型PRRSV，命名为Lelystad病毒(LV)；同年，美国学者Benfield等人分离到美洲型PRRSV，命名为VR-2332。该病毒1996年传入中国并长期存在，成为危害我国养猪业的主要猪病病毒之一。

近年来，我国学者相继分离鉴定了美洲型PRRSV的CH-1a、S1、HB-1和HB-2等毒株。2006年6月份以来，我国多个省份的养猪场、户爆发猪“高热病”疫情，给养猪业造成了巨大的经济损失，中请人在研究该病的过程中，发现了其主要病原——高致病性PRRSV变异株，这一类的高致病性PRRSV变异株以Nsp2基因第1594～1680位核苷酸连续缺失为特征，并分离鉴定了代表性病毒株——NVDC-JXA1株(分类命名：繁殖与呼吸综合征病毒；保藏编号：CGMCC No.1964)。

2006年，申请人针NVDC-JXA1病毒株建立了特异性的RT-PCR检测方法，用于检测该病毒感染。但是2009年以来，通过在自然界中不断演化，我国高致病性PRRSV变异株已经在基因组序列上发生了一些变化；同时，由于CH1-R疫苗等毒株逐渐推广使用，对原有RT-PCR检测方法造成了非特异性的干扰。这些情况的出现，使得原有的RT-PCR检测方法和试剂盒已经不能有效地鉴别检测田间流行的高致病性PRRSV变异株。

本发明基于对2006年至2010年分离的多个高致病性PRRSV变异株基因序列分析，针对分离毒株Nsp2基因序列的共同特征，设计了一系列PCR 引物，并经过优化和试验筛选，获得了一对PCR引物。采用该引物组装的RT-PCR试剂盒，可以检测出当前发现的全部高致病性PRRSV变异株，并且不受经典PRRSV(是指Nsp2基因未发生第1594～1680位核苷酸连续缺失的毒株)和CH1-R疫苗毒株的干扰，从而能够特异、敏感地检测出高致病性PRRSV变异株。因此，该试剂盒能对高致病性PRRSV诊断和监测起到重要作用。

发明内容

本申请涉及针对高致病性PRRSV变异株NSP2基因片断设计的RT-PCR引物对，用于检测高致病性PRRSV变异株(本发明中特指Nsp2基因第1594～1680位核苷酸连续缺失为特征的毒株)。该引物对包括上游引物SEQ ID NO：1和下游引物SEQ ID NO：2的核苷酸序列为：

SEQ ID NO：1：5′-CGCAGAACAAAGTCTGTCAAAAG-3′

SEQ ID NO：2：5′-TGAGTCAGCGTTGCCTTCACAG-3′

本申请还提供一种能够特异、敏感地检测出高致病性PRRSV变异株的RT-PCR试剂盒，包含如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对。试剂盒的其他组分均按照常规方法配制，具体为：

1.RNA提取试剂：由醋酸钠溶液350μl，酚/氯仿/异戊醇混合液3.5ml，异丙醇3.5ml，75％乙醇12ml，无菌DEPC水450μl，RNA酶抑制剂24μl组成。

2.RT-PCR反应试剂：由RT反应液200μl(含反转录引物序列：RT引物5’-TCgCCCTAAT-3’)、RNA酶抑制剂24μl、AMV反转录酶12μl、PCR反应液200μl、0.5U/μLTaq DNA聚合酶25μl、矿物油300μl组成。

