用于组织或全血EGFR基因突变检测的特异性引物

摘要

本发明公开了一组用于组织或全血EGFR基因突变检测的特异性扩增引物，其引物组序列为如SEQ ID No.1-4所示的一组或二组；以及一种与所述引物配合使用的探针，如SEQ ID No.5-7所示的一种或几种；以及本发明引物、探针以及相关试剂组装成的试剂盒；本发明设计的引物及探针，特异性好，用于荧光PCR检测灵敏度高。利用其或含有其的试剂盒采用RealTime PCR检测肺癌患者EGFR基因突变，建立了一种新的肿瘤标志物对肺癌病人进行筛查，可以从肺癌患者中筛选出最适治疗对象，进行针对性治疗，指导临床用药。

说明书

技术领域

本发明涉及一种扩增引物及检测试剂盒，特别是涉及一种用于EGFR基因突变检测的特异性扩增引物及检测试剂盒。

背景技术

表皮生长因子(EGF)是由53个氨基酸构成的活性肽，是一种能刺激表皮细胞增生、角化的物质，它通过与EGFR(表皮生长因子受体)结合形成EGF-EGFR复合物，引起一系列的生物效应，除能对多种组织来源的细胞增殖有明显的促进作用外，还可刺激肿瘤的生长和发展，包括促进增值、血管生成、浸润、转移和抑制凋亡，已有资料显示人类多种肿瘤存在EGF、EGFR的过度的表达。

EGFR在NSCLC瘤组织中表达上调，目前已开发出了许多针对EGFR TK的抑制剂，如吉非替尼竞争结合到EGFR TK的ATP结合位点上，以抑制受体的活化。吉非替尼二线或三线治疗NSCLC时，有效率为9％～19％。II期临床试验显示，吉非替尼疗效存在较大的差异，日本患者缓解率明显高于欧美患者(27.5％:VS:10.4％)；女性、不吸烟和腺癌患者疗效优于男性、吸烟和非腺癌患者。临床前与临床II期研究结果均提示，NSCLC肿瘤组织的EGFR表达水平与吉非替尼的疗效无关。而EGFR TK基因的突变与NSCLC对该药的敏感性相关，该药应用后获得缓解的肺癌组织多存在EGFR基因的突变，无突变者则对它不起反应。最近研究发现，吉非替尼的疗效与EGFR TK基因的突变相关。检测NSCLC肿瘤组织中EGFR基因突变，有助于筛选出那些对EGFR TK抑制剂敏感的患者，指导临床用药。

基因测序是检测基因突变的标准与可靠的方法，但测序技术的要求高、时间长，结果判读耗时费力，难以从实验室普及到临床。近年来，PCR-单链构象多态性(SSCP)分析和实时PCR技术也用来检测基因突变。与基因测序相比，PCR-SSCP准确性好，敏感性高，但电泳时间长(14h)，需要进行银染观察，难以用于临床上大样本的筛查。而TaqMan-MGB实时PCR法，可以在同一试管完成DNA扩增和检测，避免了交叉污染，操作简便、快速，数小时内即可出结果。MGB(Minor Groove Binder，小型凹槽结合物)，可结合在DNA双螺旋的小沟里，从而起到稳定DNA双螺旋的作用，是在普通的TaqMan探针基础上发展起来的一项新技术，TaqMan探针的5’端通常标记FAM、HEX等荧光染料，3’端标记淬灭染料如TAMRA。引物延伸时，Taq酶的5’-3’外切酶活性作用将探针的发光基团水解下来，解除了淬灭染料的抑制后发出荧光，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。TaqMan探针检测基因突变主要取决于荧光探针的正确杂交，实时探针在退火和延伸阶段时，探针与模板结合，推荐的Tm值为65℃～67℃，通常探针长度在25～45bp之间。MGB技术利用了MGB与双链DNA的小沟的高度亲和力，增加寡核苷酸探针结合到单链模板DNA上的稳定性，提高探针Tm值(使15mer提高18℃)，缩短了探针设计长度，增加配对与非配对时Tm上的差异，改善探针的特异性与敏感性，对单核苷酸突变检测更为有效。MGB探针已成功地用来检测单核苷酸多态性，检测结果与标准方法完全一致，准确率高达100％。TaqMan-MGB探针具有荧光本底低、分辨率更高、杂交特异性更强、重现性好、探针长度缩短等优点，不仅解决了PCR污染问题，而且自动化程度高，能够实时监控，不存在非特异性扩增现象，已成为目前国际上公认的核酸分子定性、定量检测方法。Emdo K等使用TaqMan荧光实时定量PCR法检测肺癌组织EGFR基因突变，检测结果与基因测序法的符合率达到了98.9％(93/94)。张海芳等使用荧光实时定量PCR法检测肺癌组织EGFR基因突变，与直接测序法比较其敏感度符合率为100％，特异度符合率为95％(20/21)。周彩存等利用TaqMan-MGB探针荧光实时聚合酶链反应快速检测非小细胞肺癌组织EGFR基因突变，并与测序结果比较，发现TaqMan-MGB探针实时PCR检测EGFR基因突变的敏感性和特异性均为100％，假阳性率与假阴性率均为0。综合上述文献，荧光实时定量PCR法有着与直接测序法一样的敏感度和特异度，且检测过程更加简单、费用更低、检测所需时间更短、结果判读更直观。因此，我们建立了TaqMan-MGB探针荧光实时PCR检测EGFR基因突变的方法，进一步在非小细胞肺癌患者中筛选出存在EGFR基因突变的患者进行针对性治疗。

