氯霉素乙酰转移酶(CAT)-缺陷型促生长素抑制素融合蛋白及其用途

摘要

提供基于嵌合促生长素抑制素的多肽、用于编码所述多肽的多核苷酸，分离和产生所述多肽的方法、及其用途。此外，提供用于增强免疫原性应答的低成本佐剂。包括基于嵌合促生长素抑制素的多肽和新型佐剂的疫苗接种也包括在内，用于促进农畜的生产力。

说明书

技术领域

本发明涉及基于嵌合促生长素抑制素的多肽、用于编码该多肽的多核苷酸、分离和产生该多肽的方法、及其用途。本发明还涉及用于增强例如本发明基于嵌合促生长素抑制素的多肽的免疫原性的新型佐剂和免疫组合物，以及涉及其他类似抗原。

发明背景

促生长素抑制素(亦称为生长激素抑制激素或GHIH)是在下丘脑以及消化系统的某些部分产生的肽激素。促生长素抑制素通常通过与G蛋白偶联促生长素抑制素受体的相互作用来参与内分泌系统的调节。这种基于促生长素抑制素的信号级联放大导致许多作用遍布整个身体。

与本发明的方面有关，已知促生长素抑制素抑制来自垂体前叶的生长激素和促甲状腺激素的释放。(Patel YC and Srikant CB5 Somatostatin and itsreceptors Adv Mol Cell Endocrinol，1999.3 43-73)。促生长素抑制素所抑制的其他激素包括胰岛素、胰高血糖素、促胰液素，促胃液素、胃蛋白酶、maletin等等。(Patel YC and Srikant CB Somatostatin and its receptors Adv Mol CellEndocrinol，1999.3 43-73)。促生长素抑制素调节如此多生长和食物利用所必需的因子/激素的能力使得促生长素抑制素成为畜牧业领域中控制动物生长的主要目标，即抑制促生长素抑制素导致目标动物中存在水平增加的生长激素，从而导致动物具有增强的产生乳汁的能力，以提供更多量的肉，等等。

尤其是，动物对促生长素抑制素的免疫已经被公认为是中和目标动物中的促生长素抑制素从而去除促生长素抑制素对动物生产力(例如奶牛的牛奶生产)各方面的正常抑制作用的方法。Reichlin S.，ed.，1987，Somatostatin，Basic and Clinical Status，Plenum Press，New York(pp 3-50，121-136，146-156，169-182，221-228，267-274)Spencer G.S.，1985，Hormonalsystems regulating growth，review，Livestock Production Science，12，31-46。重要地是，这些基于促生长素抑制素的免疫步骤避免了合成代谢激素(例如生长激素等等)在动物中的直接使用，并允许内源合成代谢因子浓度的小变化，从而可有生态上纯的食物产品。

已知促生长素抑制素在血液中具有相对较短的半衰期。为了增强促生长素抑制素的免疫作用，已经开发出免疫方案通过将促生长素抑制素与目标载体蛋白缀合以增强蛋白半衰期。这些缀合的促生长素抑制素蛋白被设计成在血液中具有增加的半衰期和增加的抗原性并因此提供增强的益处(特别是制备促生长素抑制素的成本)。例如，嵌合促生长素抑制素蛋白公开于美国专利号6,316,004(和相应欧洲专利EP0645454)，其中与其他常规免疫或基于合成代谢激素的方法相比，各种含缀合的促生长素抑制素的蛋白示出在农畜的生产力方面具有提高的抗原性和功能。

但是，需要基于较低剂量、较高抗原性的免疫组合物和方法以提高畜牧业领域中总的生产力和适时性(timeliness)。本发明目的在于提供这些基于抗原性和功能活性更高的促生长素抑制素的免疫化合物、组合物和方法。

在此背景下提供下列内容。

发明概述

本发明提供具有增强的促生长素抑制素免疫原性的新型多肽和编码它们的多核苷酸。本发明的多肽包括通过功能优化接头与基本上失活的氯霉素乙酰转移酶蛋白融合的促生长素抑制素-14。如下文更详细地描述的那样，本发明的嵌合多肽提供用于畜牧业领域的高效和低成本材料。本发明的实施方案包括如SEQ ID NO：1-14定义的氨基酸和核酸序列。

本发明还提供生产和纯化方法以制备无内毒素和高功能状态的本发明的嵌合多肽。不含内毒素的多肽为用于一些目标动物提供了实质和出乎意料的优势，所述动物中少量的内毒素通常认为有利于引发免疫原性应答，而事实上导致显著的功能性劣势。当本发明的多肽用于免疫美国繁殖和饲养的奶牛时尤其是这种情况。此外，因为与常规材料相比本发明的嵌合多肽显示增强的功能，所以使用更小和更低数目的剂量来免疫目标动物。这种所需量的降低还提供了本发明疫苗中内毒素的相应降低。本发明嵌合多肽的无内毒素分离以及更小的使用剂量的组合允许本发明中使用基本上不含内毒素的疫苗。

本发明还提供与常规佐剂材料相比具有增强的功能和安全性的佐剂组合物。本文的佐剂不包含动物来源的材料并且不含大部分已知的化学致癌物，例如苯及其他类似材料。本文的佐剂组合物已被证明当与目标抗原组合时在引发免疫应答方面出乎意料地有效。