3.电泳检测试剂：包括50×TAE电泳缓冲液20ml、溴化乙锭溶液100μl、上样缓冲液50μl。

4.阴性对照350μl、阳性对照350μl、变性液7ml。

附图说明

图1：SEQ ID NO：1

图2：SEQ ID NO：2

图3：RT-PCR检测部分PRRSV病毒样品的电泳结果。注1.高致病性PRRSV NVDC-JXA1株；2.高致病性PRRSV TJ-F92疫苗；3.高致病性PRRSV HuN4-F112疫苗；4.混样1(勃林格MLV疫苗+高致病性PRRSV JXA1-R疫苗)；5.高致病性PRRSV 2009当阳分离毒株；6.经典PRRSV NM191病毒株；7.经典PRRSV DX F5病毒株；8.经典PRRSV VR2332病毒株；9.经典PRRSV HB2病毒株；10.经典PRRSV CH-1 R疫苗；11.经典PRRSV勃林格MLV疫苗；12.SPF猪血清L01；13.阴性对照；14.阳性对照；15.DNA Marker。

具体实施方式

实施实例1

RT-PCR引物合成与筛选

根据2006年至2010年分离鉴定的高致病性PRRSV的NSP2基因序列，设计一系列上游引物BU1～BU34，设计一系列下游引物BD1～BD27。引物由相关公司按常规方法合成。用这些引物两两组成引物对，分别进行RT-PCR试验，检测各种有代表性的病毒样品，包括：

A：高致病性PRRSV NVDC-JXA1株阳性对照；B：高致病性PRRSV变异株阳性组织；C：经典PRRSV CH-1R疫苗；D：经典PRRSV勃林格疫苗；E：阴性组织；F：阴性对照(纯水)。

通过多次测试，并比较检测结果，最终确定了特异性最好，检出率最高的引物对BU21&BD16，作为RT-PCR试剂盒的引物。具体核苷酸序列为：

SEQ ID NO：1：5′-CGCAGAACAAAGTCTGTCAAAAG-3′(BU21序列)

SEQ ID NO：2：5′-TGAGTCAGCGTTGCCTTCACAG-3′(BD16序列)

表1上游引物备选序列

  BU1  CCTAACGGTTCGGAAGAAACTGTC  BU3  AGTGAGCCCGTACTTGTGCCC

  BU4  AGTGAGCCCGTACTTGTG  BU5  ATGAGTGAGCCCGTAC  BU6  GCGACGTGTCCCCAAGCTG  BU7  GACGTGTCCCCAAGCTGA  BU8  GCGAGAACTCCCCAAGCTG  BU9  GCGAGAACTGCCCAAGCTG  BU10  GACGTGGAACCAAGCTGA  BU11  GACGGAACTGCAAGCTGA  BU12  GAGTGAGCCCGTACTTGTGC  BU13  CTATGAGTGAGCCCGTACTTG  BU14  CCTATGAGTGAGCCCGTAC  BU15  GCAGAACAAAGTCTGTCAAAAG  BU16  TTGGAAGAGGTTGTCCTGG  BU17  GCACCCTGGTCCCTCCC  BU18  GTCAACTCATGCTGCACCC  BU19  GCCAGAGGACAAGCCTGTC  BU20  AAAGCTTGCCAGAGGACAAGCC  BU21  CGCAGAACAAAGTCTGTCAAAAG  BU22  CAACCTCGCAGAACAAAGTCTG  BU23  GAGTTCAACCTCGCAGAACAAAG  BU24  GGGCGGCTGAGCAGGTCG  BU25  CCAGGCGACTTCAGAAATGATG  BU26  CTGCTAAAACTAGCCAACACCC  BU27  CTCATGTCCACTGGACTTGGC

  BU28  GGTTGTCCTGGAAGAATATGGGC  BU29  GCACCGCGTAGAACTGTGACAAC  BU30  CGCGTAGAACTGTGACAACAACG  BU31  GAACTGTGACAACAACGCTGACG  BU32  GAACTGTGACAACAACGCTGAC  BU33  CGTAGAACTGTGACAACAACGCTG  BU34  GCGTAGAACTGTGACAACAACGC

