用于快速筛选和鉴定有效shRNA的载体及其筛选和鉴定方法

摘要

本发明提供了一种快速筛选和鉴定有效shRNA真核表达载体，将如下结构构建至同一个真核表达载体上：1)由polIII型启动子调控的shRNA表达框结构，即polIII型启动子+shRNA插入位点；2)由CMV启动子调控的荧光蛋白表达框，并在荧光蛋白基因后面紧跟一个多克隆位点(MCS)；3)由SV40启动子调控的荧光蛋白表达框，该荧光蛋白的荧光颜色与第2)中的荧光蛋白的荧光颜色不同。本发明还提供了用上述载体筛选或验证有效shRNA的方案，利用此载体和方法筛选和鉴定有效shRNA，不需做RT-PCR或Western-blot检测，快速、简单、方便、成本低廉，特别适合于从多个预先设计的备选shRNA中筛选有效shRNA。

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速筛选和鉴定有效shRNA的方法，包括用于筛选和鉴定有效shRNA的真核表达载体的构建及其应用。

背景技术

RNA干扰(RNA interference)是一种由双链RNA诱发的基因沉默(gene silencing)。在此过程中，与双链RNA有同源序列的信使RNA(mRNA)被降解，从而抑制了该基因的表达。RNA干扰技术在探查基因功能和治疗人类疾病方面有广阔的应用前景。科学界普遍认为，通过利用RNAi，操纵细胞的核糖核酸(遗传信使)，干扰或压制目标基因，以防止那些会导致疾病的蛋白质形成，有可能产生出前景不错的治疗药物，用于治疗包括癌症、失明和艾滋病在内的疾病。

目前，人们已经成功地使用发夹状RNA或以质粒DNA或病毒为载体在细胞内生成小干扰RNA样转录物，来特异性地抑制外源性或内源性基因在哺乳类动物或人细胞内的表达。用质粒DNA或病毒为载体可在细胞内长时间、稳定地生成小干扰RNA。此类研究将有助于把RNA干扰技术用于治疗人类疾病。

RNA干扰研究及应用的一个前提是筛选到有效的shRNA，然后将此有效shRNA构建至真核表达载体或病毒表达载体，进行后续研究和应用。

针对某一个靶基因，根据shRNA靶序列设计原则，一般来说会有多个候选的shRNA序列。这些利用各种设计软件设计出的shRNA序列，其仅仅在理论上可能对靶基因有干扰效果，但是其实际的干扰有效性还需要进行实践筛选和验证。

目前筛选和验证有效shRNA，往往需要利用RT-PCR或Western-blot的方法，费时、费力，特别是待选shRNA数量较多时，会大大增加工作量和实验成本。

发明内容

为克服上述筛选和验证有效shRNA时的缺陷，实现快速、简便地筛选和验证有效shRNA，本发明提供了一种技术方案为：用于快速筛选和鉴定有效shRNA的真核表达载体，将如下结构构建至同一个真核表达载体上：：1)由polIII型启动子调控的shRNA表达框结构，即polIII型启动子+shRNA插入位点，用于插入待筛选和鉴定的shRNA；2)由CMV启动子调控的荧光蛋白表达框，在荧光蛋白基因后面紧跟一个多克隆位点(MCS)，用于在其中插入与待筛选和鉴定shRNA相对应的靶序列片段。3)由SV40启动子调控的荧光蛋白表达框，该荧光蛋白的荧光颜色与第2)中的荧光蛋白的荧光颜色不同。

所说的由CMV启动子调控的荧光蛋白可为绿色荧光蛋白(EGFP)。

上述载体结构中还可以包括由SV40启动子调控的荧光蛋白表达框。所说的红色荧光蛋白可以为(RFP)。

所述polIII型启动子为hU6、mU6、hH1或h7SK启动子；所述载体还包括Kan或者Amp抗性筛选标记。

根据上述技术方案，本发明还提供了一个真核表达载体，序列如SEQ NO 1所示。

另外，本发明还提供了一种快速筛选和鉴定有效shRNA的技术方案，其特征在于，该方法为：将待筛选和鉴定shRNA和与其对应的靶序列片段插入上述的真核表达载体，其中，shRNA靶序列片段插入到荧光蛋白基因后的多克隆位点，再将得到的载体转染至细胞中，与转染了未插入shRNA片段的空白载体的细胞相比，荧光明显减弱，则待筛选shRNA为有效shRNA。