本发明进一步提供包含本发明嵌合多肽以及本发明佐剂组合物的疫苗。本文的疫苗用于在经过疫苗接种的哺乳动物和禽类(例如目标农畜)中诱导免疫应答。用于本文的示例性农畜包括：奶牛、猪、绵羊、山羊、火鸡、兔、和公牛犊。在一些方面，制备并纯化具有低量或没有连带的内毒素的本发明多肽。这些疫苗已经被优化以在目标动物中引发安全和增强的免疫原性反应。

本发明进一步包括利用本发明的疫苗接种目标哺乳动物和禽类的方法。提供了示例性的方法用于以安全(对于动物和最终用户)、有成本效益且高度有用的方式来接种奶牛以增强牛奶生产。其他示例性的方法包括对小猪、绵羊、火鸡、山羊、兔或公牛犊的疫苗接种以便以安全和有成本效益的方式提高目标动物的肉(尤其是瘦肉)生产。

通过阅读下列详细描述并浏览所附权利要求，本发明的这些以及各种其他特征和优点将是显而易见的。

附图简述

图1是依照本发明实施方案的pET30b CatSom质粒的示意图。该质粒包括全部依照本发明实施方案的卡那霉素抗性标记、Lac操纵基因、T7启动子、CAT编码序列，还包括依照本发明的接头区以及依照本发明的促生长素抑制素编码区。

图2是示例性的经染色的SDS-PAGE，显示的28KD条带对应于本发明经密码子优化的、CAT缺陷型促生长素抑制素多肽的预测大小。泳道1是LB+IPTG，还原的，泳道2是LB，还原的，泳道3是LB+IPTG及泳道4是LB。

图3A和3B是显示经疫苗接种的(利用如实施例描述的疫苗)和对照奶牛(BSY)每天以升为单位的牛奶生产的表格。每头奶牛都具有特定的数字标识，如每个表格中所示。

序列的鉴定和序列标识符

SEQ ID NO：1 AGCKNFFWKTFTSC

SEQ ID NO 1a GCTGGCTGCAAGAATTTCTTCTGGAAGACTTTCACATCCTGT

SEQ ID NO：2(His192-＞Gly，His193-＞Gly)：

Atggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttgcccgcct g a t gaatgctcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaa ac tg aa acgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacc tgg cct att tccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatat ggac aact tctt cgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttggtggtgccgtt

SEQ ID NO：3：(His192-＞Gly，His193-＞Gly)：

Mekkitgyttvdisqwhrkehfeafqsvaqctynqtvqlditaflktvkknkhkfypafihilarlmnahpefrmamkdgelviwdsvhpcytvfheqtetfsslwseyhddfrqflhiysqdvacygenlayfpkgfienmffvsanpwvsftsfdlnvanmdnffapvftmgkyytqgdkvlmplaiqvggavcdgfhvgrmlnelqq

SEQ ID NO：4(His 193-＞Gly)

Atggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgctcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatggtgccgtttgtgatggcttccatgtcggccgtatgcttaatgaactgcagcag

SEQ ID NO：5(1 His193-＞Ala)

Atggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagtttttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgctcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatgctgccgtttgtgatggcttccatgtcggccgtatgcttaatgaactgcagcag

SEQ ID NO：6(1 His+CAT wt)

Atggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggccttttattcacattcttgcccgcctgatgaatgctcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctggggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatggtgccgtttgtgatggcttccatgtcggcagaatgcttaatgaactgcagcag

SEQ ID NO：7(1个H-＞G)：

Mekkitgyttvdisqwhrkehfeafqsvaqctynqtvqlditaflktvkknkhkfypafihilarlmnahpefrmamkdgelviwdsvhpcytvfheqtetfsslwseyhddfrqflhiysqdvacygenlayfpkgfienmffvsanpwvsftsfdlnvanmdnffapvftmgkyytqgdkvlmplaiqvhgavcdgfhvgrmlnelqq

SEQ ID NO：8：(H-＞A)

Mekkitgyttvdisqwhrkehfeafqsvaqctynqtvqlditaflktvkknkhkfypafihilarlmnahpefrmamkdgelviwdsvhpcytvfheqtetfsslwseyhddfrqflhiysqdvacygenlayfpkgfienmffvsanpwvsftsfdlnvanmdnffapvftmgkyytqgdkvlmplaiqvhaavcdgfhvgrmlnelqq

SEQ ID NO：9

tgggaactgcaccgttctggtccacgcccgcgccctcgcccacgtccggaattcatg

SEQ ID NO：10

welhrsgprprprprpefm

SEQ ID NO：11

welhrsgp(rp)nefm 其中n＞1

SEQ ID NO：12

Atggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgctcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttggtggtgccgtttgtgatggcttccatgtcggccgtatgcttaatgaactgcagcagtgggaactgcaccgttctggtccacgcccgcgccctcgcccacgtccggaattcatggccggctgcaagaacttcttttggaaaacctttacgagctgc

SEQ ID NO：13

mekkitgyttvdisqwhrkehfeafqsvaqctynqtvqlditaflktvkknkhkfypafihilarlmnahpefrmamkdgelviwdsvhpcytvfheqtetfsslwseyhddfrqflhiysqdvacygenlayfpkgfienmffvsanpwvsftsfdlnvanmdnffapvftmgkyytqgdkvlmplaiqvggavcdgfhvgrmlnelqqwelhrsgprprprprpefmagcknffwktftsc