细胞水平和回顾性临床研究结果均提示，EGFR基因19和21外显子的突变或缺失与EGFR TK抑制剂疗效密切相关。19外显子阅读框内多核苷酸的缺失，位于EGFR TK活化区域，从而引起氨基酸序列(亮氨酸-精氨酸-谷氨酸-丙氨酸)的缺失。21外显子第2573核苷酸的点突变位于TK活化环高度保守DFG(密码子855-857)附近，使858位上亮氨基酸被精氨酸所替代(L858R)。

目前，EGFR基因突变的检测主要取材于组织。对于不适合手术的中晚期肺癌患者，肿瘤组织获取困难，尽管可经纤维支气管镜活检组织，但对患者的创伤较大，也不易得到患者的配合。因此，采用组织标本检测EGFR基因突变很难用于大面积人群的筛查和病情进展的随访观察。临床迫切需要建立简便有效的监测指标，为临床治疗提供确凿证据。

外周血样本具有取材简便，是临床上进行病情监测的首选标本来源。但由于血行转移前外周血中循环癌细胞的含量很低，常规方法不易检测到外周血中癌细胞EGFR基因突变，从而阻碍了外周血中EGFR基因突变检测的临床开展。近来，随着核酸扩增技术的不断优化，国外开始报道采用外周血血浆/血清标本检测DNA基因突变，灵敏度和特异性与组织标本的结果符合率较高，这极大促进了EGFR基因突变检测方法的研究进展。

众所周知，由于肿瘤组织细胞坏死、肿瘤细胞溶解，或者循环肿瘤细胞释放DNA，癌症患者血清或血浆中DNA含量高于正常人，尤其是转移性癌症患者血清中DNA水平明显增高。既往研究显示，外周血检测目的DNA在肿瘤早期诊断、疗效评价和随访中监测复发具有极大潜力。

外周血血浆/血清DNA在癌症诊断中的作用近几十年得到了逐步的认识。1977年首次发现肿瘤患者外周血DNA明显升高，但由于正常人血浆/血清也存在微量的游离DNA，这些循环DNA作为分子标志物能否用于肿瘤的特异性诊断，研究方法不同，得出的结论也不尽相同。直到1994年Vasioukhin和Sorenson等在肿瘤组织和血浆DNA中同时检测到相同的基因突变类型，证实这些循环DNA中的确部分来源于肿瘤，检测循环DNA的基因突变对肿瘤诊断更有意义。进一步通过对头颈部肿瘤、小细胞肺癌、大肠癌、前列腺癌和血液恶性疾病的研究，发现检测外周循环游离DNA中肿瘤相关基因的DNA甲基化、等位基因杂合子丢失及点突变等有可能成为肿瘤早期诊断、疗效观察的一种有效的分子标志物。