所述细胞为易转染、易培养的细胞，优选293细胞。

其中shRNA的结构包括sense、loop、antisense和5T或6T终止信号。

待筛选和鉴定shRNA相对应的靶序列片段，可以以该条shRNA所针对的欲干扰基因上的靶位点序列为中心，然后各向两侧延伸15～25个碱基，以这样一条片段(总长度大约为49～69bp)作为与待筛选和鉴定shRNA相对应的靶序列片段。简单举例说明：如果shRNA针对的是CCCC，那么它的结构差不多是CCCC-loop-GGGG-5T或6T终止信号，那么相对应的靶序列片段就是CCCC。即，所谓的靶序列片段，就是某个shRNA针对的那一段序列，也就是整个shRNA结构中的sense序列。本领域普通技术人员能够知道”靶序列片段”如何确定。

现有技术中，shRNA表达后，经Dicer酶切成siRNA，siRNA通过序列互补与具有同源序列的mRNA结合，导致mRNA的降解。根据这一原理，本发明的技术方案将shRNA针对的靶序列单独合成出来，并将其加至荧光蛋白基因的后面，如果该shRNA有效，则整条包含荧光蛋白基因的mRNA都会被降解掉，从而导致荧光强度减弱。通过观察、比较对照组和shRNA干扰组细胞之间的荧光强度差异，就可判断该shRNA的有效性，同时根据荧光强度对比还可以判定大致的干扰效率。

载体中还包括一个由SV40启动子调控的荧光蛋白表达框，可通过观察荧光强度来判断质粒转染效率。

利用本发明提供的真核表达载体及相应方法筛选和鉴定有效shRNA，不需做RT-PCR或Western-blot检测，快速、简单、方便、成本低廉，特别适合于从多个预先设计的备选shRNA中筛选有效shRNA。

附图说明

图1是利用本发明技术方案提供的方法构建的筛选载体pYrbio-shRNA-screening的质粒图谱；

图2是转染了pYrbio-shRNA-screening-GAPDH-1(A)、pYrbio-shRNA-screening-GAPDH-2(B)、pYrbio-shRNA-screening(C)的各组293细胞中红色荧光照片；

图3是转染了pYrbio-shRNA-screening-GAPDH-1(A)、pYrbio-shRNA-screening-GAPDH-2(B)、pYrbio-shRNA-screening(C)的各组293细胞中绿色荧光照片；

图4是空白组、对照组、干扰组293细胞中GAPDH基因的表达情况(Western-blot)，其中第1泳道为空白293细胞，第2泳道为转染了pYrbio-hU6-EGFP-shRNA的对照组293细胞，第3泳道为转染了pYrbio-hU6-EGFP-GAPDH-1的干扰组293细胞，第4泳道为转染了pYrbio-hU6-EGFP-GAPDH-2的干扰组293细胞；

图5是转染了pYrbio-shRNA-screening-3(A)、pYrbio-shRNA-screening(B)的各组293细胞中红色荧光照片；

图6是转染了pYrbio-shRNA-screening-3(A)、pYrbio-shRNA-screening(B)的各组293细胞中绿色荧光照片；

图7商业化载体pYrbio-hU6-EGFP-shRNA的质粒图谱。

具体实施方式

实施例1

筛选载体pYrbio-shRNA-screening的构建

方法：以商业化载体pYrbio-hU6-EGFP-shRNA(长沙赢润生物技术有限公司生产，如SEQ ID2所示)为骨架，通过一系列改构，构建筛选载体pYrbio-shRNA-screening。

(1)从pCDNA3.1(+)上PCR扩增SV40promoter片段，两端加上HindIII和BamHI酶切位点。以HindIII和BamHI为亚克隆位点，将SV40promoter片段亚克隆至pYrbio-hU6-EGFP-shRNA上。构建好的载体命名为pYrbio-shRNA-screening-pre1。

(2)从pDsred2-C1上PCR扩增RFP片段，两端加上BamHI和EcoRI酶切位点。以BamHI和EcoRI为亚克隆位点，将RFP片段亚克隆至pYrbio-shRNA-screening-pre1上。构建好的载体命名为pYrbio-shRNA-screening-pre2。

(3)从pCDNA3.1(+)上PCR扩增BGH PolyA片段，两端加上EcoRI和SalI酶切位点。以EcoRI和SalI为亚克隆位点，将BGH PolyA片段亚克隆至pYrbio-shRNA-screening-pre2上。构建好的载体即为pYrbio-shRNA-screening。

结果：筛选载体pYrbio-shRNA-screening构建成功，图一为pYrbio-shRNA-screening质粒图谱，序列表中为该载体完整序列。

其中，shRNA Insertion Site前后各有一个BsaI酶切位点，用来插入待筛选的shRNA片段。shRNA Target Fragment Insertion Site处有BglII、NotI、AscI、XhoI等酶切位点，用来插入与待筛选shRNA序列相对应的shRNA靶序列片段。