SEQ ID NO：14

mekkitgyttvdisqwhrkehfeafqsvaqctynqtvqlditaflktvkknkhkfypafihilarlmnahpefrmamkdgelviwdsvhpcytvfheqtetfsslwseyhddfrqflhiysqdvacygenlayfpkgfienmffvsanpwvsftsfdlnvanmdnffapvftmgkyytqgdkvlmplaiqvhhavcdgfhvgrmlnelqqwelhrsgprprprprpefmagcknffwktftsc

发明详述

本发明的实施方案提供具有增强的促生长素抑制素免疫原性的嵌合多肽，以及编码其的核酸构建体。本文的实施方案包括用于制备该嵌合蛋白的方法以及使用该嵌合蛋白增加目标农畜的某些生产力的方法，特别是用于增加奶牛的牛奶生产以及牛、猪、绵羊、兔、山羊、公牛犊等的肉生产。

本发明的实施方案还包括与本发明嵌合蛋白一起使用的新型佐剂，用于增强目标动物中的免疫原性、增强对被疫苗接种的目标动物的安全性和增强对目标动物的用户即经疫苗接种动物的消费者或对来自疫苗接种动物的产品的消费者的安全性。

在一个方面，本发明提供设计用于增强促生长素抑制素的免疫原性的嵌合促生长素抑制素蛋白。嵌合促生长素抑制素蛋白实施方案包括通过接头序列与基本上失活的氯霉素乙酰转移酶(CAT)截短蛋白连接的促生长素抑制素-14的氨基酸序列。在一些情况下，接头(在本文也称为间隔区)已被优化以增强嵌合多肽在目标宿主细胞中的产生。在其它情况下，提供用于产生和分离这些增加了量的基本上无内毒素状态的嵌合蛋白的方法。

在另一个方面，本发明提供掺入了本发明嵌合促生长素抑制素蛋白的新型佐剂组合物(其不包含任何动物来源的蛋白质或化学物如苯)和疫苗。实施方案包括出乎意料有效的佐剂/嵌合促生长素抑制素蛋白(通常基本上不含内毒素)，即用于在经疫苗接种的目标农畜中诱导抗原性的新型疫苗、组合物。在一些实施方案中，该目标农畜是奶牛、公牛犊、猪、山羊等。注意虽然本发明的佐剂与本文的嵌合促生长素抑制素蛋白结合在一起进行描述，但是可预见本发明的佐剂可以与其他疫苗以及在各种目标动物(例如人、猪、狗、猫等)中使用。

在其他方面，提供使用低至一剂量的这种新型疫苗来接种目标农畜的方法，以获得增强的生产力，特别是在奶牛和其他类似农畜中获得增强的奶生产。这些改进的剂量方法(更少的疫苗接种次数和更低的嵌合促生长素抑制素浓度)提供时间效率和更低的成本，当拓展至乳品工业时其代表农畜生产力的显著进步。此外，本文的方法避免使用重组生长激素疗法，这是保健行业的顾虑，即对于目标农畜、最终用户和环境的顾虑，其中重组生长激素的排泄释放入地下水供应。

定义

提供下列定义以促进对本文频繁使用的一些术语的理解，不是为了限制当前公开内容的范围。

术语“氨基酸”是指20种天然存在的氨基酸中的任意氨基酸以及任何经修饰的氨基酸序列。修饰可以包括自然过程诸如翻译后加工，或者可以包括本领域已知的化学修饰。修饰包括但不限于：磷酸化、泛素化、乙酰化、酰胺化、糖基化、黄素共价附着、ADP-核糖基化、交联、碘化、甲基化等。

术语“嵌合多肽”或融合蛋白是指已经连接第二异源多肽的第一多肽，从而该第一和第二多肽在框架中表达。通常该两个多肽可以通过接头或间隔区区段连接以优化本发明嵌合多肽的表达与功能。

术语“内毒素”是指结合在革兰氏阴性菌细胞壁中的毒素。一些情况下，该毒素是革兰氏阴性菌细胞壁外膜的细菌膜组成的脂多糖成分。

术语“宿主细胞”是指在离体(ex vivo)培养中建立的细胞。本文描述的宿主细胞的特性是它们能够表达本发明的嵌合蛋白。可用于本发明方面的合适宿主细胞的实例包括但不限于细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞。这类细胞的具体实例包括SF9昆虫细胞(Summers and Smith，1987，TexasAgriculture Experiment Station Bulletin，p1555)、大肠杆菌(E.coli)细胞(BL21(DE3)，Novagen)、酵母(Pichia Pastoris，Invitrogen)和人肝细胞(Hep G2(ATCC HB8065)。

术语“核酸序列”是指沿着脱氧核糖核酸链的脱氧核糖核苷酸的序列顺序。这些脱氧核糖核苷酸的顺序决定了沿着多肽链的氨基酸顺序。所述脱氧核糖核苷酸序列编码所述氨基酸序列。