表2下游引物备选序列

  BD1  TGAGTCAGCGTTGTTGTCACAGTTC  BD2  TGAGTCAGCGTTGTTTTCACAGTTC  BD3  TGAGTCAGCGTTGTCTTCACAGTTC  BD4  TGAGTCAGCGTTGCCTTCACAGTTC  BD5  TGAGTCAGCGTTACCTTCACAGTTC  BD6  TGAGTCAGCATCGTTGTCACAGTTC  BD7  TGAGTAGGAGTTGTTGTCACAGTTC  BD8  TGAGTAGGAATCGTTGTCACAGTTC  BD9  TGAGTCAGCGTTGTTTTCACAG  BD10  TGAGTCAGCGTTGTTTTCAC  BD13  TGAGTCAGCATCGCCTTCACAGTTC  BD14  TGAGTAGGAGTTGCCTTCACAGTTC  BD15  TGAGTAGGAATCGCCTTCACAGTTC  BD16  TGAGTCAGCGTTGCCTTCACAG  BD17  TGAGTCAGCATCACCTTCACAGTTC

  BD18  TGAGTAGGAGTTACCTTCACAGTTC  BD19  TGAGTAGGAATCACCTTCACAGTTC  BD20  TGAGTCAGCGTTACCTTCACAG  BD21  TGAGTCAGCATCGTTTTCACAGTTC  BD22  TGAGTAGGAGTTGTTTTCACAGTTC  BD23  TGAGTAGGAATCGTTTTCACAGTTC  BD24  TGAGTCAGCATCGTCTTCACAGTTC  BD25  TGAGTAGGAGTTGTCTTCACAGTTC  BD26  TGAGTAGGAATCGTCTTCACAGTTC  BD27  TGAGTCAGCGTTGTCTTCACAG

实施实例2

一种快速检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-PCR试剂盒，按下表组装：

表3试剂盒组成(10份/盒)

  成分  含量  阴性对照  350μl×1管  阳性对照  350μl×1管  变性液  7ml×1瓶  醋酸钠溶液  350μl×1管  酚/氯仿/异戊醇混合液  3.5ml×1瓶  异丙醇  3.5ml×1瓶  75％乙醇  12ml×1瓶  无菌DEPC水  450μl×1管  RNA酶抑制剂  24μl×1管  RT反应液  200μl×1管

  PCR反应液  200μl×1管  AMV反转录酶  12μl×1管

  0.5U/μLTaqDNA聚合酶  25μl×1管  矿物油  300μl×1管  50×TAE电泳缓冲液  20ml×1瓶  溴化乙锭溶液  100μl×1管  上样缓冲液  50μl×1管  使用说明书  一份

其中的PCR反应液中含有按SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示核苷酸序列合成的寡核苷酸引物各8pmol/μL，其余组分按常规方法配制。具体配制方法如下：

1病毒株：

病毒株背景：制造本品使用高致病性PRRSV变异株——NVDC-JXA1分离株作为阳性对照。

保存：在本试验室高致病性PRRSV变异株NVDC-JXA1分离株已用Marc-145细胞传代3次；-70℃以下，保存期为24个月。

1.1阴性对照样品的制备

取灭菌的DEPC水，置-20℃冰箱保存。

1.2阳性对照样品的制备

将Marc-145细胞培NVDC-JXA1病毒株，60℃灭活30min，用本试剂盒检测，出现特异的扩增带，为阳性。其余的培养毒放于-70℃保存备用。

2试剂盒中其他成分的制造

2.1变性液的制备

购自Promega公司SV Total RNA Isolation System(货号：Z3100)中的组份，120mL/瓶。

2.2醋酸钠溶液的制备

购自Promega公司SV Total RNA Isolation System(货号：Z3100)中的组份，10mL/瓶。

2.3酚/氯仿/异戊醇混合液的制备

购自Promega公司SV Total RNA Isolation System(货号：Z3100)中的组份，100mL/瓶。

2.4异丙醇的制备

购自Promega公司SV Total RNA Isolation System(货号：Z3100)中的组份，100mL/瓶。

2.5无菌DEPC水的制备

纯化水的制备

用双蒸馏水，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS纯水仪纯化，要求纯化水的电阻率≥18.2MΩ.cm，贮于无菌瓶中。无菌DEPC水的制备：