在肿瘤化疗中，通过检测循环肿瘤相关DNA的突变情况，可以观察患者的药物反应性、病情进展、存活期等，是一种方便的随访监测指标。在酪氨酸激酶抑制剂的药效研究中，发现与NSCLC相关的EGFR基因突变有两种最常见的形式：19外显子15bp的编码序列缺失(del E746-A750)和21外显子的点突变(L858R)。这两种突变约占EGFR所有突变形式的90％以上。2007年，Kimura H等报道了配对设计的肺癌组织和血清标本经直接测序比较，二者检测结果符合率达到92.9％(39/42)。因此，用外周血检测EGFR基因突变情况并评价对EGFR-TK抑制剂敏感性是可行的，值得进一步研究。

因而，本发明旨在应用RealTime PCR结合小沟结合物(TaqMan-MGB)探针检测肺癌患者组织及全血EGFR基因突变，从而建立一种新的肿瘤标志物对肺癌病人进行筛查，为肺癌的诊断、治疗及预后判断提供可靠的方法，同时评价其与临床诊断肺癌常用的四项肿瘤标志物联合检测的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于组织或全血EGFR基因突变检测的特异性扩增引物及检测试剂盒。

文献显示约90％的EGFR基因突变热点集中在19，20和21外显子上。与NSCLC相关的EGFR基因突变有两种最常见的形式：19外显子15bp的编码序列缺失(del E746-A750)和21外显子的点突变(L858R)。这两种突变约占EGFR所有突变形式的90％以上。因此，我们根据EGFR的主要突变型设计了特异性引物用于实时荧光聚合酶链反应(RealTime PCR)进行检测。

一组用于EGFR基因突变检测的特异性扩增引物，所述引物组序列为：

L858R：

正向引物：5’-CCG CAG CAT GTC AAG ATC AC-3’，如SEQ ID No.1所示；

反向引物：5’-CCT TAC TTT GCC TCC TTC TGC AT-3’，如SEQ IDNo.2所示；

和/或

del E746-A750：

正向引物：5’-CCA GAA GGT GAG AAA GTT AAA ATT CC-3’，

如SEQ ID No.3所示；

反向引物：5’-GGA TTT CCT TGT TGG CTT TCG-3’，如SEQ ID No.4所示。

本发明还提供一种与所述引物配合使用的探针，所述探针包含以下探针序列中的一种或多种：

L858R WT Probe：TTT GGC CAG CCC AA，如SEQ ID No.5所示；L858R Mut Probe：TTG GCC CGC CCA A，如SEQ ID No.6所示；del E746-A750Mut Probe：TCG CTA TCA AAA CAT，如SEQ ID No.7所示。

所述探针序列一端标记有报告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料。

本发明的探针，其中报告荧光染料选自FAM/HEX/TET/JOE/VIC/FITC/CY3/CY5中的一种，所述淬灭荧光染料选自TRAMA/ROX/DABCY1/BHQ 1/BHQ2/MGBNFQ中的一种。

本发明的探针，优选为以下一种或几种：L858R WT Probe：6FAM-TTT GGC CAG CCC AA-MGBNFQ；L858R Mut Probe：VIC-TTG GGC CGC CCA A-MGBNFQ；del E746-A750Mut Probe：TET-TCG CTA TCA AAA CAT-MGBNFQ。

进一步地，可以将本发明引物、探针以及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用，本发明还提供含有上述引物的试剂盒。还可以包括上述的探针，以及PCR试剂、阳性对照和阴性对照。

本发明提供的特异性引物和探针用于RealTime PCR时，以血液基因组DNA为模板，进行RealTime PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。

本发明设计的引物及探针特异性好，用于荧光PCR检测灵敏度高。利用其或含有其的试剂盒采用RealTime PCR检测肺癌患者EGFR基因突变，建立了一种新的肿瘤标志物对肺癌病人进行筛查，可以从肺癌患者中筛选出最适治疗对象，进行针对性治疗，指导临床用药。

附图说明

图1为EGFR基因突变阳性对照；

图2为Realtime PCR阴性对照；

图3为实施例1一个EGFR基因突变样本Realtime PCR曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：特异性扩增引物及其用于全血EGFR基因突变检测