术语“蛋白”，“肽”和“多肽”可互换使用来表示氨基酸聚合物或一组两个或多个相互作用的或结合的氨基酸聚合物。

术语“基本上”是指“很大程度上”例如基本上去除表示至少75％、更典型至少80％、85％、90％、95％和最典型96％、97％、98％、99％的目标材料被去除；基本上失活表示至少75％、更典型80％、85％、90％、95％和最典型96％、97％、98％、99％的酶被失活。因此，基本上失活的CAT酶是其活性被去除75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的酶。(CAT活性可以使用已知的功能性测定法来确定，例如n-丁酰辅酶A与放射性标记的氯霉素的结合及随后通过液体闪烁计数(LCS)测量；通过由薄层层析法确定从[¹⁴C乙酰辅酶A转移到氯霉素的放射性标记的量(参见Molecular Cloning：A Laboratory Model，3^rd ed.，J Sambrook and DWRussell，2001.Cold Spring Harbor Press]或其它已知或类似的测定法。

术语“载体”用于表示将DNA区段从一个细胞转移到另一个细胞的核酸分子。术语“运载体(vehicle)”有时可以与载体互换使用。两种常见类型的载体是质粒和病毒载体。

促生长素抑制素

大量研究显示用促生长素抑制素免疫的动物具有10-20％的平均日增重，食欲降低9％以及食物利用效率增加11％。用促生长素抑制素免疫的动物还有它们的后代具有正确的比例并且动物重量在肌肉、骨和脂肪之间的分布与对照动物相同(参见Reichlin，1987)。因此，促生长素抑制素免疫提供了增强目标动物的生产力的有效且安全的方法。当与重组生长激素的使用相比时尤其是这种情况，所述重组生长激素的使用引起了对经处理的动物的奶或肉中激素的担忧或者对动物自身的安全性的担忧或者对生态系统特别是地下水供应中激素积累的担忧。

促生长素抑制素-14是在下丘脑和胃肠道中产生的具生物活性的十四肽。该十四肽的氨基酸序列是AGCKNFFWKTFTSC(SEQ ID NO：1)。促生长素抑制素-14的序列在哺乳动物中是高度保守的(Lin XW et al.Evolutionof neuroendocrine peptide systems：gonadotropin- releasing hormone andsomatostatin.Comp Biochem Physiol C Pharmacol Toxicol Endocrinol.1998119(3)：375-88)。该十四肽由核酸序列GCTGGCTGCAAGAATTTCTTCTGGAAGACTTTCACATCCTGT(SEQ ID NO：1a)编码(注意其他核酸序列可用于编码SEQ ID NO：1，而提供SEQ ID NO：1a是为了说明目的)。

已知促生长素抑制素-14对参与动物的生长和食物利用的大量激素具有强抑制作用。如先前在美国专利号6,316,004(对所有用途在本文援引加入)中所述，促生长素抑制素-14和促生长素抑制素的嵌合形式可用于动物的免疫以增加每天重量，以及合适情况下增加奶的生产。这些免疫方法利用常规佐剂来进行且未使用本发明的基于促生长素抑制素的材料。注意利用抗促生长素抑制素抗体处理目标动物已被证明是过分昂贵并且功能不显著，从而由于不实用而放弃了直接抗体处理。Muromtsev G.S.，et al.，1990，Basics of agricultural biotechnology，Agropromizdat，Moscow，pp 102-106。本发明的一个方面基于以下概念：由本文描述的组合物和方法所形成的抗促生长素抑制素抗体减弱但不完全消除目标动物中促生长素抑制素的大部分抑制作用。此方法在经免疫的目标动物中产生生长和生产力的天然和成比例增长。

因此，本发明的方面通过提供用于免疫目标动物的高免疫原性材料来促进基于促生长素抑制素的免疫。这些基于促生长素抑制素的免疫化合物已经对表达和抗原性进行了优化。在一些实施方案中，促生长素抑制素-14被表达为密码子优化的、CAT缺陷型促生长素抑制素嵌合多肽。这些材料提供了超过其它基于免疫的疫苗的出乎意料的改进。

新型密码子优化的、CAT缺陷型促生长素抑制素构建体

本发明的一个方面提供分离的核酸分子，其编码具有优化的促生长素抑制素免疫原性活性的嵌合蛋白。特别是，本发明的实施方案包括新型核酸构建体，其编码具有促生长素抑制素的免疫原性活性的CAT融合蛋白。已经对这些多肽在免疫步骤中的最佳功能活性进行了鉴定。

在一个实施方案中，提供具有如图1所示简图的构建体以编码本发明的嵌合多肽。本发明的核酸构建体通常编码不具有10个C末端氨基酸的失活CAT酶并且包括一或两个组氨酸置换的氨基酸。CAT的基本上失活避免了经注射的目标动物中对CAT的不良反应(从而避免了CAT抗性)。注意氯霉素是牛类产业中常用抗生素，牛类中对氯霉素的抗性将会对使用本发明材料疫苗接种的动物的安全性不利。因此，具有失活的CAT的构建体在经疫苗接种的动物中具有CAT的免疫原性但没有抗性的不良副作用(对于动物是成问题的安全性议题)。

通过去除His193的咪唑基(规范CAT_III变体中的His 195，参见下文的Lewendon et.al.)来使CAT酶失活。在另一个实施方案中，通过去除His 193和邻近的His192二者的咪唑基(对于CAT_III分别是His195和His194)而使CAT酶失活。从CAT的活性位点去除重要的His193(CAT_III中是His195)咪唑基并用丙氨酸、甘氨酸或其他类似氨基酸置换导致CAT酶的基本上失活(Lewendon A et al.(1994)Replacement of catalytic histidine-195 ofchloramphenicol acetyl transferase：evidence for a general base role forglutamate.Biochemistry.33(7)：1944-50)。最后，本文的实施方案还可以包括通过单独去除His192(对于CAT_III来说是His 194)的咪唑基使CAT酶失活。至于His193，可以用丙氨酸、甘氨酸或其他类似氨基酸进行置换。