Millipore-Q纯化水加入DEPC至终浓度为0.1％，37℃搅拌处理12h，151bf/in²(1.034×10⁵Pa)高压蒸汽灭菌15min。

2.675％乙醇的制备

取无水乙醇750mL，加入DEPC水250mL，混匀。

2.7RNA酶抑制剂的制备

购自Promega公司，250μL/管，50U/μL。

2.8AMV反转录酶的制备

购自Promega公司，1000μL/管，10U/μL。

2.9RT反应液的制备和检验

按下列配方配制RT反应液

无菌DEPC水            8μL

2.5mmol/L dNTP        2μL

16pmol/μL RT引物液   2μL

5倍RT缓冲液           4μL

混匀后，用0.22μm滤膜过滤。-20℃保存，检验合格后分装，用于成品试剂盒。

2.10PCR反应液制备：

按下列配方配制PCR反应液

无菌DEPC水        8μL

2.5mmol/L dNTP    2μL

8pmol/μL PCR引物混合液2μL(含有按SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2合成的寡核苷酸引物各8pmol/μL)

15mmol/L MgCl₂    2μL

10倍PCR缓冲液    2μL

混匀后，用0.22μm滤膜过滤。-20℃保存，检验合格后分装，用于成品试剂盒。

2.11 0.5U/μL Taq DNA聚合酶的制备

购自Promega公司Taq DNA聚合酶，100U/管，5U/μL。将Taq DNA聚合酶与无菌DEPC水以1∶9体积比混合，混匀。

2.12 50×TAE电泳缓冲液的制备

0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液(pH8.0)配制

EDTA            18.61g

灭菌双蒸水                80mL

氢氧化钠                  调pH至8.0

灭菌双蒸水                加至100mL

50×T AE电泳缓冲液配制

三羟甲基氨基甲烷(Tris)    242g

冰乙酸                    57.1mL

0.5mol/L EDTA溶液(pH8.0)  100mL

灭菌双蒸水                加至1000mL

使用时灭菌双蒸水稀释50倍。

2.13溴化乙锭溶液制备

溴化乙锭                  0.2g

灭菌双蒸水                加至20mL

2.14上样缓冲液的制备

溴酚蓝0.2g，加双蒸水10mL过夜溶解。50g蔗糖加入50mL水溶解后，移入已溶解的溴酚蓝溶液中，摇匀用双蒸馏水定容至100mL。

2.15矿物油的制备

购自Sigma公司，500mL/瓶。

实施实例3

与市售试剂盒比较敏感性和特异性

1材料

测试试剂盒所用样品包括：高致病性PRRSV分离毒株(包括来源于此的疫苗株)共11株，经典PRRSV共6株，SPF阴性猪样品3份，其他主要猪源病毒5株。

2方法

用新发明的高致病性PRRSV RT-PCR检测试剂盒、市售类似试剂盒检测上述样品，比较两种试剂盒的检测结果与实际正确结果的差异，分析试剂盒的性能。

3结果

两种试剂盒检测结果见下表。

(1)敏感性比较：市售试剂盒对2009年的两个高致病性PRRSV分离株和高致病性PRRSV TJ-F92疫苗漏检，而新发明的试剂盒能够检测到全部11株高致病性PRRSV分离毒株(包括来源于此的疫苗株)。

(2)特异性比较：市售试剂盒对一株经典PRRSV(CH-1R疫苗)和SPF阴性猪肺脏和扁桃体混合样出现非特异的扩增条带，而新发明的试剂盒检测6株经典PRRSV(包括来源于此的疫苗株)、3份阴性SPF猪样品、5株其他主要猪源病毒全部为阴性结果。