一、标本来源及临床资料

收集某医院2008年7月30日至9月3日肺癌患者全血EDTA抗凝标本37份。年龄29-78岁。男性患者24例，女性患者13例。病理分型见表1：

表1临床标本资料

二、DNA的提取

(一)试剂盒

TIANGEN TIANamp Blood DNA Kit血液基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)DP318

(二)操作步骤

1.取全血200μL，加入500μL的细胞裂解液CL，颠倒混匀，11,500rpm×g离心1分钟，吸去上清，留下细胞核沉淀

2.加入20μL蛋白酶K溶液，混匀。

3.加200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10分钟，其间颠倒混匀数次。

4.加200μL无水乙醇，充分颠倒混匀。

5.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱CB3放入收集管中)，13,400rpm×g离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

6.向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前已加入无水乙醇)，13,400rpm×g离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7.向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW(使用前已加入无水乙醇)，13,400rpm×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8.向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW，13,400rpm×g离心30秒，倒掉收集管中的废液。

9.将吸附柱CB3放回收集管中，13,400rpm×g离心2分钟，倒掉废液。

10.将吸附柱CB3置于室温放置20分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

11.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加150μL

12.洗脱缓冲液TB，室温放置5分钟，13,400rpm×g离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

三、EcoRI酶切

反应体系如下：

10×NEB 2μL

DNA 15μL

内切酶0.5μL

灭菌双蒸水2.5μL

37度水浴1小时

四、电泳

DNA 10μL

1×loading buffer 2μL

80v 90min

五、RealTime PCR

(一)反应体系

1.KOD Plus Mix

10×PCR Buffer 5μL

MgSO₄(25mM)2μL

dNTP(2mM)5μL

KOD plus 1μL

2.Primer(10μM)2μL×2

L858R：

正向引物：5’-CCG CAG CAT GTC AAG ATC AC-3’，如SEQ ID No.1所示；

反向引物：5’-CCT TAC TTT GCC TCC TTC TGC AT-3’，如SEQ IDNo.2所示；

和

del E746-A750：

正向引物：5’-CCA GAA GGT GAG AAA GTT AAA ATT CC-3’，

如SEQ ID No.3所示；

反向引物：5’-GGA TTT CCT TGT TGG CTT TCG-3’，如SEQ ID No.4所示。

3.Probes(1μM)2.25μL×2

L858R WT Probe：6FAM-TTT GGC CAG CCC AA-MGBNFQ；

L858R Mut Probe：VIC-TTG GGC CGC CCA A-MGBNFQ；

del E746-A750Mut Probe：TET-TCG CTA TCA AAA CAT-MGBNFQ。

将反应体系在eppondoff管中预混后再加入各PCR孔。

(二)DNA

模板：已提取基因组DNA的OD260/OD280在1.60～2.10之间，表明已提取基因组DNA较纯，OD260值在10以上的样本添加基因组DNA2μL作为模板，OD260值在10以下的样本添加基因组DNA4μL作为模板。经测序证实为EGFR基因突变的DNA为阳性对照，不加模板DNA为阴性对照。

(三)PCR程序

在荧光定量PCR仪上运行50℃2min，95℃2min，然后再运行40个循环(具体95℃15s，60℃1min)，反应完毕进行结果分析。

Stage 1   stage 2   stage3

Reps:1    Reps:1    Reps:40

50.0      95.0      95.0    60.0

2:00      2:00      0:15    1:00

六、结果

1、EGFR基因突变情况荧光实时定量PCR结果呈S型曲线即判断为EGFR基因突变，见图1、图2、图3。在37例全血样本中，共检测到EGFR突变20例，肺癌中EGFR总突变率为54.1％，在非小细胞肺癌中EGFR突变的突变率为55.6％，而小细胞肺癌中EGFR突变率为0％。