在一些方面，一或多个被置换的组氨酸氨基酸由位于SEQ ID NO：2的位置号574-576和577-579(对应于SEQ ID NO：3中氨基酸编号192和193)的核酸编码。在一些实施方案中，本发明的核酸序列包括SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。包括本文中组氨酸置换构建体的本发明嵌合蛋白提供几乎或完全没有CAT活性的高免疫原性蛋白，是对现有技术的显著改进。基本上失活的CAT酶实施方案与本发明的促生长素抑制素多肽附着。这种附着直接完成或利用接头完成(下文将更完整地描述)。

靶位点(His192和/或His193)的失活可以通过本领域技术人员已知的任何数目的方法实现，包括位点定向诱变和合成基因组装(synthetic geneassembly)。在一个实施方案中，编码组氨酸193的核酸序列被修改为编码丙氨酸、甘氨酸或其他类似氨基酸。在另一个实施方案中，编码组氨酸192的核酸序列被修改为编码丙氨酸、甘氨酸或其他类似氨基酸。对于192和193嵌合多肽的典型组合置换包括：丙氨酸，丙氨酸；丙氨酸，甘氨酸；甘氨酸，丙氨酸；和甘氨酸，甘氨酸。

本发明的实施方案还包括本发明CAT缺陷型多肽的氨基酸序列，包括具有SEQ ID NO：7、8和3的氨基酸序列(对应于193位的his-＞gly，193位的his-＞ala，以及192和193位的his-＞gly)。

如图1所示，可以通过长度可变间隔区将基本上无活性的CAT酶与促生长素抑制素-14连接。要求所述间隔区确保编码的促生长素抑制素呈现在球形表面。本文的间隔区实施方案提供最佳蛋白酶抗性和最佳表位暴露并且包括在本发明的嵌合多肽中显示相对于没有本发明接头序列的构建体的出乎意料的改进。

因此，间隔区实施方案已经在长度和组成上被优化以确保在各种微生物尤其是大肠杆菌中CAT缺陷型促生长素抑制素的表达。如美国专利号6,316,004描述的原始构建体包括具有罕用大肠杆菌密码子的间隔区且需要来自第二或辅助质粒的罕用tRNA的共表达。本文的间隔区实施方案去除这些罕用大肠杆菌密码子，从而去除对第二辅助质粒的需要，是对先前技术的改进。

在典型实施方案中，所述间隔区具有核酸序列tgggaactgcaccgttctggtccacgcccgcgccctcgcccacgtccggaattcatg(SEQ ID NO：9)。本发明间隔区的一个实例具有氨基酸序列welhrsgprprprprpefm(SEQ ID NO：10)。本发明间隔区的典型氨基酸序列是welhrsgp(rp)_nefm，其中n＞l(SEQ ID NO：11)。如上所述，这些新型间隔序列提供增强的蛋白酶抗性(从而允许与美国专利号6,316,004公开的构建体相比增加的产量)和最佳促生长素抑制素-14暴露。当用来免疫目标动物以增强生产力时，通过最佳配置的接头与基本上失活的CAT酶(组氨酸置换构建体)附着的促生长素抑制素-14的组合显示超过其他常规材料的出乎意料和令人惊讶的改进。

尽管在功能上不是最佳的，可变长度的其他接头序列也可用于将促生长素抑制素-14附着到基本上无活性的CAT酶。此外，预期促生长素抑制素-14与基本上无活性的CAT酶的直接融合也可在本文中使用，被认为属于本发明的范围内。

载体和宿主细胞

本发明还涉及包括本发明多核苷酸分子的载体，以及用这类载体转化的宿主细胞。可以将本发明的任意多核苷酸分子与用于感兴趣增殖宿主的载体相连，该载体通常包括选择性标记物和复制起点。宿主细胞被遗传改造以包括这些载体，从而表达本发明的多肽。通常，本文的载体包括与合适的转录或翻译调节序列(如用于微生物或病毒宿主细胞的那些)可操纵地连接的本发明多核苷酸分子。调节序列的实例包括转录启动子、操纵基因、或增强子、mRNA核糖体结合位点、以及控制转录和翻译的适当序列。当本文的调节序列功能性地涉及本发明的嵌合多肽编码多核苷酸时，核苷酸序列是可操纵地连接的。

典型的运载体包括质粒、酵母穿梭载体、杆状病毒、失活的腺病毒等。在一个实施方案中，运载体是经修饰的pET30b CatSom质粒(参见图1)。用于本文的目标宿主细胞包括细菌宿主例如大肠杆菌，酵母，SF-9昆虫细胞，哺乳动物细胞，植物细胞等。

在一个实施方案中，调节序列包括用于在大肠杆菌或其他类似微生物中表达本发明嵌合多肽的T71ac、CAT、Trp、或T5启动子。这些调节序列是本领域已知的并在合适和已知条件下使用。