结论：按照此方法可成功构建pYrbio-shRNA-screening筛选载体。

实施例2

针对人GAPDH基因的有效shRNA的筛选

方法：按照本发明提供的方法构建两个针对人GAPDH基因的shRNA真核表达载体，分别命名为pYrbio-shRNA-screening-GAPDH-1和pYrbio-shRNA-screening-GAPDH-2。pYrbio-shRNA-screening-GAPDH-1的shRNA表达框中插入GAPDH-shRNA1，EGFP后面的MCS中插入相应的shRNA1靶序列片段；pYrbio-shRNA-screening-GAPDH-2的shRNA表达框中插入GAPDH-shRNA2，EGFP后面的MCS中插入相应的shRNA2靶序列片段。以未插入任何shRNA和shRNA靶序列片段的空白载体pYrbio-shRNA-screening作为对照。

GAPDH-shRNA1：CCAGGTGGTCTCCTCTGACTT

shRNA1靶序列片段：

GGGCTACACTGAGCACCAGGTGGTCTCCTCTGACTTCAACAGCGACACCCA

GAPDH-shRNA2：TCCGGGAAACTGTGGCGTGAT

shRNA2靶序列片段：

ACTGTGGATGGCCCCTCCGGGAAACTGTGGCGTGATGGCCGCGGGGCTCTC

将上述三种质粒载体分别转染293细胞，48小时后于荧光显微镜下观察荧光。

结果：三种质粒载体转染至293细胞，48小时后于荧光显微镜下均可观察到明显的红色荧光，显示转染效率很高。图2是各组细胞中的红色荧光照片。

比较三组细胞的绿色荧光强度，可以发现转染了pYrbio-shRNA-screening-GAPDH-1和pYrbio-shRNA-screening-GAPDH-2的两组细胞的绿色荧光强度均明显弱于转染了空白对照载体pYrbio-shRNA-screening的细胞，显示两个shRNA均为有效shRNA，且其干扰效率较高。图3是各组细胞中的绿色荧光照片。

结论：利用本发明提供的方法构建的针对人GAPDH基因的shRNA真核表达载体能够在293细胞中正常工作，表达出大量针对靶基因GAPDH的shRNA，并进而降解了带有shRNA靶序列片段的EGFP mRNA，从而有效的抑制了EGFP基因的表达，导致观察到的绿色荧光变弱。说明本发明提供的快速筛选和鉴定有效shRNA的方法是可行的。

实施例3

筛选出的shRNA的干扰有效性验证

方法：以实施例1中筛选获得的两条针对人GAPDH基因的shRNA为基础，以商业化载体pYrbio-hU6-EGFP-shRNA为骨架，构建两个新的shRNA真核表达载体，分别命名为pYrbio-hU6-EGFP-GAPDH-1和pYrbio-hU6-EGFP-GAPDH-2。

其中pYrbio-hU6-EGFP-GAPDH-1中插入GAPDH shRNA1，pYrbio-hU6-EGFP-GAPDH-2中插入GAPDH shRNA2。以未插入任何shRNA的空白载体pYrbio-hU6-EGFP-shRNA作为对照。

GAPDH-shRNA1靶序列：CCAGGTGGTCTCCTCTGACTT

GAPDH-shRNA2靶序列：TCCGGGAAACTGTGGCGTGAT

将上述三个载体分别转染入293细胞中，编为对照组、shRNA干扰组1、shRNA干扰组2，同时以未转入任何质粒的293细胞作为空白组。48小时后收集各组细胞，提取蛋白质，进行Western-blot检测。

结果：Western-blot检测显示，利用本发明提供的方法筛选出的针对人GAPDH的两条shRNA，确实对人GAPDH基因的表达具有很好的抑制作用。图4是Western-blot检测结果。

结论：利用本发明提供的方法筛选出的有效shRNA，其干扰有效性被Western-blot实验进一步的确定，说明本发明提供的快速筛选和鉴定有效shRNA的方法是行之有效的。

实施例4

快速筛选和鉴定有效shRNA的方法的特异性研究

方法：按照本发明提供的方法构建一个shRNA真核表达载体pYrbio-shRNA-screening-3，shRNA表达框中依然插入GAPDH-shRNA1，而EGFP后面的MCS中插入以实施例1中的GAPDH shRNA1靶序列片段为基础、但是其碱基排列顺序都被打乱、与shRNA1序列不互补的一段序列。以未插入任何shRNA和shRNA靶序列片段的空白载体pYrbio-shRNA-screening作为对照。

GAPDH-shRNA1：CCAGGTGGTCTCCTCTGACTT

序列被打乱的靶序列片段：

GGGCTACACTGAGCATCTTCCTTGACGTCGGTGCCACAACAGCGACACCCA

将上述两种质粒载体分别转染293细胞，48小时后于荧光显微镜下观察荧光。

结果：两种质粒载体转染至293细胞，48小时后于荧光显微镜下均可观察到明显的红色荧光，显示转染效率很高。图5是各组细胞中的红色荧光照片。

比较两组细胞的绿色荧光强度，可以发现shRNA干扰组和对照组细胞基本一致，显示shRNA真核表达载体pYrbio-shRNA-screening-3表达出的shRNA没有抑制EGFP基因的表达。图6是各组细胞中的绿色荧光照片。