用SPSS 11.5软件包处理数据，采用卡方检验分析EGFR基因检测在性别、年龄、化疗状况间的关系，见表2

表2EGFR突变与患者病理型别关系

  分类  突变例数/分类总例数  突变例数/总例数  未分型肺癌  12/17(70.6％)  12/21(57.1％)  腺癌  4/5(80％)  4/21(19.0％)  鳞癌  2/10(20％)  2/21(9.52％)  腺鳞癌  0/1  0/21  小细胞肺癌  0/1  0/21  肿物  1/2(50％)  1/21(4.76％)  瘤  2/4(50％)  2/21(9.52％)  总计  21/37(56.8％)

从以上表中可以看出，肺癌患者的EGFR基因突变发生率占病例总数的56.8％(21/37)；EGFR基因突变以腺型为主，其突变发生率占该类型病例数的80％及突变总数的19.0％；女性患者中EGFR基因突变检出率高于男性患者；EGFR基因突变与患者年龄、是否化疗无显著性差异；小细胞肺癌不表达EGFR；通过EGFR基因检测，可以从肺癌患者中筛选出最适治疗对象，进行针对性治疗，指导临床用药。也可以对健康体检体检病人进行筛查，提早发现提早治疗。

2、全血EGFR突变与患者临床特征的关系分析

研究结果显示，女性、不吸烟和肺腺癌患者EGFR基因突变率显著高于男性、吸烟和非腺癌患者，其中以女性不吸烟腺癌患者突变率最高(6/7，85.7％)。此外，EGFR基因突变与患者年龄、疾病的TNM分期、化疗与否及淋巴结转移情况等，均无明显的相关性。见表3。

表3全血EGFR突变与患者临床特征的关系

3、肿瘤标志物与EGFR突变联合检测

TaqMan-MGB荧光实时PCR检测第19外显子5个缺失区域和21外显子L858R点突变假阴性与假阳性率均为0，从表4可以看出EGFR突变诊断肺癌的敏感度和特异度均优于SCC、NSE、CEA、CYFRA21-1四项肿瘤标志物，且EGFR突变检测对腺癌诊断的敏感度高于其他四项肿瘤标志物，但SCC对肺癌及其不同不同病理类型肺癌的诊断敏感度均较低，约登指数为0.1，显示其临床应用价值较小。EGFR突变与其他肿瘤标志物联合检测可以明显提高诊断的敏感度，在肺癌诊断中NSE+CEA+CYFRA21-1+EGFR突变组合敏感度达到了86.5％(32/37)，其特异性较好，约登指数为0.8；EGFR突变与其他肿瘤标志物联合检测还可以提高非小细胞肺癌中不同病理类型诊断的敏感度，CEA+EGFR突变二项联合检测诊断腺癌的敏感度就高达95％(19/20)，NSE+CEA+CYFRA21-1+EGFR突变联合检测诊断鳞癌的敏感度也达到了86.7％(13/15)。

表4血清标志物与EGFR突变联合检测对肺癌诊断的评价

实施例2：特异性扩增引物及其用于病理组织EGFR基因突变检测

除样本来源不同外，其余均同实施例1。共选取了32例病理组织样本，其中共检测到EGFR突变25例，突变率为78.1％；从病理组织EGFR突变与患者临床特征的关系分析结果显示，女性肺腺癌患者EGFR基因突变率显著高于男性非腺癌患者，其中以女性腺癌患者突变率最高，男性鳞癌患者最低。此外，EGFR基因突变与患者年龄无明显的相关性。

本发明设计针对19外显子5个缺失区域的MGB探针，针对21外显子L858R点突变的MGB探针，对肿瘤组织和全血EGFR基因进行检测，发现他们诊断肺癌的敏感性为54.1％，特异性为100％，假阳性率与假阴性率均为0。提示该项技术可以适用于常规临床样本的检测，以筛查病例，指导临床EGFR-TK抑制剂的治疗。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>北京嘉和美康医用设备有限公司

<120>用于组织或全血EGFR基因突变检测的特异性引物

<130>KHP09112159.7

<160>7

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ccgcagcatg tcaagatcac                                                            20

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ccttactttg cctccttctg cat                                                        23

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ccagaaggtg agaaagttaa aattcc                                                     26

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ggatttcctt gttggctttc g                                                          21

<210>5

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

tttggccagc ccaa                                                                  14

<210>6

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

ttggcccgcc caa                                                                   13

<210>7

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

tcgctatcaa aacat                                                                 15