当经过遗产修饰的绿色植物细胞用于表达时，可以使用由PlanetBiotechnology及其他开发的系统。

已经构建了本发明的各种质粒以通过使用目标调节序列来表达本发明的嵌合多肽。示例性的质粒可包括T71ac启动子(参见图1)。

用于表达目标嵌合多肽的宿主细胞包括原核生物、酵母和高等真核细胞。示例性的原核宿主包括埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、和沙门氏菌属(Salmonella)以及假单胞菌属(Pseudomonas)和链霉菌属(Streptomyces)的细菌。在典型实施方案中，宿主细胞是埃希氏菌属的，可以是大肠杆菌。

如下文实施例所示，本发明的构建体提供在各种条件下最佳的CAT缺陷型促生长素抑制素表达。这些构建体在原核宿主尤其是埃希氏菌属的细菌中表达特别有效。还要注意各种植物表达系统也可以用于本发明中，通常使用根瘤土壤杆菌(Agrobacterium trameficies)。

无内毒素的融合蛋白纯化

本发明的方面包括使用无内毒素的、经密码子优化的、CAT缺陷型促生长素抑制素用于动物尤其是农畜(一些情况下是美国繁育的奶牛)疫苗接种的用途。无内毒素的材料对于美国的牛繁育和饲养尤其重要(参见例如Drackley，JK 2004.Physiological adaptations in transition dairy cows.pp 74-87in Proc.Minnesota Dairy Herd Health Conf.，St Paul，MN.University ofMinnesota，St.Paul)。

在一个实施方案中，通过用合适的含促生长素抑制素的运载体转化目标细胞来制备本发明的嵌合免疫原性的含促生长素抑制素的蛋白质。如上所述，用于本文的运载体包括适于在选定的目标细胞中表达的已知质粒和载体系统。

在本发明的一个方面，在目标宿主细胞中表达嵌合免疫原性的含促生长素抑制素的蛋白质。利用目标调节序列进行嵌合蛋白表达。在一些方面，已经将所述嵌合多肽优化(特别是关于本文公开的间隔区序列)以在大肠杆菌中表达。

然后可以根据已知的蛋白纯化技术包括例如溶菌酶裂解，内涵体差速离心，筛层析(sieve chromatography)等来纯化嵌合蛋白。重折叠方法可以在碱性pH于氯化胍和尿素中进行，然后进行透析和冻干。

在一个实施方案中，利用密码子优化的含CAT缺陷型促生长素抑制素的质粒-pET30b CatSom来转化大肠杆菌细胞；该pET30b CatSom具有用于表达的合适的大肠杆菌基础调节序列(base regulatory sequence)。一些情况下，大约十升这些细胞的发酵提供至少500克总生物量，一些情况下提供600克总生物量，产生约4-6克的总蛋白质。从银和考马斯蓝染色估算多达一半的蛋白质可能是嵌合蛋白(参见实施例2和图2)。

在本文一些实施方案中，从经转化的宿主细胞中纯化基本上不含内毒素状态的本发明嵌合蛋白。认识到在一些动物尤其是奶牛中，内毒素尤其是多次与内毒素的接触导致实质上受损的(compromised)动物(在美国繁育和饲养的奶牛中的乳腺炎和内毒素休克)是本发明人获得的出乎意料和令人惊讶的结果。这一认识导致了尝试去除或降低奶牛疫苗接种中内毒素剂量或暴露次数。注意这种基于内毒素的效应在俄罗斯和其他国家繁育和饲养的奶牛中很少被意识到，因为所述奶牛是不同牛品系的后代。HolsteinAssociation，1 Holstein Place，Brattleboro，Vermont 05302-0808。在美国奶牛中的这一发现通常与以下预期相反：即疫苗应当包括低量的一些内毒素以帮助最大化动物的免疫应答，就如在一些其他欧洲市场用促生长素抑制素疫苗接种奶牛的情况一样(参见美国专利号6,316,004)。

因此，本文的一些实施方案在于产生用于疫苗(特别是用于牛类产业的疫苗和用于美国范围内的牛类产业的疫苗)的基本上不含内毒素的嵌合蛋白。在一些实施方案中，内毒素水平是或低于1EU/ml，在其他实施方案中，内毒素水平被基本上消除，即本发明的嵌合多肽基本上不含内毒素。

在一个实施方案中，将从裂解的宿主细胞回收的IB用不含内毒素的洗涤液(即无内毒素的水或溶液)洗涤多次。可将所回收的IP沉淀任选洗涤至内毒素水平低于大约1EU/ml(内毒素检测可以使用一或多种已知测定法进行，包括来自MP Biochemicals、Charles River等的商业可得检测试剂盒)。在一些实施方案中，所述洗涤液不含内毒素且包括一或多种蛋白酶解蛋白抑制剂，例如苯甲基磺酰氟(PMSF)，4-(2-氨乙基)-苯磺酰氟(AEBSF)等。在一些实施方案中，所述洗涤液是磷酸缓冲盐水(PBS)，其具有抑制有效量的PMSF、AEBSF或PMSF和AEBSF二者的组合。

在一些方面，基本上不含内毒素的沉淀可以用pH 12.5的含尿素的蛋白解折叠溶液处理并在含降低了的摩尔浓度的尿素及精氨酸、甘油和/或蔗糖的蛋白重折叠溶液中重折叠。将纯化的嵌合蛋白浓度调整为1到3mg/ml之间，且典型大约是1.4到1.8mg/ml。一些情况下，以约1.5到5mg/2ml的剂量及更典型地2.0到3.5mg/2ml的剂量向疫苗配方提供基本上不含内毒素的嵌合蛋白。