结论：此实施例中构建的shRNA筛选载体pYrbio-shRNA-screening-3，shRNA表达框中插入的shRNA和EGFP后面MCS中插入的靶序列片段并不互补，在此情况下，表达出的shRNA没有抑制EGFP基因的表达，shRNA干扰组和对照组细胞中的绿色荧光强度基本一致，说明本发明提供的快速筛选和鉴定有效shRNA的方法具有良好的特异性。

序列表

<110>长沙赢润生物技术有限公司

<120>用于快速筛选和鉴定有效shRNA的载体及其筛选和鉴定方法

<130>PLH09817

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>6110

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

tagttattag ggcccttaaa ggaaccaatt cagtcgataa ctataacggt cctaaggtag     60

cgactagtga tacattgatg agtttggaca aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg    120

ctttatttgt gaaatttgtg atgctattgc tttatttgta accattataa gctgcaataa    180

acaagttaac aacaacaatt gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga    240

ggttttttaa agcaagtaaa acctctacaa atgtggtatg gctgattatg atcagttatc    300

tagatccggt ggatctcgag aaggcgcgcc ctattcagtt actgcagagc ggccgcgaga    360

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gggtgctcag gtagtggttg tcgggcagca gcacggggcc gtcgccgatg ggggtgttct    540

gctggtagtg gtcggcgagc tgcacgctgc cgtcctcgat gttgtggcgg atcttgaagt    600

tcaccttgat gccgttcttc tgcttgtcgg ccatgatata gacgttgtgg ctgttgtagt    660

tgtactccag cttgtgcccc aggatgttgc cgtcctcctt gaagtcgatg cccttcagct    720

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cgtcgtcctt gaagaagatg gtgcgctcct ggacgtagcc ttcgggcatg gcggacttga    840

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<210>2

<211>5847

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

tagttattag ggccccaaat aatgatttta ttttgactga tagtgacctg ttcgttgcaa      60

caaattgatg agcaatgctt ttttataatg ccaactttgt acaaaaaagc aggctttaaa     120

ggaaccaatt cagtcgataa ctataacggt cctaaggtag cgactagtga tacattgatg     180

agtttggaca aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg ctttatttgt gaaatttgtg     240

atgctattgc tttatttgta accattataa gctgcaataa acaagttaac aacaacaatt     300

gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga ggttttttaa agcaagtaaa     360

acctctacaa atgtggtatg gctgattatg atcagttatc tagatccggt ggatctcgag     420

aaggcgcgcc ctattcagtt actgcagagc ggccgcgaga tctgagtccg gacttgtaca     480

gctcgtccat gccgagagtg atcccggcgg cggtcacgaa ctccagcagg accatgtgat     540

cgcgcttctc gttggggtct ttgctcaggg cggactgggt gctcaggtag tggttgtcgg     600

gcagcagcac ggggccgtcg ccgatggggg tgttctgctg gtagtggtcg gcgagctgca     660

cgctgccgtc ctcgatgttg tggcggatct tgaagttcac cttgatgccg ttcttctgct     720

tgtcggccat gatatagacg ttgtggctgt tgtagttgta ctccagcttg tgccccagga     780

tgttgccgtc ctccttgaag tcgatgccct tcagctcgat gcggttcacc agggtgtcgc     840

cctcgaactt cacctcggcg cgggtcttgt agttgccgtc gtccttgaag aagatggtgc     900

gctcctggac gtagccttcg ggcatggcgg acttgaagaa gtcgtgctgc ttcatgtggt     960

cggggtagcg gctgaagcac tgcacgccgt aggtcagggt ggtcacgagg gtgggccagg    1020

gcacgggcag cttgccggtg gtgcagatga acttcagggt cagcttgccg taggtggcat    1080

cgccctcgcc ctcgccggac acgctgaact tgtggccgtt tacgtcgccg tccagctcga    1140

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ctgccaagta ggaaagtccc ataaggtcat gtactgggca taatgccagg cgggccattt    1560

accgtcattg acgtcaatag ggggcgtact tggcatatga tacacttgat gtactgccaa    1620

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tgaccccgta attgattact attaataact acgcgtatcc aaggtcgggc aggaagaggg    1860

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tgcgtgccga acgctggaaa gcggaaaatc aggaagggat ggctgaggtc gcccggttta    2400

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gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagtc ctgaggcgga    3360

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catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta    3660

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atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt    4140

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gtggataacc gtattaccgc catgcat                                        5847