表4试剂盒敏感性和特异性比较

序列表

<110>中国动物疫病预防控制中心

<120>一种检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的试剂盒

<130>1

<160>60

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>上游引物

<400>1

CGCAGAACAAAGTCTGTCAAAAG

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>下游引物

<400>1

TGAGTCAGCGTTGCCTTCACAG

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>上游引物BU1

<400>1

CCTAACGGTTCGGAAGAAACTGTC

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>上游引物BU3

<400>1

AGTGAGCCCGTACTTGTGCCC

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>上游引物BU4

<400>1

AGTGAGCCCGTACTTGTG

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>上游引物BU5

<400>1

ATGAGTGAGCCCGTAC

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>上游引物BU6

<400>1

GCGACGTGTCCCCAAGCTG

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>上游引物BU7

<400>1

GACGTGTCCCCAAGCTGA

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>上游引物BU8

<400>1

GCGAGAACTCCCCAAGCTG

<210>10

<211>19

<212>DNA

<213>上游引物BU9

<400>1

GCGAGAACTGCCCAAGCTG

<210>11

<211>18

<212>DNA

<213>上游引物BU10

<400>1

GACGTGGAACCAAGCTGA

<210>12

<211>18

<212>DNA

<213>上游引物BU11

<400>1

GACGGAACTGCAAGCTGA

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>上游引物BU12

<400>1

GAGTGAGCCCGTACTTGTGC

<210>14

<211>21

<212>DNA

<213>上游引物BU13

<400>1

CTATGAGTGAGCCCGTACTTG

<210>15

<211>19

<212>DNA

<213>上游引物BU14

<400>1

CCTATGAGTGAGCCCGTAC

<210>16

<211>22

<212>DNA

<213>上游引物BU15

<400>1

GCAGAACAAAGTCTGTCAAAAG

<210>17

<211>19

<212>DNA

<213>上游引物BU16

<400>1

TTGGAAGAGGTTGTCCTGG

<210>18

<211>17

<212>DNA

<213>上游引物BU17

<400>1

GCACCCTGGTCCCTCCC

<210>19

<211>19

<212>DNA

<213>上游引物BU18

<400>1

GTCAACTCATGCTGCACCC

<210>20

<211>19

<212>DNA

<213>上游引物BU19

<400>1

GCCAGAGGACAAGCCTGTC

<210>21

<211>22

<212>DNA

<213>上游引物BU20

<400>1

AAAGCTTGCCAGAGGACAAGCC

<210>22

<211>23

<212>DNA

<213>上游引物BU21

<400>1

CGCAGAACAAAGTCTGTCAAAAG

<210>23

<211>22

<212>DNA

<213>上游引物BU22

<400>1

CAACCTCGCAGAACAAAGTCTG

<210>24

<211>23

<212>DNA

<213>上游引物BU23

<400>1

GAGTTCAACCTCGCAGAACAAAG

<210>25

<211>18

<212>DNA

<213>上游引物BU24

<400>1

GGGCGGCTGAGCAGGTCG

<210>26

<211>23

<212>DNA

<213>上游引物BU25

<400>1

CCAGGCGACTTCAGAAATGATG

<210>27

<211>23

<212>DNA

<213>上游引物BU26

<400>1

CTGCTAAAACTAGCCAACACCC

<210>28

<211>21

<212>DNA

<213>上游引物BU27

<400>1

CTCATGTCCACTGGACTTGGC

<210>29

<211>25

<212>DNA

<213>上游引物BU28