其他内毒素去除方法被预期属于本发明的范围之内，包括例如商业可得的离子交换内毒素去除柱、疏水柱等(参见例如Mustang E或G Columns(Millipore))。

增强的免疫应答佐剂

本发明的实施方案提供用于增强体液免疫诱导的新佐剂。相比诱导体液免疫的常规材料，这些佐剂提供显著的改进。本文的佐剂可以与许多疫苗一起使用，但在实施例中显示与本发明的多肽一起使用用于对奶牛、猪或公牛犊进行疫苗接种。

重要地是，本文佐剂的所有成分为非动物来源，从而消除了经疫苗接种的动物被潜在污染的佐剂成分的潜在交叉污染。例如，本文的实施方案可以利用不含动物来源的Tween 80。当目标动物是奶牛时这尤其重要，这是由于对牛海绵状脑病(BSE)或其他类似牛疾病的顾虑。注意这些顾虑同样适用于人类治疗，其中非动物来源的佐剂提供显著的安全益处。此外，本文的佐剂实施方案不含苯和其他类似致癌化合物。这些实施方案提供大部分常规佐剂化合物中所没有的安全益处。例如，本文实施方案可以利用或不含苯的多环酸。

在一个实施方案中，免疫佐剂包括与在乳剂预混合液内混合的所选抗原相组合的水包油乳剂。

用于本文的示例性水包油乳剂包括矿物油、Tween 80、Span 85和目标聚合物(不含苯的聚丙烯酸)的组合。在一些情况下，所述目标聚合物选自由Carbomer Homopolymer Type B组成的组。典型的油-水乳剂包括约8-10％矿物油(v/v)、0.003到0.004％ Tween 80(v/v)、0.007到0.008 Span 85(v/v)和0.04到0.06％聚合物(w/v)。

示例性的本发明乳剂预混合液由高分子量聚合物、表面活性剂和大约为50％油-水基(oil-aqueous base)的乳化剂组成。用于本文的高分子量聚合物包括与季戊四醇的烯丙基醚交联的丙烯酸。在一些情况下，该高分子量聚合物具有约29,000和40,000之间的Brookfield RVT粘度，例如，Carbopol(R)974P(Noveon，Inc)。

用于在奶牛或其他目标农畜中获得优化的免疫应答的方法

根据本发明的组合物和方法，本文描述的免疫原性组合物(不含内毒素、密码子优化的、CAT缺陷型促生长素抑制素构建体)与如上所述的新佐剂组合，提供本发明的疫苗。在一个实施方案中，施用总剂量为2.98mg/2ml(其中5％到25％是佐剂(v/v)，更典型10％到20％是佐剂，最典型约20％是佐剂)的不含内毒素的、密码子优化的CAT缺陷型促生长素抑制素构建体。注意其它常规佐剂被预期在本发明的范围内且可以与本发明的密码子优化的CAT缺陷型促生长素抑制素构建体一起使用，但是当以此容量使用本文的新型佐剂时显示最佳结果。

新型促生长素抑制素构建体和佐剂的目的是增加目标动物(典型是农畜，更典型是奶牛、公牛犊、绵羊、猪、或山羊)的生产力。

将制剂肌内或皮下注射，优选少于12次，更优选少于6次，在一些情况下少至只有一次。当在目标动物中需要超过一次注射时，在下次注射前典型间隔14到28天。如上所述，本文实施方案避免对目标动物使用重组激素处理，这是在畜牧业领域中的主要益处(重组生长激素已被与女孩出现性早熟和各种环境顾虑(即来自经处理的牛的粪肥可有害地影响表面和地下水环境)联系在一起。

本发明的无菌组合物可以通过皮下或肌内途径施用。在典型情况下，施用部位是目标动物的颈或尾，尽管也可以利用其他部位。注意使用部位不应引起阻碍动物移动、进食、饮水等能力的不良反应。

如上所述，本文的疫苗，典型无内毒素状态的疫苗使用本文描述的新型佐剂在奶牛、牛、猪等的肉和奶的生产方面提供显著改进。但是这些处理不伴随饲料消耗的增加。

实施例

提供下列实施例只是为了说明目的，而不是意图限制本发明的范围。

实施例1：CAT缺陷型促生长素抑制素融合蛋白的构建

本实施例说明了根据本发明实施方案的CAT缺陷型促生长素抑制素融合蛋白的产生。在质粒pET30b-Cat-Som上进行位点定向诱变以便用甘氨酸残基置换His192和His193(修饰后：Gly192和Gly193)。His193(和His192)残基的失活消除了CAT酶接受质子的能力，从而提供CAT的完全失活。

为了在缺乏共表达的tRNA分子的情况下由大肠杆菌表达而对相同的pET30b-Cat-Som(具有所述His置换)中的间隔区进行了密码子优化。

修饰的CAT缺陷型促生长素抑制素核酸构建体如SEQ ID NO：12所示。CAT缺陷型促生长素抑制素融合蛋白序列如SEQ ID NO：13所示，与未修饰的CAT促生长素抑制素融合蛋白(SEQ ID NO：14)相比较。

实施例2：CAT缺陷型促生长素抑制素融合蛋白可以高水平表达

如实施例1所述的密码子优化的CAT缺陷型促生长素抑制素构建体被用于在BL21(DE3)细胞中表达融合蛋白。经转化的细胞在LB中生长并用0.4mM的IPTG诱导大约3小时。将来自密度为OD 0.7的培养物的1毫升细胞沉淀并在100μl的SDS样品缓冲液中于70℃加热十分钟。在每条泳道上样40μl的细胞提取物样品进行SDS PAGE。

如图2所示，在用IPTG诱导后，在泳道1(LB+IPTG，还原的)和3(LB+IPTG)观察到28KD的条带，其对应于密码子优化的CAT缺陷型促生长素抑制素融合蛋白的预测大小。在对照泳道2(LB，还原的)和4(LB)中没有看到表达。如所预期，当在标准或还原条件下电泳时融合蛋白的大小不存在差异。

实施例3：含无内毒素的密码子优化的CAT缺陷型促生长素抑制素的疫苗根据本发明的示例性疫苗：

a.JH 14(佐剂)               24ml

矿物油  -50％(v/v)

Tween 80-0.1694％(v/v)

Span 85-0.1915％(v/v)

Carbopol 974NP-0.125％(w/v)

b.本发明的重折叠蛋白        95.6ml

(2.96mg/ml)- 见实施例2

c.磷酸缓冲盐水              35.6ml

d.抗细菌剂/抗真菌剂         0.36mo

120ml

实施例4：无内毒素的嵌合肽/佐剂提供增加的奶生产

鉴定了奶牛的随机集合(pool)(Holstein Crosses-US繁育并饲养)，每头均是产犊后31到65天(3^rd到5^th泌乳期)。由兽医检查每头奶牛并确定处于最佳健康状态。

本研究中平均牛体重为约1,000到1,200lbs。用JH14中的1.96mg/嵌合蛋白/2ml剂量处理6头泌乳牛。或者，向9头泌乳牛提供常规rBST处理。在大规模、密集的(intense)牛奶生产场进行处理和牛奶生产研究。

疫苗接种在第0天进行。在第4周检测Anti-SST血清抗体和IGF-1血清水平。按照定期方案进行产奶及对动物综合健康状态进行鉴定。

用本文所述的创造性组合物疫苗接种的6头奶牛具有正常表现，没有内毒素反应或食物戒除(food withdrawal)。所有6头奶牛对SST都有阳性血清学应答，平均效价为1∶14。该6头奶牛的牛奶生产只利用一次疫苗接种而得到(参见图3A)，显示出平均产量增加23.7％。

第0和14天使用常规rBST注射处理的9头奶牛的牛奶生产力的总体平均值增加2％(参见图3B)。

此实施例的数据显示在奶牛中组合使用无内毒素的构建体和创造性的佐剂在有效性方面有显著改进。与不接受两次rBST的奶牛相比，这些结果对于动物的健康状况和生产力方面有显著改进。

实施例5：无内毒素嵌合肽/佐剂在经处理母猪的小猪中提供增加的肉生产

鉴定母猪的随机集合，每只均是产崽前至少35-36天。由兽医检查每只母猪并确定处于最佳健康状态。使用本发明的疫苗(见实施例3)免疫怀孕的母猪两次，一次在分娩前35-36天，一次在分娩前8天。将保留对照组怀孕母猪用于比较目的(没有疫苗接种或用无菌盐水疫苗接种)。

来自疫苗接种组的分娩的小猪具有更强的生存性并且具有更大的平均大小。小猪大小的增加增强了百分比生存性，因为较大的小猪较少会被从母猪的奶头推开。在第21天、第30天和第75天称重经处理的和对照小猪。在75天期间的过程中本发明的疫苗接种将小猪每日体重增加平均35％。

重要地是，小猪生存性和重量是通过使用没有重组生长激素的本发明的疫苗来增加的。这是相对重组激素疗法的显著改进。

实施例6：无内毒素嵌合肽/佐剂在经处理的公牛犊中提供增加的肉生产

鉴定公牛犊的随机集合(1到3月龄)并注射本发明的组合物。将在大约10个月期间内监测重量增加并与对照组比较，对照组在各种意义上均与注射组采用相同处理，除了本发明的疫苗注射之外。处理的过程中由兽医检查每只公牛犊并决定处于最佳健康状态。

在第0周、第4周和第8周进行对于疫苗接种组的本文注射(总共3次疫苗接种)。利用18-21号(gauge)cc针头皮下或肌内疫苗接种至颈部。还提供加强注射(4次加强、3次加强或无加强)。疫苗接种注射包括2mg/2ml所述嵌合多肽。按照本文描述制备该嵌合多肽，具有本发明的CAT中全部两个被甘氨酸氨基酸置换的组氨酸残基和优化接头，如SEQ ID NO：3所示。

称重经疫苗接种的公牛犊和对照牛犊以获得初始重量。预期本文疫苗接种的动物将显示相对于对照动物15到40％的重量增加。经处理的公牛犊平均体重的这种增加显示相对未经处理的显著优势。

重要地是，从处理的公牛犊获得的肉不包含重组生长激素。

尽管已经依照很多实施方案具体显示并描述了本发明，本领域技术人员应理解可以对本文公开的各种实施方案在形式和细节上做出变化而不脱离本发明的精神和范围，本文公开的各种实施方案不是旨在用作对权利要求范围的限制。