<400>1

GGTTGTCCTGGAAGAATATGGGC

<210>30

<211>23

<212>DNA

<213>上游引物BU29

<400>1

GCACCGCGTAGAACTGTGACAAC

<210>31

<211>23

<212>DNA

<213>上游引物BU30

<400>1

CGCGTAGAACTGTGACAACAACG

<210>32

<211>23

<212>DNA

<213>上游引物BU31

<400>1

GAACTGTGACAACAACGCTGACG

<210>33

<211>22

<212>DNA

<213>上游引物BU32

<400>1

GAACTGTGACAACAACGCTGAC

<210>34

<211>23

<212>DNA

<213>上游引物BU33

<400>1

CGIAGAACTGTGACAACAACGCTG

<210>35

<211>23

<212>DNA

<213>上游引物BU34

<400>1

GCGTAGAACTGTGACAACAACGC

<210>36

<211>25

<212>DNA

<213>下游引物BD1

<400>1

TGAGTCAGCGTTGTTGTCACAGTTC

<210>37

<211>25

<212>DNA

<213>下游引物BD2

<400>1

TGAGTCAGCGTTGTTTTCACAGTTC

<210>38

<211>25

<212>DNA

<213>下游引物BD3

<400>1

TGAGTCAGCGTTGTCTTCACAGTTC

<210>39

<211>25

<212>DNA

<213>下游引物BD4

<400>1

TGAGTCAGCGTTGCCTTCACAGTTC

<210>40

<211>25

<212>DNA

<213>下游引物BD5

<400>1

TGAGTCAGCGTTACCTTCACAGTTC

<210>41

<211>25

<212>DNA

<213>下游引物BD6

<400>1

TGAGTCAGCATCGTTGTCACAGTTC

<210>42

<211>25

<212>DNA

<213>下游引物BD7

<400>1

TGAGTAGGAGTTGTTGTCACAGTTC

<210>43

<211>25

<212>DNA

<213>下游引物BD8

<400>1

TGAGTAGGAATCGTTGTCACAGTTC

<210>44

<211>22

<212>DNA

<213>下游引物BD9

<400>1

TGAGTCAGCGTTGTTTTCACAG

<210>45

<211>20

<212>DNA

<213>下游引物BD10

<400>1

TGAGTCAGCGTTGTTTTCAC

<210>46

<211>25

<212>DNA

<213>下游引物BD13

<400>1

TGAGTCAGCATCGCCTTCACAGTTC

<210>47

<211>25

<212>DNA

<213>下游引物BD14

<400>1

TGAGTAGGAGTTGCCTTCACAGTTC

<210>48

<211>25

<212>DNA

<213>下游引物BD15

<400>1

TGAGTAGGAATCGCCTTCACAGTTC

<210>49

<211>22

<212>DNA

<213>下游引物BD16

<400>1

TGAGTCAGCGTTGCCTTCACAG

<210>50

<211>25

<212>DNA

<213>下游引物BD17

<400>1

TGAGTCAGCATCACCTTCACAGTTC

<210>51

<211>25

<212>DNA

<213>下游引物BD18

<400>1

TGAGTAGGAGTTACCTTCACAGTTC

<210>52

<211>25

<212>DNA

<213>下游引物BD19

<400>1

TGAGTAGGAATCACCTTCACAGTTC

<210>53

<211>22

<212>DNA

<213>下游引物BD20

<400>1

TGAGTCAGCGTTACCTTCACAG

<210>54

<211>25

<212>DNA

<213>下游引物BD21

<400>1

TGAGTCAGCATCGTTTTCACAGTTC

<210>55

<211>25

<212>DNA

<213>下游引物BD22

<400>1

TGAGTAGGAGTTGTTTTCACAGTTC

<210>56

<211>25

<212>DNA

<213>下游引物BD23

<400>1

TGAGTAGGAATCGTTTTCACAGTTC

<210>57

<211>25

<212>DNA

<213>下游引物BD24

<400>1

TGAGTCAGCATCGTCTTCACAGTTC

<210>58

<211>25

<212>DNA

<213>下游引物BD25

<400>1

TGAGTAGGAGTTGTCTTCACAGTTC

<210>59

<211>25

<212>DNA

<213>下游引物BD26

<400>1

TGAGTAGGAATCGTCTTCACAGTTC

<210>60

<211>22

<212>DNA

<213>下游引物BD27

<400>1

TGAGTCAGCGTTGTCTTCACAG